洪春霖，洪敏俐，陳慧暖，柯庚申，李風(fēng)森

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬漳洲中醫(yī)院，福建漳州363000；2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院國家中醫(yī)臨床研究基地，新疆烏魯木齊830000）

愈肺寧方干預(yù)COPD外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-17A、TGF-β1和IL-6的作用

洪春霖1，洪敏俐1，陳慧暖1，柯庚申1，李風(fēng)森2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬漳洲中醫(yī)院，福建漳州363000；2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院國家中醫(yī)臨床研究基地，新疆烏魯木齊830000）

目的探討愈肺寧方對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）分泌白介素-17A（IL-17A）、轉(zhuǎn)移生長因子β1（TGF-β1）和IL-6的影響。方法收集2012年12月—2014年6月在福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬漳州中醫(yī)院就診的COPD穩(wěn)定期患者（COPD組）55例和健康志愿者（健康對照組）30例，采集靜脈血，分離PBMCs，分別加入植物凝集素（PHA）以及PHA和不同劑量愈肺寧浸出液（2 mg／mL和5 mg／mL），培養(yǎng)48 h后，用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測上清液中IL-17A、TGF-β1和IL-6的濃度。結(jié)果COPD組PBMCs經(jīng)PHA活化后，其分泌的IL-17A、TGF-β1和IL-6均明顯增加（P均＜0.01），并高于健康對照組（P均＜0.01）；加入愈肺寧干預(yù)后，IL-17A濃度明顯降低（P均＜0.01），且呈劑量依賴負(fù)相關(guān)（r＝-0.30，P＜0.01）；高劑量愈肺寧使TGF-β1濃度降低（P＜0.01），而低劑量愈肺寧對TGF-β1濃度無影響，高低劑量愈肺寧對IL-6濃度均無影響。結(jié)論干預(yù)IL-17A和TGF-β1分泌可能是愈肺寧治療穩(wěn)定期COPD的機(jī)制之一。

慢性阻塞性肺疾病；愈肺寧方；PBMCs；IL-17A；TGF-β1；IL-6

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的病理機(jī)制涉及多種炎癥因子，包括白介素-8（IL-8）、白介素-6（IL-6）、轉(zhuǎn)移生長因子β1（TGF-β1）和白介素-17A（IL-17A）等細(xì)胞因子，與COPD的氣道炎癥和結(jié)構(gòu)重塑密切相關(guān)［1］。愈肺寧方是全國名老中醫(yī)戴舜珍主任的經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)肺健脾、益氣固表、補(bǔ)腎納氣、宣肺化痰、活血化瘀等功效。我們前期的臨床研究證實(shí)：愈肺寧可以改善COPD患者CAT評分、呼吸困難評分（mMRC）和6 min步行距離（6MWD），減輕臨床癥狀，降低血清IL-8、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和C反應(yīng)蛋白（CRP）等炎性因子水平［2-3］。本研究采用體外干預(yù)，觀察愈肺寧對COPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）分泌IL-17A、TGF-β1和IL-6等細(xì)胞因子的影響，以進(jìn)一步闡明愈肺寧治療COPD的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 臨床資料

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2007年修訂版）》［4］；中醫(yī)辨證根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病中醫(yī)診療指南（2011版）》［5］和課題組前期研究［2］擬定，肺脾腎虛損、痰瘀互結(jié)的辨證標(biāo)準(zhǔn)：①久咳、痰白；②胸悶或悶痛；③喘促短氣，動則尤甚，呼多吸少；④神疲乏力；⑤易患感冒；⑥納差，便溏；⑦頭暈耳鳴，腰膝酸軟；⑧小便頻數(shù)，夜尿多；⑨面目或下肢浮腫；⑩唇暗或面色晦暗；11○舌下脈絡(luò)曲張，舌質(zhì)淡暗或暗紅或有瘀斑，脈細(xì)弱或沉細(xì)。具備①～③項(xiàng)中2項(xiàng)，④～⑨中2項(xiàng)，⑩～11○中1項(xiàng)即可診斷。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)①男女不限，年齡40～80歲；②符合COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床分期屬穩(wěn)定期；③中醫(yī)辨證屬肺脾腎虛損，痰瘀互結(jié)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)①最近兩周有發(fā)生上呼吸道感染；②最近1個(gè)月有全身使用糖皮質(zhì)激素者；③精神病患者；④合并有肝、腎、心血管和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者；⑤不愿接受研究措施或者有其他原因不能合作者。

1.4 健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn)①體格檢查正常，年齡40～80歲；②無吸煙史；③無急、慢性呼吸道疾??；④胸部X線檢查無明顯異常；⑤最近1個(gè)月未使用抗生素以及全身使用糖皮質(zhì)激素治療；⑥無明顯心血管疾??；⑦無糖尿病和自身免疫性疾病。

1.5 一般資料研究對象來自2012年12月—2014年6月在福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬漳州中醫(yī)院就診的COPD穩(wěn)定期患者（COPD組）55例和健康體檢的志愿者（健康對照組）30例。2組性別、年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。COPD組的第1秒鐘用力呼氣容積（FEV1）、1秒鐘用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1／%pre）及FEV1／用力肺活量（FEV1／FVC，1秒率）均明顯低于健康對照組。本研究經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬漳州中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有對象均簽署知情同意書。見表1。

表1 2組一般情況比較（x±s）

2 方法

2.1 藥物配制愈肺寧主要成分：黨參、黃芪、防風(fēng)、白術(shù)、菟絲子、核桃肉、瓜蔞、杏仁、浙貝母、丹參、桃仁等組成，免煎顆粒，由培力（南寧）藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供。參考Chen等［6］的方法及預(yù)實(shí)驗(yàn)，用磷酸鹽緩沖液溶解愈肺寧免煎顆粒，并調(diào)整藥液濃度為1 g／mL（相當(dāng)于生藥質(zhì)量）。

2.2 試劑和儀器淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll，美國GE醫(yī)療集團(tuán)）；pH7.0磷酸鹽緩沖液（PBS，美國GE醫(yī)療集團(tuán)）；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基（美國GE醫(yī)療集團(tuán)）；胎牛血清（FBS，美國GE醫(yī)療集團(tuán)）；1%青酶素／鏈酶素（美國GE醫(yī)療集團(tuán)）；植物凝集素（PHA，美國Thermo Fisher公司）；IL-17A、TGF-β1和IL-6 ELISA試劑盒（美國eBioscience公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）；生物安全柜（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

2.3 PBMCs的分離采集COPD穩(wěn)定期患者和健康志愿者的外周血20 mL經(jīng)肝素抗凝，參照前期研究［7］的方法，用Ficoll分離獲取PBMCs，經(jīng)PBS洗滌1次，用含10%FBS的RPMI-1 640細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×106／L。

2.4 PBMCs分組培養(yǎng)①空白亞組，PBMCs在含10%FBS的RPMI-1640中培養(yǎng)；②PHA亞組：在含PBMCs培養(yǎng)液中加PHA，終濃度為10 μg／mL；③PY2亞組和PY5亞組：PHA加愈肺寧，在PHA組基礎(chǔ)上加愈肺寧，使愈肺寧終濃度分別為2 mg／mL（PY2亞組）和5 mg／mL（PY5亞組）。各亞組細(xì)胞培養(yǎng)液置于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃含5%CO2的恒溫飽和濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，分離上清液，置－80℃凍存?zhèn)溆?，用臺盼蘭檢查培養(yǎng)后細(xì)胞存活情況。

2.5 培養(yǎng)物上清液細(xì)胞因子測定IL-17A、TGF-β1和IL-6濃度測定按照eBioscience試劑盒說明書完成。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS20.0。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Peason相關(guān)分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 愈肺寧對2組PBMCs分泌IL-17A、TGF-β1和IL-6的影響見表2。

表2愈肺寧對2組PBMCs分泌IL-17A、TGF-β1和IL-6的影響（x±s）

3.2 愈肺寧劑量與IL-17A濃度的相關(guān)性分析見圖1。

3.32 組培養(yǎng)后PBMCs存活率比較見表3。

表3 2組培養(yǎng)后PBMCs存活率比較（x±s）%

圖1 愈肺寧劑量與IL-17A濃度的相關(guān)性分析

4 討論

PHA是一種絲裂原，能夠非特異性地刺激T淋巴細(xì)胞活化，分泌多種細(xì)胞因子，包括IL-17A、TGF-β1和IL-6［7－8］等。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)PHA刺激，COPD組和健康對照組PBMCs分泌IL-17A、TGF-β1和IL-6均明顯增加，COPD組明顯高于健康對照組，提示COPD患者分泌3種細(xì)胞因子的細(xì)胞增多或者分泌功能亢進(jìn)。

IL-17A與COPD氣道炎性反應(yīng)和結(jié)構(gòu)重塑密切相關(guān)。IL-17A刺激氣道上皮細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，包括IL-8、IL-6和粒細(xì)胞集落刺激因子（GCSF）等，這些細(xì)胞因子募集中性粒細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織［9］；IL-17A還通過刺激氣道上皮細(xì)胞分泌黏液和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9），MMP-9分解膠原蛋白和彈性蛋白，使肺泡表面和肺組織中彈性蛋白喪失，破壞肺泡壁引起肺結(jié)構(gòu)重塑［10］。COPD患者的氣管和肺實(shí)質(zhì)IL-17A表達(dá)明顯增高，而且與FEV1%pre、一氧化碳彌散量占預(yù)計(jì)值的百分比（DLCO%預(yù)計(jì)值）和身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）呈負(fù)相關(guān)，與CAT評分呈正相關(guān)［11］。本研究結(jié)果顯示：愈肺寧干預(yù)使COPD患者PBMCs分泌IL-17A減少，且呈劑量依賴負(fù)相關(guān)。中醫(yī)藥治療COPD穩(wěn)定期可能通過調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)從而減輕炎性反應(yīng)和氣道結(jié)構(gòu)的破壞，改善臨床癥狀。劉穎等［12］研究證實(shí)固本止咳中藥可以明顯降低COPD模型鼠的肺組織中γδT淋巴細(xì)胞比例，并同步降低肺組織淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物的IL-17A濃度。本課題組［7］前期研究也表明：中藥制劑喘可治注射液可以明顯抑制COPD患者PBMCs分泌IL-17A，且與喘可治呈劑量負(fù)相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：低劑量愈肺寧干預(yù)COPD患者PBMCs分泌TGF-β1無明顯變化，高劑量愈肺寧使TGF-β1分泌減少。TGF-β1是一種多功能生長因子，主要通過趨化氣道炎性細(xì)胞、促進(jìn)纖維細(xì)胞增殖與分化、氣道平滑肌細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)合成與沉淀等機(jī)制參與氣道結(jié)構(gòu)重塑。COPD患者小氣道上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1增加，TGF-β1 mRNA水平與COPD患者小氣道V25%、V50%值呈負(fù)相關(guān)，體外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞自釋放TGF-β1免疫活性升高［13］。干預(yù)TGF-β1表達(dá)可能是中藥治療COPD的另一個(gè)機(jī)制，馮翠靈等［14］研究顯示：中藥芪蛭益肺顆粒能夠降低COPD模型鼠的小氣道上皮細(xì)胞、肺組織的TGF-β1表達(dá)。

IL-6是一種炎癥細(xì)胞因子、急性時(shí)相蛋白，在全身性系統(tǒng)性炎癥時(shí)，血清IL-6明顯升高，是COPD的炎癥指標(biāo)之一。COPD穩(wěn)定期患者的血清IL-6水平明顯升高，這增加了COPD患者抑郁的危險(xiǎn)和死亡率［15］。本研究結(jié)果顯示：高低劑量愈肺寧對IL-6濃度均無影響，提示愈肺寧不能干預(yù)IL-6分泌。IL-6具有促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，并促使IL-17A分泌增多，IL-17A又誘導(dǎo)靶細(xì)胞分泌IL-6。但本研究未顯示IL-6濃度伴隨IL-17A濃度下降而下降，其機(jī)制尚待研究。

培養(yǎng)后細(xì)胞存活率結(jié)果表明：高低劑量愈肺寧對COPD組和健康對照組的培養(yǎng)細(xì)胞存活率均無影響，說明細(xì)胞因子濃度降低并非愈肺寧殺死細(xì)胞所致。研究結(jié)果提示，愈肺寧可以抑制COPD患者PBMCs分泌IL-17A和TGF-β1，這可能是愈肺寧治療穩(wěn)定期COPD的機(jī)制之一，其調(diào)控途徑有待進(jìn)一步研究。

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R285.5

A

1000-338X（2017）04-0034-03

2017-04-08

國家中醫(yī)藥管理局國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項(xiàng)課題（JDZX2012168）；福建省漳州市自然科學(xué)基金科技項(xiàng)目（ZZ2012J38）；國家中醫(yī)藥管理局2011年全國名老中醫(yī)傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目；福建省中醫(yī)肺系病重點(diǎn)研究室建設(shè)項(xiàng)目（內(nèi)科類-5）

洪春霖（1972—），男，主管技師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合呼吸系統(tǒng)疾病的病理機(jī)制研究。

洪敏俐（1967—），女，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：1501499678@qq.com李風(fēng)森（1963—），男，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師。E-mail：fengsen602@163.com