李 芬，李 巍，舒 勤

·論 著·

淺Ⅱ度燙傷復(fù)合機(jī)械力牽拉刺激動物模型的建立及評估

李 芬，李 巍，舒 勤

目的 建立淺Ⅱ度燙傷復(fù)合機(jī)械力牽拉刺激動物模型，并對模型的穩(wěn)定性、可靠性進(jìn)行評估。方法 選用10～12周C57BL/6小鼠60只進(jìn)行實驗。實驗分為A組(淺Ⅱ度燙傷+機(jī)械力牽拉組)、B組(淺Ⅱ度燙傷+假手術(shù)對照組)和C組(正常對照組)。A組、B組根據(jù)不同取材時間(0、1、3、5、7、14d及21d)分為A1～A7亞組和B1～B7亞組。將小鼠編號并隨機(jī)分到A1～A7亞組、B1～B7亞組和C組，每組4只小鼠。備皮后，用YLS-5Q臺式恒溫燙傷儀分別在A組、B組小鼠背部L1水平建立2cm2淺Ⅱ度燙傷創(chuàng)面，并利用組織缺損縫合的方法在A組小鼠上建立機(jī)械力牽拉刺激。分別在制創(chuàng)后的0、1、3、5、7、14及21d，取A組、B組小鼠的燙傷創(chuàng)面及C組相同部位的皮膚標(biāo)本，進(jìn)行病理學(xué)評估。結(jié)果 成功建立了A、B組動物模型；病理分析可見A組燙傷創(chuàng)面痂下愈合速度較B組快；在燙傷后第1天，A組燙傷創(chuàng)面顯著大于B組；在燙傷后第5、7和第14天，A組殘余面積顯著小于B組(P<0.05)，且標(biāo)準(zhǔn)差0.01～0.15，說明張力控制方法至少可持續(xù)至建模第14天，且穩(wěn)定可靠、可重復(fù)性好，能再現(xiàn)張力對創(chuàng)面的作用規(guī)律。結(jié)論 本研究成功建立了一種簡單、科學(xué)的小鼠背部淺Ⅱ度燙傷復(fù)合機(jī)械力牽拉刺激動物模型，為研究張力對燙傷創(chuàng)面愈合的影響奠定了基礎(chǔ)。

燙傷；張力; 機(jī)械力; 動物模型

有關(guān)創(chuàng)面張力與愈合質(zhì)量的研究歷史由來已久。早在1861年，Langer就認(rèn)為創(chuàng)面瘢痕的形成與皮膚張力線的分布有關(guān)[1]。多項研究也表明，機(jī)械力負(fù)荷能對創(chuàng)傷愈合的整個過程產(chǎn)生影響[2]，顯著增加增生性瘢痕的形成，影響愈合質(zhì)量[3-4]。這可能與張力促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并在愈合后持續(xù)存在有關(guān)[5]。但相關(guān)機(jī)械力作用的具體機(jī)制尚未完全闡明，醫(yī)學(xué)科學(xué)家及臨床醫(yī)生要想清晰地了解增生性瘢痕產(chǎn)生的機(jī)制，以便更好地減少或避免增生性瘢痕的產(chǎn)生，仍面臨巨大的挑戰(zhàn)[3]。

作為增生性瘢痕的重要傷因，燒燙傷創(chuàng)面愈合的相關(guān)研究也從未停止，但關(guān)于燒燙傷創(chuàng)面張力作用及其機(jī)制的研究仍剛剛開始?，F(xiàn)有資料表明，愈合時間[6]、創(chuàng)面張力[7]等，是燒燙傷創(chuàng)面增生性瘢痕發(fā)生的重要影響因素，但機(jī)械力加載與燒燙傷創(chuàng)面復(fù)雜的病理生理變化之間如何重疊作用、相互影響，目前仍是空白，急需建立相應(yīng)的動物模型，以開展基礎(chǔ)實驗研究。但是，目前關(guān)于張力對創(chuàng)面愈合影響的動物模型主要以創(chuàng)傷傷口為主，尚未見到針對燙傷的張力控制動物模型；且現(xiàn)有模型主要以豬、兔等大、中型動物為基礎(chǔ)，實驗成本相對較高。本研究利用小鼠建立張力控制淺Ⅱ度燙傷動物模型，并對其有效性進(jìn)行了初步的評估，驗證了其穩(wěn)定性和有效性，為相關(guān)研究提供了必要的動物模型參考。

材料與方法

1 實驗動物

準(zhǔn)備10～12周的C57 BL/6小鼠60只，雄性，體重20～25g，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗[8]。將實驗動物隨機(jī)分為A組(淺Ⅱ度燙傷+機(jī)械力牽拉組)、B組(淺Ⅱ度燙傷+假手術(shù)對照組)和C組(正常對照組)。A組、B組根據(jù)不同取材時間(0、1、3、5、7、14及21d)，分為A1～A7亞組和B1～B7亞組。將小鼠編號并隨機(jī)分到A1～A7亞組、B1～B7亞組和C組，每組4只小鼠。

2 實驗材料

YLS-5Q超級臺式恒溫燙傷儀；1%戊巴比妥鈉、1mL注射器；剪毛器、脫毛膏、紗布；縫合針、縫合線、眼科剪、鑷子、印泥、自制印章和尺子等。

3 模型制作

3.1 淺Ⅱ度燙傷創(chuàng)面制作 小鼠稱重，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(0.01mL/g)。麻醉成功后，用剃毛器剃去背部毛發(fā)，脫毛膏備皮，溫水擦凈背部皮膚。休息24h后同法麻醉，將小鼠置于YLS-5Q臺式恒溫燙傷儀操作臺上，充分暴露致創(chuàng)區(qū)皮膚(致創(chuàng)區(qū)的選擇以小鼠L1為分界線，尾部至L1之間的區(qū)域為燙傷致創(chuàng)區(qū))。使用接觸面積為2cm2、自重500g的燙頭致創(chuàng)，將燙頭溫度調(diào)至65℃，利用燙頭自重垂直接觸小鼠致創(chuàng)區(qū)3s，不額外加壓，即制成2cm2淺Ⅱ度燙傷創(chuàng)面[9]。

3.2 張力控制+淺Ⅱ度燙傷模型制作 首先，按前述方法在小鼠背部L1水平建立淺Ⅱ度燙傷創(chuàng)面。其次，利用缺損皮膚張力縫合方法在小鼠背部建立張力控制區(qū)域。為了使所建立的張力控制區(qū)域位置恒定，對下方燙傷創(chuàng)面產(chǎn)生的張力大小相當(dāng)，首先利用預(yù)先制作的“網(wǎng)格印章工具”在小鼠背部印制大小為0.2cm×0.2cm的網(wǎng)格，以精確控制皮膚缺損面積(使其張力縫合后產(chǎn)生的張力大小一致)。其次，在各組小鼠T1水平繪制張力線(以使各小鼠背部的張力縫合部位與下方燙傷區(qū)域的距離一致)。對A組小鼠繪制一個底邊1cm、上下兩邊距離1.2cm的六邊形(六邊形中點(diǎn)置于小鼠T1，圖1所示)，并切除該六邊形面積，縫合六邊形上下兩邊，針距0.2cm，從而對燙傷創(chuàng)面形成一定的張力，即張力控制組；對B組小鼠則直接在這一張力線上進(jìn)行假手術(shù)切開、縫合，不產(chǎn)生額外張力，即假手術(shù)對照組(圖1)。

A.實驗組 B.假手術(shù)對照組

圖1 小鼠模型制作示意圖。A：有六邊形組織缺損并縫合的機(jī)械力牽拉刺激組；a.淺Ⅱ度燙傷部位，可見皮膚蒼白，皮下組織水腫；B：僅有線性切口并縫合的無機(jī)械力增加組傷口

4 取材

同前法麻醉小鼠，拍照后，沿創(chuàng)緣0.1cm剪下皮膚全層組織，4%多聚甲醛固定48h，石蠟包埋切片。

5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。應(yīng)用重復(fù)測量的方差分析方法評估不同組間的差異，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況

本實驗術(shù)中因麻醉過深死亡1只，予以補(bǔ)充。其余動物建模均獲得成功。

2 組織學(xué)病理學(xué)觀察

為了觀察淺Ⅱ度燙傷創(chuàng)面是否成功建立，取A組、B組的燙傷創(chuàng)面(制創(chuàng)后0d)及C組相同部位正常皮膚標(biāo)本進(jìn)行4%多聚甲醛固定、石蠟包埋切片(0.4μm)，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察切片，結(jié)果如圖2所示。

3 張力作用效果分析

為了評估施加于淺II度燙傷創(chuàng)面的張力是否持續(xù)、穩(wěn)定且可重復(fù)，筆者利用A組、B組動物分析不同時間機(jī)械力牽拉作用下殘余創(chuàng)面的大小。研究顯示，制創(chuàng)當(dāng)天(第0天)，A組燙傷面積為(2.12±0.05)cm2；B組燙傷面積為(2.11±0.03)cm2，各組間無顯著統(tǒng)計學(xué)意義；在傷后第1天，A組在持續(xù)機(jī)械力牽拉的作用下，其燙傷創(chuàng)面面積顯著增大[2.28±0.02)cm2，P=0.0009]；B組燙傷創(chuàng)面面積沒有明顯變化(2.11±0.05)cm2；在傷后第3天，A組、B組創(chuàng)面大小差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在燙傷后的5、7、14d，A組創(chuàng)面縮小的速度顯著快于B組(P<0.05)；在燙傷后第21天，A組與B組殘余創(chuàng)面均明顯縮小，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1，圖3、4)。

圖2 淺Ⅱ度燙傷組織病理圖。a～b：正常對照組背部皮膚組織的HE染色，鏡下可見表皮細(xì)胞排列整齊、連續(xù)、層次清楚，上皮細(xì)胞胞核、胞漿著色良好，真皮層組織及附屬結(jié)構(gòu)，皮脂腺、汗腺、毛囊結(jié)構(gòu)清晰、完整，細(xì)胞形態(tài)正常(a：10倍視野；b：20倍視野)。c～d：燙傷組(A組及B組)燙傷創(chuàng)面皮膚的HE染色，鏡可見表皮破壞，真皮淺層損傷、水腫(c：10倍視野；d：20倍視野)

表1 實驗組和對照組燙傷殘余面積

圖3 各組小鼠淺Ⅱ度燙傷創(chuàng)面殘余面積的大體觀察。A組制創(chuàng)后1d，燙傷創(chuàng)面大小與B組燙傷面積無顯著差異；在制創(chuàng)后5、7、14d，A組殘余創(chuàng)面較B組顯著減少

圖4 各組小鼠燙傷創(chuàng)面殘余面積的比較。*P<0.05，**P<0.01

討 論

當(dāng)前用于研究張力作用下創(chuàng)面瘢痕形成的模型分為體外模型和體內(nèi)(動物)模型兩種，前者主要利用2D、3D培養(yǎng)技術(shù)建立張力控制體系，對相關(guān)修復(fù)細(xì)胞開展研究[10]，而后者主要集中于豬、兔等大中型動物[4]的創(chuàng)傷修復(fù)研究。目前，在小鼠皮膚上建立張力管理的動物模型尚未見報道，更沒有見到在小鼠皮膚上同時建立燙傷創(chuàng)面+張力控制的動物模型。在嘗試建模中筆者發(fā)現(xiàn)，主要影響小鼠張力管理動物模型建立的因素包括：(1)小鼠皮下組織較少，皮膚松弛；(2)小鼠皮膚面積小，使用牽拉器械困難；(3)小鼠活動靈活，活動范圍大，不易控制張力作用的穩(wěn)定性。

為了克服相關(guān)的影響因素，筆者在現(xiàn)有報道的基礎(chǔ)上做了如下改進(jìn)：(1)適當(dāng)增加建立張力所需的皮膚缺損面積，從而對創(chuàng)面施加足夠大的張力；(2)用對口縫合的方法使張力作用更加穩(wěn)定持續(xù)；(3)將張力控制部位定位在T1水平上下，有效避免小鼠對縫合線的抓咬破壞；(4)利用網(wǎng)格印制工具提高對“六邊形皮膚缺失+張力縫合”方法的精確控制，使張力控制組和假手術(shù)對照組在傷后1、3、5、7、14和21d共6個時相點(diǎn)的燙傷面積的標(biāo)準(zhǔn)差控制在0.01～0.15，說明本燙傷張力管理模型具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，由于采用了連續(xù)縫合的方法建立張力加載，在傷后第7、14天，部分縫合線一端開始出現(xiàn)斷裂脫落現(xiàn)象，可能對實驗結(jié)果有一定的影響。

為此，在今后的實驗中建議采用間斷縫合方法減少或避免連續(xù)縫合法所帶來的張力不穩(wěn)定問題。

[1] No authors listed.On the anatomy and physiology of the skin.III.The elasticity of the cutis by professor K.Langer presented at the meeting of 27th November 1861[J].Br J Plast Surg,1978，31(3):185-199.

[2] Agha R,Ogawa R,Pietramaggiori G,et al.A review of the role of mechanical forces in cutaneous wound healing[J].J Surg Res,2011,171(2):700-708.

[3] van den Broek LJ,Limandjaja GC,Niessen FB,et al.Human hypertrophic and keloid scar models: principles,limitations and future challenges from a tissue engineering perspective[J].Exp Dermatol,2014,23(6):382-386.

[4] Gurtner GC,Dauskardt RH,Wong VW,et al.Improving cutaneous scar formation by controlling the mechanical environment[J].Ann Surg,2011,254(2):217-225.

[5] Junker JPE,Kratz C,Tollb?ck A,et al.Mechanical tension stimulates the transdifferentiation of fibroblasts into myofibroblasts in human burn scars[J].Burns,2008,34(7):942-946.

[6] Park TH,Park JH,Chang CH.Challenging the dogma: relationship between time to healing and formation of hypertrophic scars after burn injuries[J].J Burn Care Res,2014,35(4):e285-286.

[7] Curran TA,Ghahary A.Evidence of a role for fibrocyte and keratinocyte-like cells in the formation of hypertrophic scars[J].J Burn Care Res,2013,34(2):227-231.

[8] Pfurtscheller K,Petnehazy T,Goessler W,et al.Innovative scald burn model and long-term dressing protector for studies in rats[J].J Trauma Acute Care,2013,74(3):932-935.

[9] 孫薇.P311促進(jìn)燒傷創(chuàng)面表皮干細(xì)胞遷移的實驗研究[D].第三軍醫(yī)大學(xué),2012：67.

[10] Yang L,Witten TM,Pidaparti RM.A biomechanical model of wound contraction and scar formation[J].J Theor Biol,2013,332:228-248.

(本文編輯：黃利萍)

A novel mechanical stretch model in mice with superficial second degree burn

LIFen,LIWei,SHUQin

(Nursing School,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

Objective To establish a novel mechanical stretch model in mice with superficial second degree burns,and to evaluate the stability and reliability of the model. Methods Sixty C57BL/6 mice aged 10-12 weeks were selected and randomly divided into 3 groups,including group A (mechanical stretch & superficial second degree burns),group B (sham operation & superficial second degree burns) and group C (normal). Seven sub-groups were set separately in group A and B according to different time points,with 4 mice in each group. After the skin was prepared,a 2 cm2area of superficial second degree burn wound was established on mice back in group A and B at L1level using YLS-5Q Desktop Scald Thermostatic Instrument. And the mechanical stretch was established on each mouse in group A by tissue defect suture method. The burn wound samples were taken for pathologic evaluation at 0,1,3,5,7,14d and 21d in group A and group B,as well as the skin in the same site of mice in group C.Results Superficial second degree burns were successfully built. According to pathologic evaluation results, the healing rate of wound in group A was significantly faster than that in group B. Group A had significantly larger wounds at 1d but had significantly smaller residual area at 5,7,14d than group B (P<0.05). The standard deviation was between 0.01 and 0.15,indicating that a stable and reliable mechanical stretch was sustainable until at least modeling day 14. Conclusion This study has successfully established a simple and scientific animal model of mechanical stretch stimulation with superficial second degree burn,which provides possible basis for studying the role of tension in scald wound.

burn; tension; mechanical load; animal model

1009-4237(2017)08-0603-04

2013年度全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目資助(13QNP111)

400038 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)護(hù)理學(xué)院野戰(zhàn)護(hù)理學(xué)教研室

舒勤，E-mail：15594115@qq.com

李巍，E-mail:weilee2020@163.com

R 644

A

10.3969/j.issn.1009-4237.2017.08.011

2016-05-04；

2016-05-31)