王彥云，孫云，程威，蔣濤

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院遺傳醫(yī)學(xué)中心，南京 210004)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

新生兒篩查發(fā)現(xiàn)4例MCCD患兒的臨床和基因分析*

王彥云，孫云，程威，蔣濤

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院遺傳醫(yī)學(xué)中心，南京 210004)

目的 對4例經(jīng)由新生兒篩查發(fā)現(xiàn)的不同臨床類型的3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥(3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，MCCD)患兒，用尿氣相色譜質(zhì)譜和基因分析證實(shí)其診斷。方法 對新生兒篩查中C4DC+C5OH>0.6 μmol/L的新生兒召回復(fù)查，同時檢測其母親的C4DC+C5OH濃度。用尿氣相色譜質(zhì)譜分析對MCCD疑診病例進(jìn)行臨床診斷，再通過基因分析進(jìn)一步證實(shí)。結(jié)果 通過基因診斷確診MCCD 3例，包括MCCD患兒1例，父源性MCCD 1例，母源性MCCD 1例。另有1例臨床診斷的MCCD患兒經(jīng)基因檢測僅找到1個致病位點(diǎn)。結(jié)論 對新生兒篩查中發(fā)現(xiàn)的C4DC+C5OH增高的新生兒家系(包括母親和父親)應(yīng)行MS/MS檢測。疑似MCCD患者基因檢測僅發(fā)現(xiàn)1個致病位點(diǎn)時不要輕易否定MCCD的診斷，建議定期隨訪。

3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥；串聯(lián)質(zhì)譜；3-羥基異戊酰肉堿；母源性；雜合子

3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥(3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，MCCD)作為一種亮氨酸代謝障礙所致的常染色體隱性遺傳的有機(jī)酸代謝缺陷病，在1970年由Eldjarn等[1]首次報道。其致病基因?yàn)镸CCC1和MCCC2，致病基因的突變可以導(dǎo)致亮氨酸代謝途徑中的3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶(3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase，MCC)缺乏。目前MCCD在歐美國家某些最早開展串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem mass spectrometry，MS/MS)技術(shù)的地區(qū)發(fā)病率約為1/36 000[2]。我院遺傳醫(yī)學(xué)中心于2013年開始建立MS/MS技術(shù)檢測平臺并用于新生兒篩查，對于新生兒篩查中C4DC+C5OH超過0.6 μmol/L的新生兒召回復(fù)查，并常規(guī)對其母親進(jìn)行MS/MS檢測分析，已經(jīng)確診新生兒MCCD 1例、母源性MCCD 1例、父源性MCCD 1例和1例僅找到1個雜合突變的疑似患兒。針對母源性MCCD和雜合突變患者的研究較為罕見。本研究將新生兒篩查中發(fā)現(xiàn)的MCCD患兒的篩查指標(biāo)，臨床表現(xiàn)以及基因突變分析結(jié)果綜合分析，以期提高臨床工作者對此疾病的臨床認(rèn)識和診療水平。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2013年12月至2016年11月本實(shí)驗(yàn)室用MS/MS技術(shù)對65 451例出生3～5 d的新生兒進(jìn)行遺傳代謝病篩查，篩查樣本的采集嚴(yán)格按照新生兒采血規(guī)范執(zhí)行。對于初次篩查結(jié)果中C4DC+C5OH濃度>0.6 μmol/L的新生兒召回復(fù)查，并對其母親進(jìn)行MS/MS檢測分析。

1.2 其他有機(jī)酸代謝病的鑒別診斷 采用尿氣相色譜質(zhì)譜(Gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS)檢測技術(shù)(杭州博圣公司提供)對其他可導(dǎo)致C4DC+C5OH增高相關(guān)的有機(jī)酸代謝病(包括多種?；鵆oA羧化酶缺乏癥、3-甲基戊二酰CoA水解酶缺乏癥、3-羥-3甲基戊二酰CoA裂解酶缺乏癥和β-酮硫解酶缺乏癥)進(jìn)行鑒別診斷，均由本實(shí)驗(yàn)室完成。結(jié)果判讀：MCCD患兒尿片中可檢測到特異性的3-甲基巴豆酰甘氨酸(3- methylcrotonyl -glycine，3-MCG)和3-羥基異戊酸(3-hydroxy-isovalerate，3-HIVA)。

1.3 基因診斷 在知情同意的原則下，采集患兒及其父母外周血，EDTA-Na2抗凝，置-20 ℃凍存。采用基因組DNA提取試劑盒(美國Omega公司)提取患兒及其父母外周靜脈血的基因組DNA。

1.3.1 目的基因PCR擴(kuò)增 按照Ion AmpliSeqTMInherited Disease Panel 試劑盒(美國Life technologies公司)說明書操作對MCCD的致病基因MCCC1和MCCC2基因的所有外顯子進(jìn)行擴(kuò)增， PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，包括10 ng基因組DNA，1×Ion AmpliSeqTMHiFi Master Mix和1×Ion AmpliSeqTMPrimer Pool，ddH2O補(bǔ)足體積。循環(huán)參數(shù)：9 ℃酶激活2 min；99 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸8 min，共12個循環(huán)；10 ℃保存。PCR反應(yīng)完畢后加2 μL FuPa ReagentTM進(jìn)行引物消化，以去除部分引物。反應(yīng)條件：50 ℃ 10 min；55 ℃ 10 min， 65 ℃ 20 min。采用Ion XpressTMBarcode Adapters 1-16 Kit(批號：4471250，美國Life Technologies公司) 對樣品加上序列標(biāo)簽及Ion Torrent個體化基因組測序儀(personal genome machine，PGM)測序平臺兼容的測序接頭。

1.3.2 文庫構(gòu)建 采用Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0(批號：4475345，美國Life Technologies公司)進(jìn)行文庫構(gòu)建。制備的文庫平均片段大小約為300 bp。

1.3.3 乳液PCR和ISPs富集 采用Ion PGM 200 Xpress Template Kit(批號：4474280，美國Life Technologies公司)在Ion OneTouch儀(美國Life Technologies公司)上進(jìn)行乳液PCR，掛有模板的磁珠顆粒(Ion Sphere Particles，ISPs)富集在Ion OneTouch ES儀(美國Life Technologies公司)上完成。

1.3.4 Ion Torrent PGM平臺測序 采用Ion PGM 200 Sequencing Kit(批號：4474004，美國Life Technologies公司)及Ion Torrent 318芯片在Ion Torrent PGM平臺進(jìn)行測序反應(yīng)，共65個測序循環(huán)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 按照參考文獻(xiàn)[3-4]，采用Ion Torrent Suite v3.0軟件進(jìn)行Ion Torrent數(shù)據(jù)提取、序列比對及SNPs和Indels提取，得到的SNPs和indels經(jīng)dbSNP 137數(shù)據(jù)庫過濾后，檢索HGMD、LOVD等數(shù)據(jù)庫及Pubmed相關(guān)文獻(xiàn)，匹配已報道的致病位點(diǎn)，確定的致病突變及可疑致病突變均經(jīng)Sanger法測序驗(yàn)證。檢測MCCC1基因(NM_020166)19個外顯子的編碼區(qū)，共編碼726個氨基酸，外顯子編碼區(qū)覆蓋度：99.3%；檢測MCCC2基因(NM_022132)17個外顯子的編碼區(qū)，共編碼564個氨基酸，外顯子編碼區(qū)覆蓋度：100%?；蛟\斷均由本實(shí)驗(yàn)室完成。

2 結(jié)果

2.1 新生兒篩查及基因檢測結(jié)果 65 451例新生兒篩查中通過基因檢測確診3例MCCD患兒：MCCD患兒1例，父源性MCCD 1例，母源性MCCD 1例。另外還有1例患兒僅找到1個致病位點(diǎn)。

2.2 MCCD患兒和父源性MCCD檢測結(jié)果 新生兒初篩時C4DC+C5OH為5.64 μmol/L，C0正常，召回復(fù)查后C4DC+C5OH為5.79 μmol/L，尿氣相色譜質(zhì)譜檢測到高濃度的3-MCG和3-HIVA，符合MCCD臨床診斷?；純篗CCC2基因檢測到2個致病突變，均為c.659G>A純合突變。在其父親MCCC2基因上檢測到2個致病突變，分別為c.659G>A突變和c.422A>G突變，其中c.422A>G突變導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生p.Lys141Arg突變?；純耗赣H未檢測到異常突變。綜合基因檢測結(jié)果，患兒及其父親MCCD診斷明確，患兒的2個MCCC2等位基因c.659G>A突變，1個來源于父親，1個為新發(fā)突變。見表1。

2.3 母源性MCCD患者檢測結(jié)果 新生兒初篩時C4DC+C5OH為4.91 μmol/L伴C0降低，召回復(fù)查后C4DC+C5OH逐步下降，生后2月時下降76%，尿氣相色譜質(zhì)譜檢測基本正常。該母源性MCCD患者血液中C4DC+C5OH為14.7 μmol/L伴C0降低，尿氣相色譜質(zhì)譜檢測到高濃度的3-MCG和3-HIVA，符合MCCD臨床診斷。在患兒母親MCCC2基因上檢測到2個致病突變，均為c.1025G>A純合突變，新生兒MCCC2基因攜帶c.1025G>A突變，其父親未檢測到異常突變，綜合基因檢測結(jié)果，母源性MCCD診斷明確。見表2。

表1 MCCD患兒的串聯(lián)質(zhì)譜初篩、尿氣相色譜質(zhì)譜和基因檢測結(jié)果

注：C4DC+C5OH參考范圍為0.08～0.6 μmol/L；C0參考范圍為10～50 μmol/L。

表2 母源性MCCD患者及子女的串聯(lián)質(zhì)譜、尿氣相色譜質(zhì)譜和基因檢測結(jié)果

注：C4DC+C5OH參考范圍為0.08～0.6 μmol/L；C0參考范圍為10～50 μmol/L。

2.4 僅找到1個致病位點(diǎn)的MCCD疑似患兒檢測結(jié)果 新生兒初篩時C4DC+C5OH為1.29 μmol/L伴C0降低，召回復(fù)查后C4DC+C5OH未下降，尿氣相色譜質(zhì)譜檢測到高濃度的3-MCG和3-HIVA，符合MCCD臨床診斷。只在患兒的MCCC1基因上檢測到1個致病突變，為IVS6+2T>A突變。在患兒父親MCCC1基因上檢測到IVS6+2T>A突變，其母親未檢測到異常突變。該患兒定期至我院兒童保健中心體檢，生長發(fā)育正常。定期復(fù)查MS/MS提示C4DC+C5OH除了2次低于0.6 μmol/L，其余4次復(fù)查均波動于0.9 μmol/L上下，臨床仍然傾向MCCD可能。雖然該例患兒僅找到1個致病位點(diǎn)，但是由于MCCC1基因外顯子編碼區(qū)覆蓋度為99.3%，不能排除另一突變隱藏于非編碼區(qū)或其他不確定因素的可能。見表3。

表3 MCCD疑似患兒的串聯(lián)質(zhì)譜、尿氣相色譜質(zhì)譜和基因檢測結(jié)果

注：C4DC+C5OH參考范圍為0.08～0.6 μmol/L；C0參考范圍為10～50 μmol/L。

3 討論

基因診斷是MCCD診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，MCCD致病基因已明確為MCCC1和MCCC2，MCCC1定位3q25-27，含19個外顯子，長度為2 580 bp，編碼725個氨基酸；MCCC2定位5q12-q13.1，含有17個外顯子，長度為2 304 bp，編碼563個氨基酸，我院遺傳醫(yī)學(xué)中心針對MCCD設(shè)計的基因檢測panel覆蓋了MCCC1基因99.3%外顯子編碼區(qū)和MCCC2基因100%外顯子編碼區(qū)。

根據(jù)國內(nèi)專家共識，MCCD的新生兒篩查和診斷已有相對規(guī)范化的程序，目前其爭議和難點(diǎn)在于MCCD的臨床分型。MCCD的臨床表現(xiàn)差異很大，當(dāng)前臨床分型主要為：良性MCCD、惡性MCCD和母源性MCCD，其中，大部分為良性MCCD[5]。良性MCCD屬于無癥狀型，臨床上的處理措施主要為臨床隨訪，定期復(fù)查血液中C4DC+C5OH和C0及尿液中3-MCG和3-HIVA濃度，如果隨訪中C4DC+C5OH異常升高并伴有C0降低時，補(bǔ)充左卡尼汀口服治療。惡性MCCD病例目前國內(nèi)未見報道，結(jié)合文獻(xiàn)和相關(guān)書籍，認(rèn)為惡性MCCD主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、抽搐、昏迷和肌張力異常等非特異性的消化道和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，針對性的治療措施尚存爭議。第3種臨床類型母源性MCCD，即母親為MCCD患者，其血液中升高的C5OH可以通過母乳或胎盤傳輸給新生兒，導(dǎo)致其在新生兒篩查時血C5OH暫時性升高，脫離母體影響后逐步降至正常[6]?；谶@部分新生兒的篩查結(jié)果，才能“回顧性”發(fā)現(xiàn)母親是MCCD患者。

本研究中1例成年男性MCCD患者因?yàn)槠浜蟠男律鷥汉Y查而被間接檢出并確診，既往針對MCCD可疑陽性召回復(fù)查時多強(qiáng)調(diào)“母親一同召回復(fù)查”，但是對于新生兒父親的召回不夠重視，通過本研究中母源性MCCD和新生兒父親為MCCD病例的存在,提醒臨床工作者遇到C5OH指標(biāo)升高的新生兒一定要注意家系的MS/MS檢測分析，而不能僅僅著眼于母親復(fù)查。本研究中的MCCD患者拒絕定期復(fù)查MS/MS和GC/MS和補(bǔ)充左卡尼汀口服治療，通過其家屬隨訪至今暫無臨床癥狀。該例父源性MCCD在父親MCCC2基因上檢測到2個致病突變，其中c.422A>G突變暫無相關(guān)報道，遺憾的是父親的C4DC+C5OH檢測結(jié)果暫缺，假設(shè)父親C4DC+C5OH偏高，則傾向c.422A>G為可疑致病突變，相反，如果父親C4DC+C5OH正常，那就可以間接判斷c.422A>G是致病突變的可能就很小。

另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)1例疑似MCCD患兒僅找到1個致病位點(diǎn)，這個病例中，患兒和父親都具有IVS6+2T>A致病突變，患兒C4DC+C5OH持續(xù)偏高，遺憾的是患兒父親的C4DC+C5OH檢測結(jié)果暫缺，假設(shè)父親C4DC+C5OH正常，那重點(diǎn)要考慮其他不確定的因素，例如本實(shí)驗(yàn)室采用的二代測序方法只能檢測所檢測基因范圍內(nèi)的點(diǎn)突變、微小缺失突變和微小插入突變，不能檢測大片段缺失或插入突變，如果該患兒為大片段缺失，可進(jìn)一步完善高密度寡核苷酸探針微陣列檢測確診。反之父親C4DC+C5OH濃度與患兒接近，則傾向“雜合子”MCCD的可能。鑒于該患兒定期隨訪的MS/MS和GC/MS檢測結(jié)果，臨床仍傾向于MCCD，對于這一類人群，建議定期隨訪，如果隨訪中出現(xiàn)C0降低時，可以補(bǔ)充左卡尼汀口服治療。

綜上所述，新生兒篩查中C4DC+C5OH濃度升高的新生兒召回復(fù)查時建議一并對其家系，包括父親和母親均進(jìn)行MS/MS檢測分析，有利于發(fā)現(xiàn)和排除母源性[7]、父源性MCCD患者，同時臨床上遇到一些非特異性的消化道和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者應(yīng)積極完善MS/MS檢測，避免MCCD等遺傳代謝病的漏診。另外，必須指出，在臨床工作中發(fā)現(xiàn),MCCD患者由于暫無明顯臨床癥狀，患兒及家長的治療依從性較差，容易失訪，目前臨床上傾向?yàn)榱夹訫CCD的這部分患者后期是否會出現(xiàn)其他更為嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)無法預(yù)測，而且已有的研究均提示MCCD表型和基因型之間無明確的相關(guān)性，難以通過C5OH濃度[8]和基因型預(yù)測臨床表型，所以這部分患者只能繼續(xù)隨訪。不論是確診的MCCD患者還是雜合子，當(dāng)其伴有C0降低時，可以口服補(bǔ)充左卡尼汀治療，因此，詳細(xì)告知病情，定期隨訪和復(fù)查MS/MS、GC/MS很重要。

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(本文編輯：許曉蒙)

Clinical and genetic analysis of 4 child patients with 3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency (MCCD) identified by neonatal screening

WANGYan-yun,SUNYun,CHENGWei,JIANGTao

(CenterforGeneticMedicine,MaternityandChildHealthCareHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210004,Jiangsu,China)

Objective To analyze 4 child patients with 3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency (MCCD) identified by neonatal screening and confirmed by urine gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) and genetic analysis. Methods Newborns whose C4DC+C5OH concentration was above 0.6 μmol/L in newborn screening were recalled for rescreening, and the C4DC+C5OH concentrations in their mothers were detected. The child patients suspected with MCCD were further confirmed by urine GC/MS and genetic analysis. Results Three child patients were definitely diagnosed as MCCD by genetic analysis, including 1 MCCD, 1 maternal MCCD and 1 paternal MCCD. The other 1 child patient suspected with MCCD had only one allele in MCCC1. Conclusion The mother and father of newborns with elevated C4DC+C5OH identified in neonatal screening should routinely perform MS / MS testing. When only one pathogenic locus is found in the suspected MCCD child patients by genetic analysis, they should be followed up regularly.

3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency; tandem mass spectrometry; 3-hydroxy-isovaleryl-carnitine; maternal; heterozygote

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.11

江蘇省臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)項目(BL2012039)；江蘇省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研項目課題(H201343)；南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展重點(diǎn)項目(ZKX14041)；南京市科技發(fā)展計劃(201405041)。

王彥云，1984年生，女，技師，碩士研究生，從事遺傳代謝病檢驗(yàn)專業(yè)。

蔣濤，主任技師，E-mail:jiangzhang784@163.com。

R446.1

A

2017-04-27)