任振敏,蔡德豐,肖偉偉,徐剛,劉永秋,馬東禮

(深圳市兒童醫(yī)院檢驗科, 廣東深圳 518038)

·臨床實驗研究·

深圳地區(qū)小兒α和β地中海貧血基因類型分析*

任振敏,蔡德豐,肖偉偉,徐剛,劉永秋,馬東禮

(深圳市兒童醫(yī)院檢驗科, 廣東深圳 518038)

目的 分析深圳地區(qū)小兒地中海貧血的基因類型及突變頻率，為該疾病基因診斷及遺傳咨詢提供參考。方法 回顧性分析1 206例疑似地中海貧血患兒，采用跨越斷裂點PCR(Gap-PCR)檢測缺失型α地中海貧血，反向點雜交(RDB)技術檢測α和β地中海貧血基因點突變，巢式PCR檢測疑似HKαα的樣本并用基因測序驗證疑似罕見地中海貧血的樣本。結果 1 206例病例中共檢出927例地中海貧血(76.9%)，其中489例(40.5%)α地中海貧血，主要以--SEA/αα為主(與75.1%)；406例(33.7%)β地中海貧血，主要以IVS-2-654雜合子和CD41-42雜合子為主(分別占35%和32.5%)。檢出αβ復合型地中海貧血32例(2.7%)。此外，發(fā)現(xiàn)HKαα/ααQS、α-地中海貧血突變基因類型CD61(AAG→TAG)/--SEA、β地中海貧血基因突變類型CD5(CCT→C)各1例。結論 深圳地區(qū)地中海貧血患兒基因突變類型復雜多樣，且存在多例罕見病例。

α-地中海貧血；β-地中海貧血；基因型

地中海貧血(以下簡稱“地貧”)是一組極易導致致死、致殘的遺傳性血液病。近年來,為了防止重型地貧患兒的出生,深圳地區(qū)對于育齡人群的地貧進行大量的篩查研究[1-2]，但對患兒缺乏較為系統(tǒng)的地貧基因分析報道。因此，本研究旨在闡明深圳地區(qū)小兒的地貧基因攜帶情況，以期能夠更好地指導本地區(qū)地貧防控，并為該病的資料累積提供數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2016年3月至2017年2月于深圳市兒童醫(yī)院就診的門診、住院以及體檢的疑似地貧的初診患兒共1 206例，男739例，女467例，年齡(2.9±2.7)歲(7 d～14歲)。診斷根據(jù)《血液病診斷及療效標準》中“珠蛋白生成障礙性貧血診斷標準”以及《地中海貧血預防控制操作指南》中“α和β地中海貧血的臨床分類和臨床特征”[3-4]。納入標準：(1)患兒實驗室血液學指標異常(平均紅細胞體積MCV<80 fL和/或平均紅細胞血紅蛋白含量MCH<27 pg)；(2)Hb電泳提示有地貧(HbA2≤2.5%，提示α地貧可疑，可出現(xiàn)H帶或Bart′s帶；HbA2≥3.5%，提示β地貧可疑，可出現(xiàn)E帶)；(3)家族中有地貧的患兒、地貧基因攜帶者。排除標準：已經輸血治療的地貧患兒。本研究經我院醫(yī)學倫理學委員會批準，患兒的監(jiān)護人知情同意。

1.2 主要的儀器與試劑 XS-1000i全自動五分類血球計數(shù)儀(日本Sysmex公司)，Capillarys2全自動毛細管電泳分析儀(法國Sebia公司)，PCR擴增儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，5430

小型臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)，NanoDrop 2000c微量分光光度計(美國Thermo公司)，YN-H16恒溫雜交儀(深圳亞能公司)；全血DNA快速提取試劑盒和珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測試劑盒(深圳亞能公司)。

1.3 標本采集 采集疑似地貧患兒入院或門診時靜脈血2 mL，體檢患兒于體檢時采集靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，標本置-80 ℃保存。

1.4 地貧的實驗室篩查 用XS-1000i全自動五分類血球計數(shù)儀及配套試劑檢測紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)。Capillarys2全自動毛細管電泳分析儀及配套試劑檢測血紅蛋白A(HbA)、血紅蛋白A2(HbA2)、胎兒血紅蛋白(HbF)以及異常Hb。均按儀器及試劑盒說明書操作及結果判讀。

1.5 地貧基因檢測

1.5.1 基因組DNA提取 取200 μL的靜脈血標本，按照全血DNA快速提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA。Nanodrop2000c微量分光光度計檢測DNA濃度和純度，取濃度為50～100 ng/μL、吸光度(A260/280 nm)為1.7～1.9的樣本用于后續(xù)實驗。

1.5.2 Gap-PCR檢測缺失型α-地貧 缺失型α-地貧檢測試劑盒說明書操作檢測--SEA缺失、-α3.7缺失和-α4.2缺失 3種基因缺失。PCR總反應體積為25 μL，包括PCR反應液21 μL，DNA模板4 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：96 ℃ 5 min；98 ℃ 45 s，65 ℃ 90 s，72 ℃ 3 min，10個循環(huán)；98 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min，25個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶大小判斷基因型。以擴增出2 000、1 700、1 400、1 200、900 bp條帶分別對應于右側缺失(-α3.7)、無缺失、左側缺失(-α4.2)、東南亞缺失(--SEA)、泰國型缺失(--THAI)。

1.5.3 RDB-PCR檢測α和β地貧非缺失型點突變 按照α和β地貧非缺失型點突變檢測試劑盒說明書操作檢測3種α2珠蛋白基因突變類型[αWS(CD122)，CAC-CAG；αQS(CD125)，CTG-CCG；αCS(CD142)，TAA-CAA]和17種β珠蛋白基因突變類型[-28、-29、-30、-32、 CD14-15、CD17、CD26(βE)、CD27-28、CD31、 CD41-42、CD43、CD71-72、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、IVS-Ⅱ-654、CAP+1、起始密碼子(initiation condon)]。PCR總反應體積為25 μL，包括PCR反應液23 μL，DNA模板2 μL。循環(huán)參數(shù)：50 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產物通過雜交膜條斑點顯色確定基因型。結果判讀：野生斑點全部顯色且無異常突變斑點同時顯色為野生基因型；突變斑點及其相應野生斑點同時顯色為突變雜合子。β地貧突變：斑點顯色而相應野生斑點不顯色為突變純合子；α地貧突變：若α地貧基因檢測缺失，則為α點突變類型/α缺失型類型；若α地貧基因檢測未發(fā)現(xiàn)缺失，則為突變純合子。

1.5.4 罕見型地貧基因檢測 將試劑盒未檢出且懷疑HKαα及罕見地貧基因的樣本送至深圳亞能公司進行巢式PCR和基因測序檢測。測序結果與野生型序列進行比對分析，確定有無堿基突變。

1.6 統(tǒng)計學分析 用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)錄入、整理，采用描述性統(tǒng)計分析深圳地區(qū)小兒α和β地貧基因突變類型及頻率分布。

2 結果

2.1 地貧基因檢測結果 在1 206例疑似地貧的病例中，確診為地貧患兒927例(76.9%)。其中α地貧489例(40.5%)；β地貧406例(33.7%);αβ復合型地貧32例(2.7%)。

2.2 地貧基因類型的分布特征和突變頻率 489例α地貧中共檢出17種α地貧突變基因類型，以--SEA/αα為主(75.1%)。406例β地貧中共檢出24種突變基因類型，以IVS-2-654(C→T)雜合子和CD41-42(-TCTT)雜合子為主(分別占35%和32.5%)。32例αβ復合型地貧以IVS-2-654/N+--SEA/αα和IVS-2-654/N+-α3.7/αα為主，各占15.6%。地貧基因突變類型和構成比見表1，突變頻率見表2。

2.3 罕見地貧基因的檢測結果 巢氏PCR檢出1例罕見的HKαα/ααQS，見圖1?；驕y序檢出α-地中海貧血突變基因類型CD61(AAG→TAG)/--SEA、β地中海貧血基因突變類型CD5(CCT→C)各1例，見圖2。3例患兒的實驗室檢測結果見表3。

表1 地中海貧血基因類型與構成比

續(xù)表

表2 α和β地中海貧血基因突變頻率

注：*，突變頻率=等位基因數(shù)/被研究的染色體總數(shù)(1 206×2)。

注：A，第1輪GAP-PCR電泳結果,1～3泳道分別為陰性質控(DL 2000、HKαα或αααanti4.2)、陽性質控(HKαα或αααanti4.2)；B，第2輪GAP-PCR電泳結果,1～3泳道分別為DNA marker，陰性質控(HKαα)、陽性質控(αααanti4.2)； C，α突變結果為QS雜合。

圖1 罕見地貧基因類型的巢氏PCR檢測結果

3 討論

本研究共檢出17種α地貧和24種β地貧突變基因類型，雖然以輕型--SEA/αα、IVS-2-654(C→T)雜合、CD41-42(-TCTT)雜合為主，但是中間型、重型和復合型地貧也有檢出。HbH病(中間型)是出生患兒中最嚴重的α地貧類型，尤其是HbH-CS或QS多伴有較重的貧血癥狀[5]。本研究檢出HbH病55例，陽性率達11.2%，可能是由于HbH病常導致中、重度貧血，易被家長發(fā)現(xiàn)而就診有關。β地貧純合子和雙重雜合子一般呈中間型/重型地貧。本研究共檢出純合子11例，雙重雜合子4例，提示應加強本地區(qū)育齡人群β地貧的篩查，并對高危人群進行基因診斷，以避免該類患兒的出生。αβ復合型地貧血液學表現(xiàn)為β地貧的特點[6]，因此對已確診的β-地貧患兒要進行α地貧基因檢測，以免漏診。

注：A，CD61由野生型的AAG突變?yōu)門AG；B，β基因CD5由野生型CCT突變?yōu)镃，即框內標記(-CT)。

圖2 罕見地貧基因類型的測序檢測結果

除了常見的基因類型外，本研究還發(fā)現(xiàn)了HKαα地貧。HKαα于2005年被首次發(fā)現(xiàn)[7]，此基因型是在1條染色體上同時含有-α3.7和αααanti4.2融合基因片段，常規(guī)地貧基因檢測結果為-α3.7。劉朔婕等[8]通過巢式PCR檢測發(fā)現(xiàn)閩南地區(qū)HKαα在地貧疑似患者中的檢出率為0.11%， 與廣西、廣東地區(qū)該基因的檢出率類似[9]，印證了Shang等[10]關于HKαα并非罕見現(xiàn)象的推測。因此，為避免HKαα基因型誤診為-α3.7，要求檢驗人員遇到常規(guī)地貧基因檢測為-α3.7的樣本時，一定要結合表型與家系資料做好HKαα基因的檢測工作，避免漏診和誤診。本研究中發(fā)生的HKαα/ααQS在國內僅見姚亞超等[11]在2015年首次報道。此病例利用常規(guī)方法檢測時擴增出-α3.7條帶，如果是-α3.7缺失，那么在α突變的檢測中，QS的突變應該是純合子，與結果為雜合子不符，這種情況下要考慮存在HKαα基因。由于這種基因融合血液學表型比缺失型較輕，此病例的血液學結果顯示除了小細胞外其他均在參考范圍內，與陳文璟等[12]報道的HKαα /--SEA的臨床表象類似--SEA /αα相符。

此外，本研究在α地貧患兒中還發(fā)現(xiàn)了1例尚未見報道的CD61與--SEA雙重突變，此病例的常規(guī)基因檢測時只發(fā)現(xiàn)了--SEA/αα，而血常規(guī)結果表現(xiàn)為中度貧血，并且Hb電泳結果示存在HbH帶和Hb Bart′s帶，臨床提示為HbH病，所以考慮除了--SEA外，還存在其他的突變點。同時，在β地貧患兒中也發(fā)現(xiàn)了1例罕見的病例，其表現(xiàn)為輕度貧血，毛細管電泳證實其HbA2水平符合β地貧的特點，但常規(guī)檢測方法未發(fā)現(xiàn)基因突變，經測序證實為CD5β0雜合突變。

綜上所述，深圳地區(qū)的地貧基因型復雜多樣，可能與流動人口增多有關，但主要人群來自廣東省，故常見的地貧基因類型與廣東省的其他地區(qū)基本一致[13-15]。罕見地貧的檢出提示利用常規(guī)方法診斷地貧時，一定要結合血液學表型綜合分析，一旦遇到不相符的病例，要高度懷疑攜帶罕見地貧基因類型，重視罕見基因突變類型的檢測。

感謝深圳市亞能生物科技有限公司所提供的技術支持。

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(本文編輯：許曉蒙)

Genotype analysis of α-thalassemia and β-thalassemia in child patients of Shenzhen region

RENZhen-min,CAIDe-feng,XIAOWei-wei,XUGang,LIUYong-qiu,MADong-li

(DepartmentofClinicalLaboratory,ShenzhenChildren'sHospital,Shenzhen518038,Guangdong,China)

Objective To investigate the genotype and mutation frequency of thalassemia in child patients of Shenzhen region so as to provide evidences for the gene diagnosis and genetic counseling of thalassemia. Methods A total of 1 206 child patients suspected with thalassemia were retrospectively analyzed. The gene deletion of α-thalassemia was detected by Gap-PCR. The point mutations of α-thalassemia and β-thalassemia were determined by reverse dot blot(RDB)-PCR. The specimens suspected with HKαα and rare gene mutations were determined with nested PCR and gene sequencing, respectively. Results The detection rate of thalassemia was 76.9%(927/1 206). Among them, α-thalassemia accounted for 40.5%(489/1 206), and --SEA/αα was the most common gene mutation(75.1%); β-thalassemia accounted for 33.7%(406/1 206), and the main IVS-2-654(C→T) and CD41-42(-TCTT) heterozygous mutations accounted for 35% and 32.5%, respectively. In addition, there were 32(2.7%) β-thalassemia patients with α-thalassemia mutation, 1 patient with HKαα/ααQS, 1 α-thalassemia patient with CD61(AAG→TAG)/--SEA and 1 β-thalassemia patient with CD5(CCT→C). Conclusion The are complicated gene mutation types and rare gene mutations of thalassemia in child patients of Shenzhen region.

α-thalassemia; β-thalassemia; genotype

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.12

深圳病原體高通量基因測序技術工程實驗室項目(深發(fā)改[2014]1712號)。

任振敏，1981年生，女，主管技師，碩士，主要從事遺傳病的分子研究。

馬東禮，主任技師，E-mail：madl1234@126.com。

R33

A

2017-03-23)