童永清，顧劍，鄭紅云，劉航，李鋒，李艷

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

·液體活檢與臨床實(shí)驗(yàn)研究·

基于3′/5′端表達(dá)不平衡策略的熒光定量PCR法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者血漿游離循環(huán)RNA中ALK融合基因*

童永清，顧劍，鄭紅云，劉航，李鋒，李艷

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

目的 分析非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者血漿游離循環(huán)RNA(cfRNA)中的ALK融合基因的表達(dá)水平，為指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥提供依據(jù)。方法 選取經(jīng)高通量測(cè)序驗(yàn)證的已知ALK融合基因的NSCLC患者13例、ALK融合基因陰性的NSCLC患者16例和30例體檢健康者，采集各組血液樣本并分離血漿cfRNA，用熒光定量PCR檢測(cè)各組ALK基因3′端第20外顯子(E20)和5′端3外顯子(E3)的表達(dá)量，并計(jì)算ALK融合基因的表達(dá)水平。結(jié)果 已知ALK融合基因的NSCLC患者、ALK融合基因陰性的NSCLC患者和體檢健康者血漿cfRNA中ALK融合基因表達(dá)水平分別為278.3(45.3，987.4)，4.08(0.38，9.04)，3.77(0.34，8.37)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=29.93,P<0.01)；組間兩兩比較結(jié)果表明，已知ALK融合基因的NSCLC患者血漿中ALK融合基因的表達(dá)水平高于ALK融合基因陰性的NSCLC患者或體檢健康者(U分別為0，0，P均<0.01)，而后兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=232,P=0.86)。結(jié)論 基于3′/5′端表達(dá)不平衡策略的熒光定量PCR法可以快速檢測(cè)NSCLC患者血漿cfRNA中ALK融合基因。

非小細(xì)胞肺癌；血漿游離循環(huán)RNA；融合基因；4-間變淋巴瘤激酶

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者存在多種ALK融合基因，如EML4-ALK、KIF5B-ALK、KLC1-ALK和BIRC6-ALK等[1]。新的ALK融合基因如BCL11A-ALK等也相繼被發(fā)現(xiàn)，為中晚期NSCLC患者使用克唑替尼或色瑞替尼等靶向治療藥物提供了有效的分子依據(jù)[2]。目前ALK融合基因的檢測(cè)標(biāo)本多為手術(shù)切除的腫瘤組織、活檢組織或惡性胸水等，但晚期或經(jīng)放化療治療的NSCLC患者往往無(wú)法獲得上述組織標(biāo)本，造成ALK融合基因的檢測(cè)困難。本研究擬建立基于3′/5′端表達(dá)不平衡策略的熒光定量PCR法檢測(cè)NSCLC患者血漿游離循環(huán)RNA(cfRNA)中ALK融合基因，可以避免因組織標(biāo)本難以獲得而導(dǎo)致熒光原位雜交(FISH)或逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(qRT-PCR)等等造成檢測(cè)失敗[3]，為NSCLC患者靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年1月至2017年3月于武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤科就診且按照中國(guó)原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)診斷為NSCLC的住院患者236例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)中晚期的NSCLC患者，(2)經(jīng)高通量測(cè)序檢測(cè)ALK融合基因；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)EGFR基因突變陽(yáng)性;(2)KRAS基因突變陽(yáng)性。篩選獲取符合標(biāo)準(zhǔn)的NSCLC患者29例，男18例，女11例，年齡43.6～71.3歲，中位年齡53.8歲。其中ALK融合基因陽(yáng)性的NSCLC患者13例，男7例，女6例，年齡45.8～69.4歲，中位年齡55.7歲。ALK融合基因陰性的NSCLC患者16例，男11例，女5例，年齡43.6～71.3歲，中位年齡52.9歲。隨機(jī)選取同期就診于我院體檢中心的體檢健康者30例，男16例，女14例，年齡42.3～75.2歲，中位年齡45.7歲。

1.2 主要儀器及試劑 血漿游離RNA分離試劑盒(批號(hào)：73404，德國(guó)凱杰生物公司)；cDNA第一鏈合成試劑盒(批號(hào)：6210A，中國(guó)大連寶生物公司)；Nanodrop2000c微量分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛生物公司)；LightCycler 480熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)。

1.3 樣本采集 NSCLC患者于確診且檢測(cè)了ALK融合基因后采集，體檢健康者于體檢時(shí)采集，均采集空腹靜脈血5 mL，EDTA-K2抗凝，按照血漿游離RNA分離試劑盒說(shuō)明書(shū)操作分離血漿cfRNA，Nanodrop2000c微量分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(A260/280 nm)值，取A260/280 nm值為1.8～2.1的RNA樣本，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-80 ℃保存。

1.4 普通PCR及熒光定量PCR 根據(jù)3′/5′表達(dá)不平衡策略[4]，采用Primer Express 3.01熒光定量PCR軟件分別設(shè)計(jì)ALK基因的第20外顯子(E20)

和第3外顯子(E3)區(qū)域的引物和探針，并以ACTB基因第3外顯子(E3)為內(nèi)參基因(表1)，引物由美國(guó)賽默飛世爾科技公司合成。PCR反應(yīng)體系總反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL /molALK基因E20、E1或ACTB基因E3上、下游引物，各0.5 μL，PCR mix 10 μL，cDNA模板1 μL，去離子水8 μL。普通PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖DNA凝膠電泳分析。熒光定量PCR總反應(yīng)體系為30 μL，包括5 μmol/LALK基因E20、E1和ACTB基因E3上、下游引物各1 μL，2.5 μmol/LALK基因E20、E1和ACTB基因E3的探針各1 μL，PCR mix 15 μL，cDNA模板2 μL，去離子水4 μL。熒光定量PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 45 s，共45個(gè)循環(huán)，在62 ℃采集熒光信號(hào)并記錄。ALK基因E20和E3表達(dá)水平采用2-△Ct法計(jì)算，公式：2-△Ct=2-[Ct(ALKE20)/(ALKE3)-Ct(ACTB)]。ALK融合基因的表達(dá)水平采用2-△△Ct計(jì)算，公式：2-△△Ct=2-[(Ct(ALKE20)- Ct(ACTB)-(Ct(ALKE3)-Ct(ACTB)]。

表1 熒光定量PCR檢測(cè)ALK基因的引物與探針

2 結(jié)果

2.1ALK基因3′/5′端表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果 普通PCR的瓊脂糖DNA凝膠電泳結(jié)果顯示，ALK基因的3′/5′端擴(kuò)增片段大小與設(shè)計(jì)大小一致(圖1A)，提示設(shè)計(jì)的引物均能有效地進(jìn)行擴(kuò)增。進(jìn)一步用熒光定量PCR檢測(cè)3′端和5′端ALK基因表達(dá)，結(jié)果亦表明設(shè)計(jì)的引物均能有效進(jìn)行擴(kuò)增(圖1B和1C)。

注：A，普通PCR檢測(cè)ALK基因3′端和5′端結(jié)果；B～D分別為熒光定量PCR檢測(cè)ALK基因3′端、5′端及ACTB基因結(jié)果。

圖1 普通PCR及熒光定量PCR檢測(cè)ALK基因3′端和5′端及ACTB基因的表達(dá)

2.2 NSCLC患者外周血血漿游離RNA中ALK融合基因檢測(cè) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，已知ALK融合基因的NSCLC患者、ALK融合基因陰性的NSCLC患者和體檢健康者中血漿cfRNA中ALK融合基因表達(dá)水平分別為278.3(45.3，987.4)，4.08(0.38，9.04)，3.77(0.34，8.37)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=29.93，P<0.01)；組間兩兩比較結(jié)果表明，已知ALK融合基因的NSCLC患者血漿中ALK融合基因的表達(dá)水平高于ALK融合基因陰性的NSCLC患者或體檢健康者(U分別為0，0，P均<0.01)，而后兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=232,P=0.86)。

3 討論

研究表明，在NSCLC患者中ALK融合基因的頻率約3%～7%[4]，超過(guò)90%的NSCLC患者不能從使用克唑替尼或色瑞替尼等酪氨酸激酶抑制劑中獲益[5]。因此，在使用抑制劑前，應(yīng)該先進(jìn)行ALK融合基因的檢測(cè)，ALK融合基因陽(yáng)性的NSCLC患者方可使用[6]。傳統(tǒng)的qRT-PCR檢測(cè)ALK融合基因是將上、下游引物分別設(shè)計(jì)在融合基因中的2個(gè)不同基因上，1對(duì)引物只能檢測(cè)特定的融合基因的亞型，同一融合基因的不同亞型之間難以通過(guò)同一對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)，且不能檢測(cè)已知融合基因新的亞型和新的融合基因。本研究建立的基于3′端和5′端的表達(dá)水平不平衡策略的qRT-PCR方法，通過(guò)檢測(cè)ALK基因在3′端和5′端的表達(dá)差異，分析二者之間的不平衡現(xiàn)象，預(yù)測(cè)是否存在ALK融合基因，該方法盡管不能確定是ALK基因與哪個(gè)基因發(fā)生了融合或融合的亞型，但可以檢測(cè)出所有ALK融合基因，即只要存在ALK融合基因就可以檢測(cè)到，無(wú)論是已知的ALK融合基因，還是新的ALK融合基因。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)3′端和5′端的表達(dá)水平不平衡策略的qRT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ALK陽(yáng)性的NSCLC患者血漿中ALK融合基因表達(dá)水平為278.3(45.3，987.4)，明顯高于ALK陰性的NSCLC患者血漿中ALK融合基因表達(dá)水平4.08(0.38，9.04)，并且能有效地將二者區(qū)分開(kāi)，二者之間不存在重疊區(qū)域，檢測(cè)結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果一致，提示3′端和5′端的表達(dá)水平不平衡策略的qRT-PCR方法檢測(cè)NSCLC患者血漿中ALK融合基因較為可靠。Wang等[4]通過(guò)該方法檢測(cè)了NSCLC患者腫瘤組織中ALK融合基因的表達(dá)，證實(shí)與其他檢測(cè)方法如FISH、高通量測(cè)序、染色體核型分型等結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明基于3′端和5′端的表達(dá)水平不平衡策略的qRT-PCR方法預(yù)測(cè)NSCLC患者血漿中ALK融合基因的可靠性。

綜上所述，本研究建立的基于3′端和5′端的表達(dá)水平不平衡策略的qRT-PCR方法檢測(cè)NSCLC患者血漿中ALK融合基因，有效地彌補(bǔ)了因腫瘤組織不足、缺乏或治療過(guò)程中靶向藥物耐藥性監(jiān)測(cè)及療效評(píng)價(jià)時(shí)無(wú)法采集腫瘤組織的問(wèn)題。同時(shí)該方法與腫瘤靶基因高通量測(cè)序、FISH等比較，其檢測(cè)時(shí)間更短，對(duì)儀器設(shè)備和人員要求更低，便于臨床推廣。然而，本研究收集的樣本例數(shù)較少，且只收集到了EML4-ALK融合基因陽(yáng)性的NSCLC患者樣本，此外，僅初步評(píng)價(jià)了通過(guò)3′端和5′端的表達(dá)水平不平衡策略可以檢測(cè)EML4-ALK融合基因，但沒(méi)有驗(yàn)證該策略是否可以檢測(cè)KIF5B-ALK、KLC1-ALK和TFG-ALK等形式的ALK融合基因。因此，需要進(jìn)一步收集不同形式的ALK融合基因及其亞型，便于驗(yàn)證該方法的靈敏度、特異性和檢測(cè)的線性范圍等，為臨床檢測(cè)NSCLC患者血漿中ALK融合基因提供依據(jù)。

[1]van de Krogt JA, Vanden Bempt M, Finalet Ferreiro J,etal.ALK-positive anaplastic large cell lymphoma with the variant RNF213-, ATIC- and TPM3-ALK fusions is characterized by copy number gain of the rearrangedALKgene[J]. Haematologica. 2017. pii: haematol.2016.146571

[2]Tian Q, Deng WJ, Li ZW. Identification of a novel crizotinib-sensitiveBCL11A-ALKgene fusion in a nonsmall cell lung cancer patient[J]. Eur Respir J， 2017，49(4). pii: 1602149.

[3]Kim H, Shim HS, Kim L,etal. Guideline recommendations for testing ofALKgene rearrangement in lung cancer: a proposal of the Korean Cardiopulmonary Pathology Study Group[J]. Korean J Pathol, 2014,48(1):1-9.

[4]Wang R, Pan Y, Li C,etal. The use of quantitative real-time reverse transcriptase PCR for 5′ and 3′ portions ofALKtranscripts to detectALKrearrangements in lung cancers[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(17):4725-4732.

[5]Santarpia M, Daffinà MG, D′Aveni A,etal. ASpotlight on ceritinib in the treatment ofALK+ NSCLC: design, development and place in therapy[J]. Drug Des Devel Ther, 2017,11:2047-2063

[6]Kerr KM, Lopez-Rios F. Precision medicine in NSCLC and pathology: how doesALKfit in the pathway? [J].Ann Oncol, 2016, 27(Suppl 3):iii16-iii24.

(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.07

國(guó)家自然基金(81502087)。

童永清，1975年生，男，副主任醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)槟[瘤個(gè)體化醫(yī)療與臨床分子診斷。

李艷，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:yanlitf@gmail.com。

R730.43

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2017-06-07)