張愛燕，陳程，吳曉丹，任天麗，顧兵，黃紅宇，韓志君，高明珠

(1.徐州醫(yī)科大學醫(yī)學技術學院，江蘇徐州 221004；2.南京醫(yī)科大學附屬無錫第二人民醫(yī)院a.檢驗科，b.風濕科，江蘇無錫 214002)

·液體活檢與臨床實驗研究·

多發(fā)性肌炎/皮肌炎患者血清中外泌體的分離鑒定*

張愛燕1，陳程1，吳曉丹2a，任天麗2b，顧兵1，黃紅宇2a，韓志君2a，高明珠2a

(1.徐州醫(yī)科大學醫(yī)學技術學院，江蘇徐州 221004；2.南京醫(yī)科大學附屬無錫第二人民醫(yī)院a.檢驗科，b.風濕科，江蘇無錫 214002)

目的 從多發(fā)性肌炎/皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis，PM/DM)患者外周血血清中分離鑒定外泌體(exosome)，并進行初步的蛋白質研究。方法 用ExoQuickTM試劑盒分離純化PM/DM患者血清exosome；透射電鏡觀察其形態(tài)特征，Nanosight可視型納米顆粒分析儀檢測粒徑大小分布情況；western blot鑒定exosome的表面標志物CD9，CD81，F(xiàn)lotillin-2；BCA法對其所攜帶的蛋白質進行定量分析；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)初步分析其蛋白質組分。結果 透射電鏡下患者血清exosome呈圓形或橢圓形膜性小囊泡，直徑分布范圍92±67 nm；western blot結果表明，PM/DM血清來源的exosome存在表面標志物CD9、CD81、Flotillin-2；BCA法測定PM/DM患者exosome總蛋白濃度為14.68(6.00，32.55)μg/μL，健康組exosome總蛋白濃度為14.09(8.00，23.28)μg/μL,SDS-PAGE顯示兩組血清exosome均在Mr(×103)為55～70處有高豐度蛋白質富集，在Mr(×103)為40～55處存在差異條帶。結論 成功從PM/DM患者的外周血中分離出血清exosome,并為尋找差異蛋白質提供實驗依據(jù)。

多發(fā)性肌炎/皮肌炎；外泌體；分離；鑒定

多發(fā)性肌炎/皮肌炎(polymyositis/dermatomyositis，PM/DM)是一種自身免疫性結締組織疾病，目前已知的肌炎自身抗體陽性率均不高，最具特異性的抗Jo-1抗體陽性率為20%～30%，其他抗合成酶抗體更低[1]。臨床上經(jīng)常將早期DM誤診為接觸性皮炎或其他皮炎。外泌體(exosome)完整的包膜結構確保了其內(nèi)部DNA，miRNA及蛋白質等大量遺傳信息的穩(wěn)定性，exosome自身的特異性蛋白已成為目前疾病研究的熱點[2]。研究發(fā)現(xiàn)，exosome可激活機體B細胞和T細胞引發(fā)自身免疫反應[3]。多項研究表明，exosome內(nèi)部所含的蛋白質能夠作為自身免疫性疾病診斷的理想標志物[4-5]。因此，對exosome的蛋白質鑒定將大大提高PM/DM疾病的診斷效能。本實驗采用ExoQuickTM試劑盒從PM/DM患者血清中提取exosome并對其相關蛋白質進行初步分析以尋找差異蛋白質，為發(fā)現(xiàn)PM/DM新型診斷標志物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑材料 高速離心機(德國Eppendorf公司)，Tecnai12透射電子顯微鏡(美國FEI公司)，NanoSight LM10-HSBF system (英國Malvern Instruments公司)，ExoQuickTM試劑盒(cat#4478360，美國Life 公司),BCA法測定蛋白質濃度試劑盒(碧云天公司)，全自動數(shù)碼凝膠成像儀(上海Tanon公司)，酶聯(lián)儀(美國Thermo Fisher公司)；鼠抗人GAPDH抗體和兔抗人CD9抗體(英國Abcam公司)，鼠抗人CD81抗體和鼠抗人Flotillin-2抗體(美國Santa cruz公司)。

1.2 標本來源 收集2016年9月于無錫市第二人民醫(yī)院體檢健康者24例，男10例，女14例，年齡41～70歲，中位年齡51歲；另收集2014年4月至2016年11月在無錫二院風濕科確診為PM/DM的患者43例，男18例，女25例，年齡42～77歲，中位年齡59歲。PM/DM患者均符合Bohan/Peter診斷標準[6-7]。排除標準：合并其他自身免疫病或伴有感染、或嚴重的肝腎功能不全患者。各研究對象(體檢健康者于體檢時，PM/DM患者于入院時)空腹采集靜脈血5 mL，室溫靜置30 min，3 000×g離心15 min，去除血細胞及細胞碎片等，取上層血清至新的Ep管中，按比例加入PMSF裂解液(血清：PMSF=100∶1)，置-80 ℃凍存。

1.3 血清exosome的分離 提取血清標本2 000×g離心 30 min，去除剩余殘片，參照Kibria等[8]實驗方法，按照ExoQuickTM試劑盒說明書分離exosome,置-80 ℃凍存。

1.4 透射電鏡觀察exosome形態(tài) 上述步驟分離出來的exosome懸液樣本置于油紙上，將銅網(wǎng)扣置于樣本上吸附10 min。滴加pH 6.5～7的20 g/L磷鎢酸溶液20 μL于銅網(wǎng)上，室溫負染3 min，濾紙吸干液體。自然干燥或用數(shù)顯紅外烘烤燈烘干后，采用透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.5 Nanosight納米顆粒分析儀測定exosome粒徑和濃度 所提取的血清exosome稀釋到合適的濃度(1.0×108/mL～2.5×109/mL)，充分混勻后取適量上機，采用Stokes-Einstein方程計算數(shù)據(jù)并分析。

1.6 western bolt檢測 將150 μL血清中提取的exosome重懸于450 μL的RIPA 裂解液中，超聲波裂解，采用BCA法進行蛋白質定量，根據(jù)562 nm處所測得的吸光度(A)值繪制標準曲線并計算蛋白質濃度，稀釋使得每孔上樣等量總蛋白，煮沸5 min，每孔等體積上樣15 μL進行電泳(恒壓80 V 20 min后更換為120 V 1 h)，濕轉移至PVDF膜，用含50 g/L脫脂牛奶的TBS/T和BSA分別室溫封閉1 h；分別加入兔抗人CD9，鼠抗人CD81和Flotillin-2抗體(1∶600稀釋) 4 ℃溫育過夜，0.5% Tween 20洗膜3次，分別加入相應的兔、鼠IgG二抗(1∶1 000稀釋),搖床溫育2 h，洗膜3次，采用ECL顯影定影并觀察顯色條帶。

1.7 SDS-PGAE初步分析exosome蛋白質組分 利用SDS-PGAE電泳觀察PM/DM患者和健康組血清exosome以及兩組去除exosome的血清上清液，電泳結束后取出分離膠，25 g/L考馬斯亮藍R-250染色1 h，利用沸水快速脫色5min后于搖床上過夜，第2天用Tanon全自動數(shù)碼凝膠成像儀觀察并拍照。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩獨立樣本間的比較采用t檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 形態(tài)學鑒定 提取的血清exosome沉淀呈淡黃色，脂質樣；于電鏡下觀察呈圓形或橢圓形雙層膜性小囊泡，直徑分布約為92±67 nm，包膜完整，有單個或濃集存在，形態(tài)上兩者并沒有肉眼可見的區(qū)別。見圖1。

2.2 PM/DM患者外周血exosome粒徑和濃度分析 電鏡下示exosome顆粒呈不規(guī)則布朗運動，Nanosight納米顆粒分析儀檢測結果顯示，其直徑約為92±67 nm，峰值為53 nm，并可測得顆粒的真實濃度為13.04×108particles/mL。見圖2。

2.3 Exosome的總蛋白質濃度測定 根據(jù)吸光度(A)值繪制標準曲線：Y=0.013 1X+0.085 1，R2=0.998 8。計算得出PM/DM患者exosome總蛋白質濃度為14.68(6.00,32.55)μg/μL，體檢健康組exosome總蛋白質濃度為 14.09(8.00，23.28)μg/μL。

注：A，PM/DM患者exosome；B，體檢健康者exosome。

圖1 電鏡下兩組血清exosome的形態(tài)特征

注：橫坐標表示粒徑大小(nm)，縱坐標表示濃度Concentration (E6:particles/mL)。

圖2 Nanosight分析儀檢測exosome的直徑分布

2.4 Exosome表面標志物的鑒定 western bolt驗證結果表明，exosome表面存在表面蛋白質標志物分子,其分子量Mr(×103)分別為CD9(25),CD81(25)，F(xiàn)lotillin-2(46)。見圖3。

圖3 western blot檢測exosome表面的標志物

2.5 Exosome的蛋白質組分初步分析 SDS-PGAE電泳結果顯示，PM/DM組和體檢健康組exosome的蛋白質分布大致相同，均在分子量Mr(×103)為55～70處有富集，但兩組血清提取的exosome的蛋白質組分較去exosome的上清有所不同。血清exosome在分子量Mr(×103)40～55處有條帶，但去exosome上清此處沒有條帶，兩者在分子量Mr(×103)55～70處的蛋白質豐度有明顯區(qū)別。而PM/DM組和體檢健康組血清exosome蛋白在Mr(×103)40～55處亦存在條帶濃度差異。見圖4。

注：1，蛋白質Maker；2，PM/DM患者exosome；3， PM/DM患者去exosome上清；4，體檢健康組exosome；5，體檢健康組去exosome上清。

圖4 SDS-PAGE分析exosome的蛋白質組分

3 討論

目前國內(nèi)外研究自身免疫性疾病的標本主要為患者血清中的蛋白質或miRNA，該領域對exosome的研究仍處于初期階段，所以探討PM/DM患者體內(nèi)exosome蛋白表達的報道少見[9]。Exosome自身具有特異性蛋白質，且不含有血液中的高豐度蛋白質，檢測干擾小，具有較好的特異性，加之其具有完整的包膜結構，使其在血液循環(huán)中也能夠有相對的穩(wěn)定性，若是能在exosome內(nèi)找到異常的差異蛋白質將大大提高PM/DM的診斷效能[10]。本實驗采用ExoQuickTM試劑盒從PM/DM患者血清中提取exosome，經(jīng)電鏡觀察，納米儀器分析以及western blot驗證exosome表面標志物分子等證實了本實驗成功從血清中提取了exosome。

Exosome可由幾乎所有的細胞分泌而來，在人體血液中的含量極為豐富，PM/DM患者產(chǎn)生自身免疫應答時體內(nèi)exosome的分泌量是否相應增多，其相對應的表面蛋白質是否差異表達？仍是學者爭議的焦點。本研究通過對兩組exosome蛋白質定量分析，發(fā)現(xiàn)雖然PM/DM組總蛋白濃度離散程度比體檢健康組大，但兩者exosome總蛋白濃度差異無統(tǒng)計學意義。推測可能原因是：(1)實驗樣本基數(shù)不夠大；(2)兩者總蛋白沒有明顯差異，而是部分蛋白質存在差異表達。SDS-PAGE電泳顯示血清exosome在Mr(×103)40～55處有條帶，但去exosome上清在此處沒有條帶，表明exosome相較血清有獨特的表達條帶，并且血清exosome蛋白在Mr(×103)55～70處的豐度明顯高于去exosome上清，而兩組血清exosome蛋白在Mr(×103)40～55間也顯示有條帶濃度差異。結果表明兩組exosome部分蛋白質存在差異表達，因此我們推測PM/DM患者與體檢健康組的exosome分泌量沒有明顯區(qū)別(不排除樣本基數(shù)不夠大的問題)，但是exosome所表達的蛋白質有所差異。另有研究[11]發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤患者的血漿exosome高表達黑素瘤生物學標志物MIA，S100B和酪氨酸酶相關蛋白2(TYRP2)，說明exosome可高表達某些疾病已知的特征性蛋白質。目前已知的PM/DM患者血清特異性蛋白抗體，如抗PM-Scl抗體的分子量為Mr(×103)20～110，抗Jo-1抗體為Mr(×103)50[12]，這些處于本實驗所提的exosome蛋白表達豐度之間的抗體，是否同樣可能與exosome免疫調(diào)節(jié)PM/DM存在潛在的關系？我們下一步將擴大樣本量探討上述兩組差異表達蛋白質間的聯(lián)系并通過iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術[13]篩選患者血清exosome內(nèi)具體與PM/DM相關的差異蛋白，以尋找PM/DM新型診斷標志物。

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(本文編輯：許曉蒙)

Isolation and identification of serum exosomes in the patients with polymyositis/dermatomyositis

ZHANGAi-yan1,CHENCheng1,WUXiao-dan2a,RENTian-li2b,GUBing1,HUANGHong-yu2a,HANZhi-jun2a,GAOMing-zhu2a

(1.SchoolofMedicalTechnology,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,Jiangsu; 2a.DepartmentofLaboratoryMedicine, 2b.DepartmentofRheumatology,WuxiSecondHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Wuxi214002,Jiangsu,China)

Objective To isolate and identify exosomes from serum samples of the patients with polymyositis / dermatomyositis (PM/DM), and analyze their protein composition preliminarily. Methods Exosomes from serum samples of the patients with PM/DM were isolated and purified by the ExoQuickTMkit. The morphological characteristics and particle size of exosomes were determined by transmission electron microscope (TEM) and NanoSight analyzer, respectively. The surface markers of exosomes such as CD9, CD81 and Flotillin-2 were identified by western blot. The concentration and composition of exosome protein were determined by the BCA method and SDS-PAGE, respectively. Results The exosomes from serum samples of PM/DM patients displayed round or oval vesicles with membrane structure under TEM, and their diameter range was about (92±67) nm. western blot showed that these exosomes expressed CD9, CD81 and Flotillin-2. The total protein concentrations of exosomes in the patients with PM/DM and healthy controls were 14.68 (6.00,32.55) μg/μL and 14.09 (8.00,23.28) μg/μL, respectively. SDS-PAGE showed that high-abundance proteins enriched in 55-70 kD in both PM/DM patients and healthy controls, and that there were different bands in 40-55 kD between them. Conclusion Exosomes are isolated from serum samples of the patients with PM/DM successfully, and their protein concentration and composition are analyzed preliminarily, which provides the experimental evidences for further finding differential proteins.

polymyositis/dermatomyositis; exosome; isolation; identification

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.06

國家自然科學基金(81501503)；無錫市衛(wèi)計委醫(yī)學科研項目(YGZXM1501)；南京醫(yī)科大學科技發(fā)展基金面上項目(2014NJMU062)。

張愛燕，1994年生，女，本科在讀，研究方向：臨床免疫學研究。

韓志君，E-mail:zjhan1125@163.com；高明珠，E-mail:gaomingzhujewel@163.com。

R446.61

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2017-03-15)