徐學(xué)靜，高碩，胡偉，王向陽，陳軍浩，王森

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210008)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

外周血CD4/CD8 雙陽性T細(xì)胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)及意義*

徐學(xué)靜，高碩，胡偉，王向陽，陳軍浩，王森

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210008)

目的 分析類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)患者外周血CD4/CD8雙陽性T細(xì)胞(double positive T cells, DPT)的表達(dá)水平及功能，并探討DPT在RA發(fā)病中的作用。方法 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)25例RA患者及25例健康人對(duì)照外周血CD3+細(xì)胞中CD4+/CD8+雙陽性細(xì)胞的比例；ELISA法檢測(cè)RA患者及健康人對(duì)照血清中抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(ACCP)、IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-12的表達(dá)水平，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(CRP)、類風(fēng)濕因子(RF)。結(jié)果 與健康人對(duì)照組相比，RA患者組DPT占CD3+T細(xì)胞的比例明顯升高，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.63,P<0.01)；RA患者組的ESR、CRP、RF、ACCP、IL-6和TNF-α水平均高于健康人對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為3.71，2.99，8.42，4.25， 2.12，3.23；P分別為0.000 5，0.004 3，0.01，0.01，0.039，0.002 3)。DPT的表達(dá)水平與RA患者的年齡，ACCP，RF及血清中IFN-γ、TNF-α、IL-12的水平不相關(guān)，而與患者ESR，CRP，IL-6水平呈正相關(guān)(r分別為0.65，0.4，0.46；P分別為0.000 4，0.04，0.02)。結(jié)論 RA患者外周血DPT表達(dá)水平明顯升高，在RA發(fā)病及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；T細(xì)胞亞群；CD4/CD8雙陽性T細(xì)胞

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)滑膜損傷為主的自身免疫性疾病，其確切的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，但與細(xì)胞免疫功能紊亂、T細(xì)胞異?；罨癟細(xì)胞亞群的失衡等因素有關(guān)[1-3]。近年來的研究表明，在人及其他哺乳動(dòng)物的胸腺外的免疫組織及器官中出現(xiàn)CD4/CD8雙陽性細(xì)胞(double positive T cells,DPT)[4]。外周血DPT在T淋巴細(xì)胞中的比例一般低于2%，在自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性硬化)及病毒感染(如HIV感染)等過程中DPT表達(dá)水平上升，并表達(dá)IFN-γ及IL-6等細(xì)胞因子，參與T細(xì)胞的活化[5-6]。目前DPT在RA中的表達(dá)及意義仍不明確。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RA患者外周血中DPT的表達(dá)水平，分析DPT與RA患者臨床指標(biāo)的關(guān)系，旨在探討DPT在RA發(fā)病機(jī)制中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2017年2-5月就診于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院風(fēng)濕免疫科的RA患者25例，男5例，女20例，中位年齡52.4歲，診斷均符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(ACR/EULAR)的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有RA患者均使用過糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥等抗風(fēng)濕藥。排除標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)患嚴(yán)重的肝腎疾病，血液系統(tǒng)疾病，惡性腫瘤，自身免疫性疾病以及近期有手術(shù)、外傷和嚴(yán)重感染的患者予以排除。收集同期就診的體檢健康者25例，男19例，女6例，中位年齡51.2歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 試劑及儀器 鼠抗人CD3/CD4/CD8流式抗體、紅細(xì)胞裂解液、TNF-α/IL-6/IFN-γ/IL-12 ELISA試劑盒(美國BD公司)；抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(ACCP) ELISA檢測(cè)試劑盒(上?？菩鹿?；血沉儀(意大利Vital diagnostincs公司)；全自動(dòng)生化分析儀(德國Beckman公司)，酶聯(lián)儀(美國Bio-Rad公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.3 標(biāo)本采集 RA患者(于入院時(shí))與健康人對(duì)照(于體檢時(shí))分別空腹抽取2 mL靜脈血EDTA-K2抗凝， 2 mL靜脈血于枸櫞酸鈉血沉管，另取5 mL 靜脈血于含有分離膠和促凝劑的采血管中。EDTA-K2抗凝血及時(shí)進(jìn)行流式檢測(cè)；枸櫞酸鈉抗凝血及時(shí)進(jìn)行血沉檢測(cè)；促凝血離心取上清后置-80 ℃凍存，待標(biāo)本收集完成后統(tǒng)一檢測(cè)。

1.4 CD3/CD4/CD8的流式染色 取CD3、CD4、CD8流式抗體各5 μL加至流式管管底，將各患者及健康人對(duì)照EDTA-K2抗凝血顛倒混勻，用加樣器取50 μL加至流式管中。震蕩混勻后室溫避光溫育15 min，加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，室溫避光裂解5 min，加入3 mL PBS，1 500 r/min離心5 min,洗滌2次后流式上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。使用BD Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù)，在前向散射光(FSC)及側(cè)向散射光(SSC)點(diǎn)圖上大致圈選出淋巴細(xì)胞，然后使用CD3設(shè)門，進(jìn)一步在CD3+細(xì)胞中分析PPT所占的比例。流式數(shù)據(jù)分析及作圖使用Flowjo軟件(美國Tree star公司)。

1.5 ELISA法檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)

1.5.1 ELISA法檢測(cè)患者血清中ACCP水平 采用ELISA法檢測(cè)血清ACCP，具體步驟和方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。以ACCP濃度<25 RU/mL時(shí)判為陰性。

1.5.2 ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-12水平 使用包被緩沖液按1:250的比例稀釋包被抗體，計(jì)算所需孔數(shù)，在包被板中每孔加入100 μL 包被液，4 ℃溫育過夜。棄去包被液，每孔加入300 μL PBST洗滌3次，每孔加入200 μL樣本稀釋液，室溫封閉1 h。準(zhǔn)備待測(cè)樣本及標(biāo)準(zhǔn)品，按說明書溶解及稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。棄去封閉液，洗滌3次后每孔加入100 μL樣本、標(biāo)準(zhǔn)品及陰性對(duì)照，封板并室溫溫育2 h。洗滌5次后每孔加入100 μL的含抗體及HRP的工作液，室溫溫育1 h。棄去工作液，洗滌7次后，每孔加入100 μL顯色液，室溫避光溫育15 min，觀察顯色情況，每孔加入100 μL終止液。用酶聯(lián)儀，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm時(shí)的吸光度(A450 nm)值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各樣本濃度。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血DPT的表達(dá)水平 RA組DPT占CD3+T細(xì)胞的比例(%)為2.55±0.27，健康人對(duì)照組為1.20±0.09，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.63,P<0.01)。RA患者及健康人對(duì)照DPT的流式細(xì)胞結(jié)果見圖1。

2.2 各組臨床指標(biāo)及細(xì)胞因子的表達(dá)水平 RA患者及健康人對(duì)照組間年齡及IFN-γ、IL-12表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而RA患者組的ESR、CRP、RF、ACCP、IL-6、TNF-α水平均高于健康人對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

2.3 RA患者DPT表達(dá)與各指標(biāo)相關(guān)性分析 RA患者DPT的表達(dá)水平與ESR(r=0.65,P=0.000 4)，CRP(r=0.4,P=0.04)，IL-6(r=0.46,P=0.02)之間存在明顯的相關(guān)性，而與年齡(r=0.17,P=0.36), RF(r=0.16,P=0.44), ACCP(r=0.04,P=0.8), TNF-α(r=0.03,P=0.86),IFN-γ(r=0.17,P=0.38), IL-12(r=0.05,P=0.77)間均無明顯相關(guān)性。

圖1 RA患者(A)及健康人對(duì)照(B)DPT檢測(cè)的流式細(xì)胞分析

項(xiàng)目RA組(n=25)健康人對(duì)照組(n=25)tP年齡(歲)52．44±2．1451．20±1．930．430．67ESR(mm/h)35．56±6．2211．32±2．033．710．0005CRP(mg/L)22．94±6．892．30±0．242．990．0043RF(IU/mL)51．00±5．365．42±0．798．420．01ACCP(RU/mL)384．70±82．4732．63±7．634．250．01IL?6(pg/mL)58．95±10．4334．88±4．512．120．039TNF?α(pg/mL)143．20±13．7191．06±6．563．230．0023IFN?γ(pg/mL)224．90±40．51136．50±13．261．970．056IL?12(pg/mL)81．69±10．1461．44±3．941．830．073

3 討論

T細(xì)胞的異常激活一直被認(rèn)為是RA發(fā)病及進(jìn)展的關(guān)鍵。不同亞群的T細(xì)胞在RA發(fā)病中發(fā)揮不同的作用，以往多數(shù)研究關(guān)注TH1,TH17,Treg等T細(xì)胞亞群。近年來的研究表明，在某些疾病中DPT的表達(dá)水平上升，并可參與T細(xì)胞的活化[5, 7-8]。本研究檢測(cè)了RA患者外周血中PPT的水平，發(fā)現(xiàn)與健康人對(duì)照相比，PPT明顯升高，其表達(dá)水平與年齡、ACCP、RF無明顯相關(guān)性，而與ESR、CRP有明顯相關(guān)性。分析PPT水平與血清細(xì)胞因子的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)水平與IFN-γ、TNF-α、IL-12的含量無明顯相關(guān)性，但與IL-6存在明顯的相關(guān)性。

研究表明，在某些自身免疫性疾病中外周血DPT的比例升高，如多發(fā)性硬化患者外周DPT明顯高于健康人對(duì)照及其他自身免疫性疾病，經(jīng)過激素治療后的患者DPT水平下降，表明DPT可能參與多發(fā)性硬化病程中的免疫紊亂[6]。目前DPT在RA中的表達(dá)及臨床意義尚不明確，為此，本研究檢測(cè)了DPT的表達(dá)水平并分析其與臨床指標(biāo)及細(xì)胞因子的相關(guān)性，結(jié)果表明，DPT占CD3+T細(xì)胞的比例明顯高于健康人對(duì)照。年齡因素往往會(huì)影響一些細(xì)胞亞群的比例，而本研究中DPT的比例與年齡不相關(guān)，表明DPT的水平不受年齡因素的影響。ACCP及RF是診斷RA的重要臨床指標(biāo)，本研究中DPT的比例與ACCP及RF水平無相關(guān)性。但與ESR及CRP明顯相關(guān)，ESR及CRP是評(píng)估自身免疫性疾病活動(dòng)性的重要指標(biāo)，提示DPT可能與疾病的活動(dòng)及進(jìn)程相關(guān)。自身免疫性疾病往往伴隨外周血中細(xì)胞因子的異常表達(dá)，研究表明，RA患者血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)水平升高[9-11]。本研究檢測(cè)了RA患者血清中多種細(xì)胞因子的含量并分析與DPT的相關(guān)性，結(jié)果表明DPT與IL-6含量呈明顯的正相關(guān)；推測(cè)原因，DPT可能通過產(chǎn)生過量IL-6在RA致病中發(fā)揮重要作用。本研究尚存在一些不足，如由于納入的病例數(shù)量有限，RA患者均接受過抗炎治療，無法比較患者治療前后DPT的差異；此外，本研究?jī)H檢測(cè)了IL-6、TNF-α等4種細(xì)胞因子，下一步的研究我們將擴(kuò)大病例數(shù)量，比較治療前后DPT的差異并探索不同細(xì)胞因子與DPT表達(dá)的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制。

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(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.14

國家自然基金青年基金(81601765)。

徐學(xué)靜，1983年生，女，主管技師，碩士，主要從事免疫學(xué)研究。

王森，主管技師，博士，E-mail:slzw1985@163.com。

R593.22

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2017-06-01)