王瑞倉 劉艷芬 楊潔 周潔 李杰 郝洪嶺

·論著·

IL-23誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)MUTZ-1細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響

王瑞倉 劉艷芬 楊潔 周潔 李杰 郝洪嶺

目的白介素-23(IL-23)誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)骨髓增生異常綜合征(MDS)細(xì)胞系MUTZ-1增殖、凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法采用密度梯度離心法分離獲得正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)，細(xì)胞分4組：陰性對(duì)照組(未加IL-23)，3個(gè)濃度IL-23組(2、10、50 ng/ml)，體外誘導(dǎo)72 h，并與MUTZ-1共培養(yǎng)。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MUTZ-1細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞儀檢測(cè)MUTZ-1細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化。Real time-PCR和Western-blot檢測(cè)MUTZ-1細(xì)胞Bax、Bcl-2、caspase-3、survivin mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果2、10、50 ng/ml IL-23誘導(dǎo)的PBMNC與 MUTZ-1細(xì)胞共培養(yǎng)后，MUTZ-1細(xì)胞增殖速度、S期細(xì)胞比例明顯降低，細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，呈時(shí)間和濃度依賴性，與陰性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2、survivin mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，呈時(shí)間和濃度依賴性，與陰性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論IL-23誘導(dǎo)PBMNC能夠明顯抑制MUTZ-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)MUTZ-1細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與上調(diào)Bax、caspase-3表達(dá)、下調(diào)Bcl-2、survivin表達(dá)有關(guān)。

IL-23；MUTZ-1細(xì)胞；增殖；凋亡；基因表達(dá)

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一種起源于造血干細(xì)胞的克隆性疾病，以病態(tài)或無效造血、一系或多系血細(xì)胞質(zhì)/量異常、易進(jìn)展為急性髓系白血病為特征，患者生存期短[1,2]。近年來，MDS發(fā)病率存在逐年上升趨勢(shì)[3]。目前，異基因造血干細(xì)胞移植是緩解患者疾病進(jìn)展的重要手段。但由于骨髓供體缺乏、患者年齡限制等因素導(dǎo)致只有少數(shù)MDS患者接受此療法，且移植后并不能明顯降低患者病死率[4]。另外，臨床治療MDS還采用化療、靶向治療、誘導(dǎo)分化治療等，但療效均不甚滿意，原因主要在于這些方法不能殺滅所有腫瘤細(xì)胞，患者極易復(fù)發(fā)[5]。白介素-12(IL-12)家族是一類結(jié)構(gòu)類似、亞基間通過二硫鍵結(jié)合的細(xì)胞因子家族，主要包括IL-12、IL-23、IL-27、IL-35，在細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，IL-12家族成員與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中IL-23是IL-12家族的重要成員，主要發(fā)揮抗腫瘤及抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，IL-23能促進(jìn)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)對(duì)白血病K562細(xì)胞的殺傷力[7]。而細(xì)胞增殖和凋亡是MDS的主要發(fā)病機(jī)制。目前，有關(guān)IL-23應(yīng)用于MDS治療及對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響研究尚少。本研究旨在探討IL-23誘導(dǎo)正常人PBMNC對(duì)MDS細(xì)胞系MUTZ-1增殖、凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期為MDS的免疫治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 MUTZ-1細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞庫；重組人IL-23購自美國R&D公司；人淋巴細(xì)胞分離液、CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；caspase-3、survivin一抗購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；Trizol、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購自美國Promega公司；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器 倒置顯微鏡購自日本Nicon公司；Chemi DocTM XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Biorad公司；7300型Real time-PCR擴(kuò)增儀購自美國ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MUTZ-1的培養(yǎng):MUTZ-1加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)MUTZ-1細(xì)胞，每2～3天傳代1次。

1.3.2 PBMNC的分離、培養(yǎng)及分組:采集健康人清晨空腹靜脈血5 ml，肝素抗凝，PBS 1∶1稀釋，采用Ficoll密度梯度離心法分離得到PBMNC，加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞分4組：陰性對(duì)照組(PBMNC培養(yǎng)基中未加IL-23)，3個(gè)濃度IL-23組(PBMNC培養(yǎng)基中分別加入2、10、50 ng/ml IL-23)，體外誘導(dǎo)72 h，并與MUTZ-1共培養(yǎng)。

1.3.3 MTT實(shí)驗(yàn):將各組MUTZ-1細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/ml，每孔200 μl，于第1、3、5、7天每孔加入MTT溶液(5 mg/nl)20 μl，4 h后離心，收集細(xì)胞，加入DMSO 150 μl，振蕩混勻，在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值(A570)。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù):將4組MUTZ-1細(xì)胞接種于24孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，于第1、3、5、7天后胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌，加入標(biāo)記熒光素FITC的Annexin V 5 μl，PI染液10 μl室溫避光反應(yīng)5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集MUTZ-1細(xì)胞，PBS洗滌，70%乙醇固定24 h，PI染色，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.3.5 Real time-PCR:Trizol提取細(xì)胞總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書加樣進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，ABI 7300型熒光定量PCR儀擴(kuò)增。引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用所選儀器自帶的分析軟件計(jì)算后得到各樣本、各基因擴(kuò)增的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照基因，目的基因表達(dá)相對(duì)值RQ=2-ΔΔCt。見表1。

表1 Real time-PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3.6 Western-blot:提取細(xì)胞總蛋白，半干法電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，10%脫脂奶粉封閉 2 h。依次加入特異性一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件掃描測(cè)定蛋白條帶IOD值，GAPDH作為內(nèi)參照，以目的蛋白與GAPDH吸光度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 IL-23誘導(dǎo)PBMNC對(duì)MUTZ-1細(xì)胞增殖的影響 第1天4組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第2～7天，隨著IL-23濃度的加大，IL-23組MUTZ-1細(xì)胞增殖速度明顯降低，其中50 ng/ml IL-23組MUTZ-1細(xì)胞增殖速度較10 ng/ml IL-23組降低，后者較2 ng/ml IL-23組降低，3組增殖速度均低于陰性對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

2.2 IL-23誘導(dǎo)PBMNC對(duì)MUTZ-1細(xì)胞凋亡的影響 4組第1天比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第3～7天，隨著IL-23濃度的加大，IL-23組MUTZ-1細(xì)胞凋亡率明顯增加，其中50 ng/ml IL-23組MUTZ-1細(xì)胞凋亡率較10 ng/ml IL-23組增加，后者較2 ng/ml IL-23組增加，3組凋亡率均高于陰性對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

表2 IL-23誘導(dǎo)PBMNC對(duì)MUTZ-1細(xì)胞增殖的影響

注：與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05;與2 ng/ml IL-23組比較,#P<0.05;與10 ng/ml IL-23組比較,△P<0.05

2.3 IL-23誘導(dǎo)PBMNC對(duì)MUTZ-1細(xì)胞周期的影響 4組第1天，G0/G1、S、G2/M比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第3～7天，隨著IL-23濃度的加大，IL-23組MUTZ-1細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，其中50 ng/ml IL-23組MUTZ-1細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例較10 ng/ml IL-23組增加，后者較2 ng/ml IL-23組增加，3組G0/G1期細(xì)胞比例均高于陰性對(duì)照組(P<0.05)；同時(shí)IL-23組MUTZ-1細(xì)胞S期細(xì)胞比例明顯降低，其中50 ng/ml IL-23組MUTZ-1細(xì)胞S期細(xì)胞比例較10 ng/ml IL-23組降低，后者較2 ng/ml IL-23組降低，3組S期細(xì)胞比例均低于陰性對(duì)照組(P<0.05)；IL-23對(duì)G2/M期細(xì)胞作用不明顯。見表4。

表3 IL-23誘導(dǎo)PBMNC對(duì)MUTZ-1細(xì)胞凋亡的影響

注：與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05;與2 ng/ml IL-23組比較,#P<0.05;與10 ng/ml IL-23組比較,△P<0.05

表4 IL-23誘導(dǎo)PBMNC對(duì)MUTZ-1細(xì)胞周期的影響

注：與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05;與2 ng/ml IL-23組比較,#P<0.05;與10 ng/ml IL-23組比較,△P<0.05

2.4 IL-23誘導(dǎo)PBMNC對(duì)MUTZ-1細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響 隨著IL-23濃度的加大，IL-23組Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，其中50 ng/ml IL-23組Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)較10 ng/ml IL-23組增加，后者較2 ng/ml IL-23組增加，3組Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)均高于陰性對(duì)照組(P<0.05)；同時(shí)IL-23組Bcl-2、survivin mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，其中50 ng/ml IL-23組Bcl-2、survivin mRNA和蛋白表達(dá)較10 ng/ml IL-23組降低，后者較 2 ng/ml IL-23組降低，3組Bcl-2、survivin mRNA和蛋白表達(dá)均低于陰性對(duì)照組(P<0.05)。見表5、6。

表5 IL-23誘導(dǎo)PBMNC對(duì)MUTZ-1細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

注：與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05;與2 ng/ml IL-23組比較,#P<0.05;與10 ng/ml IL-23組比較,△P<0.05

3 討論

目前，MDS治療尚缺乏有效手段。對(duì)于有明確白血病表征且條件允許的患者，應(yīng)盡早抑制異常造血克隆并恢復(fù)機(jī)體正常造血功能。對(duì)于病情平穩(wěn)、沒有明確白血病表征的患者，臨床治療應(yīng)以增加血細(xì)胞質(zhì)/量、改善患者生活質(zhì)量為主。因此，如何誘導(dǎo)MDS異常造血克隆細(xì)胞凋亡并促使機(jī)體正常造血功能恢復(fù)是治療MDS的關(guān)鍵。

表6 IL-23誘導(dǎo)PBMNC對(duì)MUTZ-1細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

注：與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05;與2 ng/ml IL-23組比較,#P<0.05;與10 ng/ml IL-23組比較,△P<0.05

研究顯示，MDS早期正常造血克隆和異常造血克隆同時(shí)存在，骨髓造血主要表現(xiàn)為過度增殖和過度凋亡，而MDS晚期異常造血克隆占主導(dǎo)地位，骨髓造血主要表現(xiàn)為過度增殖和凋亡抑制[8]。細(xì)胞凋亡是由促凋亡基因和凋亡抑制基因共同調(diào)控的基本生理過程。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間能夠形成同源或異源二聚體，其中Bcl-2/Bax比值是影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程的關(guān)鍵因素[9,10]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡進(jìn)程中最重要的效應(yīng)分子，細(xì)胞在凋亡刺激信號(hào)作用下，線粒體釋放細(xì)胞色素C，后者與胞漿蛋白結(jié)合，進(jìn)而活化caspase-9并促使其釋放caspase-3，之后細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段[11]。研究顯示，caspase-3在促進(jìn)白血病L1210細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[12]。Survivin是機(jī)體發(fā)揮抗凋亡作用的重要蛋白，研究顯示survivin表達(dá)增強(qiáng)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[13]。

本研究同樣選用2、10、50 ng/ml IL-23體外誘導(dǎo)PBMNC 72 h，并與MUTZ-1共培養(yǎng)，觀察PBMNC對(duì)MUTZ-1細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及相關(guān)基因表達(dá)的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著IL-23濃度加大，MUTZ-1細(xì)胞增殖速度明顯降低，凋亡率明顯增加，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖速度逐漸降低，凋亡率逐漸增加，說明不同濃度IL-23誘導(dǎo)PBMNC均能顯著抑制MUTZ-1細(xì)胞增殖，并促進(jìn)MUTZ-1細(xì)胞凋亡，具有濃度和時(shí)效依賴性。另外，我們通過觀察不同濃度IL-23誘導(dǎo)PBMNC后對(duì)MUTZ-1細(xì)胞G0/G1期、S期變化，認(rèn)為IL-23誘導(dǎo)PBMNC抗MDS的可能機(jī)制是使腫瘤細(xì)胞G0/G1期發(fā)生阻滯，從而抑制了細(xì)胞分裂、增殖和分化。我們進(jìn)一步檢測(cè)了凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、caspase-3、survivin表達(dá)，結(jié)果顯示，隨著IL-23濃度加大，IL-23組Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯上調(diào)，Bcl-2、survivin mRNA和蛋白表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯下調(diào)，且隨著IL-23作用時(shí)間延長(zhǎng)，Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)，Bcl-2、survivin mRNA和蛋白表達(dá)逐漸下調(diào)，說明不同濃度IL-23誘導(dǎo)PBMNC后可通過上調(diào)Bax、caspase-3表達(dá)、下調(diào)Bcl-2、survivin表達(dá)發(fā)揮誘導(dǎo)MUTZ-1細(xì)胞凋亡的作用，具有濃度和時(shí)效依賴性。

總之，IL-23體外誘導(dǎo)PBMNC能夠明顯抑制MUTZ-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)MUTZ-1細(xì)胞凋亡，并使腫瘤細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，且具有濃度和時(shí)效依賴性，其機(jī)制可能通過上調(diào)Bax、caspase-3表達(dá)、下調(diào)Bcl-2、survivin表達(dá)來發(fā)揮作用。本研究對(duì)骨髓增生異常綜合征的臨床治療具有一定參考價(jià)值。

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EffectsofPBMNCinducedbyIL-23ontheproliferation,apoptosisandgeneexpressionofMUTZ-1cells

WANGRuicang*,LIUYanfen,YANGJie*,etal.

*DepartmentofHematology,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo observe the effects of peripheral blood mononuclear cell (PBMNCs) induced by IL-23 on the proliferation,apoptosis and gene expression of MUTZ-1 cells-a human myelodysplastic syndrome (MDS) cell line.MethodsThe PBMNCs were isolated by ficoll density gradient centrifugation.The cells were divided into four groups:control group (without IL-23),three different concentration IL-23 groups (2,10,50ng/ml),which were induced in vitro for 72 hours.Then PBMNCs were co-cultured with MUTZ-1 cells.MTT assay was used to detect the proliferation of MUTZ-1 cells.Flow cytometry was used to detect the cell cycle and cell apoptosis.Real time-PCR and Western-blot were used to detect the expression levels of Bax,Bcl-2,caspase-3 and survivin mRNA and protein.ResultsAfter MUTZ-1 cells were co-cultured with PBMNCs induced by 2,10,50ng/ml IL-23,respectively, the cell proliferation rate of MUTZ-1 and cell proportion at phase S were significantly decreased,however, the cell apoptosis rate and cell proportion at phase G0/G1 were significantly increased,with a concentration-dependent and time-dependent manner,as compared with those in control group (P<0.05).Meanwhile,the expression levels of Bax,caspase-3 mRNA and protein were obviously up-regulated,but the expression levels of Bcl-2,survivin mRNA and protein were significantly down-regulated, with a concentration-dependent and time-dependent manner,as compared with those in control group (P<0.05).ConclusionThe PBMNCs induced by IL-23 can inhibit cell proliferation of MUTZ-1 cells and can promote apoptosis of MUTZ-1 cell,and its action mechanism may be correlated with up-regulating the expressions of Bax and caspase-3 and down-regulating the expressions of Bcl-2 and survivin.

IL-23；MUTZ-1 cells; proliferation; apoptosis; gene expression

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.18.004

項(xiàng)目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(編號(hào)：ZD20140444)

050051 石家莊市，河北省人民醫(yī)院血液科(王瑞倉、楊潔、周潔、李杰、郝洪嶺)；河北省唐山市人民醫(yī)院血液科(劉艷芬)

郝洪嶺，050051 石家莊市，河北省人民醫(yī)院血液科；

E-mail:h0707@163.com

R 551.31

A

1002-7386(2017)18-2739-05

2017-02-09)