黨存曙 劉大鵬 趙孟杰 劉志春 楊明

·論著·

不同TNM分期肝癌患者微血管密度與腫瘤標(biāo)志物水平相關(guān)性研究

黨存曙 劉大鵬 趙孟杰 劉志春 楊明

目的探討不同TNM分期肝癌患者微血管密度(microvessel density，MVD)與腫瘤標(biāo)志物水平的相關(guān)性。方法選取我院接受肝癌手術(shù)治療的患者70例，同期因外傷接受肝臟手術(shù)的患者20例，健康體檢者20例，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)不同分期腫瘤組織、癌旁組織以及正常肝臟組織中的MVD水平，采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測(cè)血清甲胎蛋白(AFP)、惡性腫瘤特異性生長(zhǎng)因子(TSGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)水平。結(jié)果與正常肝臟組織比較，腫瘤組織及癌旁組織中MVD水平較高，且腫瘤組織高于癌旁組織(P<0.05)；腫瘤組織中MVD水平隨TNM分期增高而增加，且不同分期間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與健康體檢者比較，肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平明顯較高(P<0.05)；肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平隨TNM分期增高而增加，且不同分期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平分別與MVD呈正相關(guān)(r值分別為0.853,0.920,0.846，P<0.05)。結(jié)論肝癌患者腫瘤組織的MVD及腫瘤標(biāo)志物AFP、TSGF、VEGF水平與臨床TNM分期有關(guān)，TNM分期越高，MVD及AFP、TSGF、VEGF水平越高，且患者血清AFP、TSGF、VEGF水平分別與MVD呈正相關(guān)關(guān)系，提示腫瘤標(biāo)志物AFP、TSGF、VEGF水平與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。

肝腫瘤；TNM分期；微血管密度；腫瘤標(biāo)志物；相關(guān)性

原發(fā)性肝癌(PHC)是中年男性人群常見的惡性腫瘤，其發(fā)生與酒精、病毒性肝炎、肝硬化、黃曲霉素等化學(xué)致癌物質(zhì)、水土環(huán)境等因素有關(guān)，病理類型以肝細(xì)胞癌最為常見，占70%～85%[1,2]。統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國(guó)每年約有46.61萬新發(fā)PHC患者，每年約42.21萬患者因PHC死亡[3]，并且該發(fā)病率隨著工業(yè)社會(huì)發(fā)展、人口老齡化、生活節(jié)奏改變等仍不斷增加。PHC起病隱匿、惡性程度高、進(jìn)展迅速、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，從確診開始的平均生存期僅為4個(gè)月左右，因此早期診斷、明確臨床分期，對(duì)于及時(shí)控制腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移尤為重要。腫瘤標(biāo)志物是惡性腫瘤細(xì)胞相關(guān)的特異性物質(zhì)，對(duì)于PHC的早期診斷具有非常重要的意義[4]。現(xiàn)代研究認(rèn)為，血管形成在惡性腫瘤的發(fā)展中起到重要作用，不僅能為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)其生長(zhǎng)增殖，還為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了路徑[5]。微血管密度(MVD)是反映惡性腫瘤生物學(xué)行為的重要參數(shù)[6]，與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后關(guān)系密切。本研究主要探討不同TNM分期肝癌患者的MVD及與腫瘤標(biāo)志物水平的相關(guān)性，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料收集自2011年5月到2013年1月在中國(guó)石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院外科接受肝癌手術(shù)治療的患者70例，男51例，女19例；年齡35～72歲，平均年齡(53.82±9.74)歲；腫瘤TNM臨床分期:Ⅰ期17例，Ⅱ期24例，Ⅲ期20例，Ⅳ期9例；術(shù)中取患者的腫瘤組織、癌旁組織作為研究標(biāo)本。選取20例同期因外傷接受肝臟手術(shù)的患者，其中男15例，女5例；年齡32～73歲，平均年齡(52.63±9.28)歲，取其正常肝臟組織標(biāo)本。所有組織標(biāo)本常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋，制備4 μm的組織石蠟切片備用。另外選取20例同期健康體檢者，其中男14例，女6例;年齡34～70歲，平均年齡(51.84±8.92)歲。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2011年中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì)、中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)臨床腫瘤學(xué)協(xié)作專業(yè)委員會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)會(huì)肝癌學(xué)組《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷方案專家共識(shí)》關(guān)于原發(fā)性肝細(xì)胞癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，且經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受過放療、化療或其他任何針對(duì)腫瘤治療的患者，存在手術(shù)禁忌證、無法耐受手術(shù)治療的患者，合并其他部位惡性腫瘤的患者，孕期、哺乳期女性，臨床資料不完整的患者。

1.3主要試劑與儀器鼠抗人CD34單克隆抗體，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；S-P免疫組織化學(xué)試劑盒(包含試劑A：內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，B：正常動(dòng)物非免疫血清，C：生物素標(biāo)記的第二抗體，D：鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶)，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司； DAB顯色試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PBS溶液、枸櫞酸緩沖液、1%鹽酸酒精，購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；人甲胎蛋白(AFP)、惡性腫瘤特異性生長(zhǎng)因子(TSGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)ELISA試劑盒，購(gòu)自上海仁捷生物科技有限公司；DM300徠卡光學(xué)顯微鏡，德國(guó)Leica公司產(chǎn)品； Freedom EVOlyzer全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀，瑞士Tecan公司。

1.4研究方法受檢者于術(shù)前采集清晨空腹靜脈血5 ml。血液樣本均置于含有肝素的抗凝管中，靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，取血清置于-20℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織CD34表達(dá):取出石蠟切片置于烘片機(jī)中，70℃烘烤1 h，依次進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度濃度酒精(95%-85%-75%-65%)水化；嚴(yán)格按照S-P免疫組織化學(xué)試劑盒的說明書步驟進(jìn)行操作，將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐高溫加熱至沸騰，冷卻后再加熱，重復(fù)冷卻進(jìn)行抗原修復(fù)；切片采用PBS沖洗2 min×3次，滴加50 μl試劑A，室溫孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；切片采用PBS沖洗2 min×3次，滴加試劑B封閉20 min；除去試劑B，滴加鼠抗人CD34單克隆抗體(1∶60稀釋)，4℃過夜；切片采用PBS沖洗2 min×3次，滴加試劑C，37℃孵育30 min；采用PBS沖洗2 min×3次，滴加50 μl試劑D，37℃孵育10 min；切片采用PBS洗滌5 min×4次，滴加DAB顯色劑顯色5 min，自來水充分沖洗終止顯色；切片一次采用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗藍(lán)化；常規(guī)脫水、透明、干燥，中性樹膠封片；在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片進(jìn)行觀察、分析。

1.4.2 ELISA法檢測(cè)血清AFP、TSGF、VEGF水平:取出保存的血清樣本，按照AFP、TSGF、VEGF ELISA試劑盒的說明書步驟，采用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀檢測(cè)血清中AFP、TSGF、VEGF水平。

1.5免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定及MVD計(jì)數(shù)CD34主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜，染色呈棕色或棕褐色，常用來標(biāo)記微血管；由兩位高年資病理醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行觀察，參照Weidner血管計(jì)數(shù)法，先在低倍光鏡(×100)下觀察，選取5個(gè)微血管染色密度最高的視野，再于高倍鏡(×400)下觀察，對(duì)5個(gè)視野內(nèi)的MVD進(jìn)行計(jì)數(shù)，之后取平均值作為最終結(jié)果。微血管計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：任何內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇染色呈棕黃色，并且與周圍組織、血管、細(xì)胞等區(qū)別明顯，均可看作一個(gè)血管進(jìn)行計(jì)數(shù)；若血管腔>8個(gè)紅細(xì)胞直徑，或血管壁具有較厚基層，或微血管位于細(xì)胞稀少區(qū)域、纖維硬化區(qū)域、炎癥區(qū)域，或微血管染色模糊，均不計(jì)數(shù)[8]。

2 結(jié)果

2.1腫瘤組織、癌旁組織及正常肝臟中MVD的差異CD34染色陽(yáng)性的血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)散在分布棕黃色顆粒，CD34標(biāo)記陽(yáng)性的血管內(nèi)皮作為MVD計(jì)數(shù)的血管。本研究中，正常肝臟組織CD34染色較淺，MVD水平為(5.88±0.82)；癌旁組織CD34染色主要分布于匯管區(qū)周圍肝實(shí)質(zhì)內(nèi)血竇，MVD水平為(16.73±2.31)；腫瘤組織CD34染色程度較深，主要分布于腫瘤周邊，形態(tài)呈點(diǎn)狀、線狀、竇隙狀、簇狀等，MVD水平為(33.31±4.73)。與正常肝臟組織比較，腫瘤組織及癌旁組織中MVD的水平較高，且腫瘤組織>癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1～3。

表1 腫瘤組織、癌旁組織及正常肝臟中的MVD差異

注：與腫瘤組織比較，*P<0.05；與癌旁組織比較，#P<0.05

圖1 正常肝臟組織的MVD情況(免疫組化×400)

圖2 癌旁組織的MVD情況(免疫組化×400)

2.2 不同TNM分期腫瘤組織的MVD水平比較 不同TNM分期腫瘤組織中MVD水平比較，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖4～7。

圖3 腫瘤組織的MVD情況(免疫組化×400)

表2 不同TNM分期肝癌腫瘤組織MVD水平比較

注：與Ⅰ期比較,*P<0.05；與Ⅱ期比較，#P<0.05；與Ⅲ期比較，△P<0.05

圖4 TNMⅠ期腫瘤組織MVD情況(免疫組化×400)

圖5 TNMⅡ期腫瘤組織MVD情況(免疫組化×400)

2.3 肝癌患者與健康體檢者血清AFP、TSGF、VEGF水平比較 與健康體檢者比較，肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平明顯較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

圖6 TNMⅢ期腫瘤組織MVD情況(免疫組化×400)

圖7 TNMⅣ期腫瘤組織MVD情況(免疫組化×400)

表3 肝癌患者與健康體檢者血清AFP、TSGF、VEGF水平比較

2.4 不同TNM分期肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平比較 不同TNM分期肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平比較，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同TNM分期肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平比較

注：與Ⅰ期比較,*P<0.05；與Ⅱ期比較，#P<0.05；與Ⅲ期比較，△P<0.05

2.5 肝癌患者的MVD與血清AFP、TSGF、VEGF水平相關(guān)性 經(jīng)Pearson線性相關(guān)性分析，肝癌患者的MVD與血清AFP、TSGF、VEGF水平呈正相關(guān)(r值分別為0.853,0.920,0.846,P<0.05)。見圖8～10。

圖8 肝癌患者M(jìn)VD與血清AFP水平相關(guān)性(r=0.8534)

3 討論

有研究認(rèn)為，腫瘤生長(zhǎng)包括兩個(gè)階段，無新生血管形成時(shí)，腫瘤組織主要依靠彌散供氧，生長(zhǎng)緩慢，微血管生成后，可以為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及轉(zhuǎn)移路徑，腫瘤生長(zhǎng)迅速，并且出現(xiàn)侵襲、轉(zhuǎn)移情況[9]，可見，腫瘤組織內(nèi)微血管形成在PHC病情進(jìn)展過程中起到重要作用[10]。MVD是反映腫瘤內(nèi)血管形成情況的客觀指標(biāo)，MVD水平與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力關(guān)系密切。在本研究中，我們采用CD34單克隆抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，用于MVD計(jì)數(shù)，分析肝癌腫瘤組織MVD的水平。CD34抗原是表面分子唾液粘蛋白的一種，屬于糖基化Ⅰ型膜蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞間黏附及造血細(xì)胞分化的作用，主要選擇性的表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞。CD34抗體能夠特異性結(jié)合CD34抗原，造成微血管內(nèi)皮細(xì)胞染色，有助于MVD計(jì)數(shù)[11]。

圖9 肝癌患者M(jìn)VD與血清TSGF水平相關(guān)性(r=0.9203)

圖10 肝癌患者M(jìn)VD與血清VEGF水平相關(guān)性(r=0.8458)

本研究結(jié)果顯示，與正常肝臟組織比較，腫瘤組織及癌旁組織中MVD水平較高，且腫瘤組織>癌旁組織(P<0.05)，提示MVD水平升高與腫瘤組織的進(jìn)展程度有關(guān)。不同TNM分期腫瘤組織中MVD水平比較，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期(P<0.05)，TNM分期是根據(jù)腫瘤原發(fā)灶、區(qū)域淋巴結(jié)受累、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況劃分的，分期越高，腫瘤的進(jìn)展程度越高，預(yù)后越差[12]，研究結(jié)果說明TNM分期不同，腫瘤組織的MVD水平不同，MVD水平越高，腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，預(yù)后越差。

腫瘤標(biāo)志物腫瘤是惡性腫瘤細(xì)胞相關(guān)的特異性物質(zhì)，能夠用于腫瘤的篩查、早期診斷、治療效果監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等，AFP、TSGF、VEGF均為肝癌常見的腫瘤標(biāo)志物[13]。AFP是一種酸性糖蛋白，生理情況下，主要來自胚胎的肝細(xì)胞，成人血清含量較低，而癌變的肝細(xì)胞可以產(chǎn)生AFP，使得其血清水平異常升高，可用于肝癌早期診斷，敏感性約70%[14]；TSGF是新型腫瘤標(biāo)志物，屬于可溶性多肽類物質(zhì)，主要由惡性腫瘤細(xì)胞分泌，能夠促進(jìn)外周毛細(xì)血管擴(kuò)增，可與AFP等聯(lián)合檢測(cè)提高診斷肝癌的精確度[15]；VEGF是作用最強(qiáng)的促進(jìn)血管生成因子，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，不僅能夠強(qiáng)烈刺激血管生成，為腫瘤細(xì)胞提高氧氣和營(yíng)養(yǎng)，還能增加血管的通透性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16,17]。本次研究顯示，與健康體檢者比較，肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平明顯較高(P<0.05)，不同TNM分期肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平比較，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期(P<0.05)，表明肝癌患者腫瘤標(biāo)志物水平與腫瘤分期有關(guān)，AFP、TSGF、VEGF水平越高，提示腫瘤分期越高。Pearson線性相關(guān)性分析，肝癌患者M(jìn)VD與血清AFP、TSGF、VEGF水平分別呈正相關(guān)(r值分別為0.853,0.920,0.846，P<0.05)，提示肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平能夠反映腫瘤內(nèi)血管形成程度以及侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，肝癌患者腫瘤組織的MVD及腫瘤標(biāo)志物AFP、TSGF、VEGF水平與臨床TNM分期有關(guān)，TNM分期越高，MVD及AFP、TSGF、VEGF水平越高，且患者血清AFP、TSGF、VEGF水平分別與MVD水平呈正相關(guān)關(guān)系，提示腫瘤標(biāo)志物AFP、TSGF、VEGF水平與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，可用于肝癌患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的檢測(cè)以及預(yù)后評(píng)估。

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StudyonthecorrelationbetweenmicrovesseldensityandtumormarkerlevelsindifferentTNMstagesoflivercancer

DANGCunshu,LIUDapeng,ZHAOMengjie,etal.

CentralHospitalofChinaPetroleumNaturalGasGroup,Hebei,Langfang065000,China

ObjectiveTo investigate the correlation between microvessel density(MVD) and tumor marker levels in different TNM stages of liver cancer.MethodsSeventy patients with liver cancer who

surgical treatment were enrolled as liver cancer group,the other 20 patients with liver external injury who underwent surgery were enrolled as liver surgery group, moreover 20 healthy subjects were enrolled as control group,The MDA levels were detected by immunohistochemistry in tumor tissues, paracancerous tissues and normal liver tissues,and the serum levels of alpha fetoprotein (AFP),tumor specific growth factor (TSGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsAs compared with those in normal liver tissues,the levels of MVD in tumor tissues and adjacent tissues were higher,moreover,which in tumor tissues were significantly higher than those in adjacent tissues (P<0.05). The levels of MVD in tumor tissues were increased with the increase of TNM stages,furthermore, there were significant differences in the levels of MVD among different stages,stageⅠ

liver cancer; TNM stages; MVD; tumor marker; correlation

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.18.001

項(xiàng)目來源：河北省廊坊市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2011013036)

065000 河北省廊坊市，中國(guó)石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院(黨存曙、劉大鵬、趙孟杰、劉志春)；河北省廊坊市人民醫(yī)院(楊明)

R 735.7

A

1002-7386(2017)18-2725-05

2017-02-15)