丁春明，楊政權(quán)，欒菊，金勝男

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，檢驗醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，浙江溫州 325035)

·述評·

循環(huán)游離DNA檢測及其臨床應(yīng)用進(jìn)展*

丁春明，楊政權(quán)，欒菊，金勝男

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，檢驗醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，浙江溫州 325035)

循環(huán)游離DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)是指存在于人體血液循環(huán)中的、游離于細(xì)胞外的高度片段化DNA。在特定情況下(如腫瘤患者、孕婦、接受器官移植的患者等)，一小部分來自“異源性”細(xì)胞的cfDNA(如腫瘤細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、或供體細(xì)胞)可以作為基因檢測的標(biāo)志物。基于cfDNA檢測的“液態(tài)活檢”技術(shù)在產(chǎn)前診斷、腫瘤的篩查、早期診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估等多個方面受到極大的關(guān)注。該文就cfDNA的產(chǎn)生與特征、檢測方法、檢測指標(biāo)、臨床應(yīng)用等作一總結(jié)及論述。

循環(huán)游離DNA;循環(huán)腫瘤DNA;腫瘤;臨床應(yīng)用;液態(tài)活檢

循環(huán)游離DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)是指存在于人體血液循環(huán)中的、游離于細(xì)胞外的微量內(nèi)源性及異源性DNA片段，包括游離基因組DNA和游離線粒體DNA等。1948年，Mandel和Métais首次報道外周血中存在cfDNA，但直到1994年從腫瘤患者外周血中檢出RAS基因片段，cfDNA的重要意義才逐漸被人們所重視。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療計劃和個體化醫(yī)療時代的到來，越來越多的研究者和臨床醫(yī)生將基于cfDNA檢測的“液態(tài)活檢”應(yīng)用于產(chǎn)前診斷、腫瘤疾病的篩查、早期診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估等多個方面，視其為補(bǔ)充或替代組織活檢的新方法。因此，本文就cfDNA檢測的技術(shù)方法、指標(biāo)及臨床應(yīng)用進(jìn)展作一論述。

1 cfDNA的產(chǎn)生與特征

1.1 cfDNA的產(chǎn)生 cfDNA釋放的具體機(jī)制尚不明確。一般認(rèn)為cfDNA起源于細(xì)胞的壞死、凋亡[1]。壞死的細(xì)胞被巨噬細(xì)胞等吞噬，釋放經(jīng)過消化的DNA到血液中形成cfDNA。在實體瘤中，由于腫瘤組織的快速生長，因養(yǎng)分供應(yīng)不足等原因發(fā)生細(xì)胞死亡，直接釋放DNA片段到外周血中。據(jù)Diehl等[2]估計，一個腫瘤重量約100 g的患者體內(nèi)約含有3×1010個腫瘤細(xì)胞，每天將有約3.3%(1×109個)腫瘤細(xì)胞的DNA釋放到外周血中。這些來源于腫瘤的cfDNA稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，攜帶有腫瘤細(xì)胞的遺傳信息。

1.2 cfDNA的特征 DNA甲基化分析表明大多數(shù)健康人的cfDNA來源于血液中的細(xì)胞[3]。cfDNA的半衰期從16 min到2.5 h不等，通常經(jīng)核酸酶作用和腎臟清除[4]。高通量測序結(jié)果顯示cfDNA的長度分布主要集中在165 bp左右[5]，相當(dāng)于纏繞在核小體上的DNA與組蛋白H1接頭長度之和。來自于腫瘤的ctDNA長度比非腫瘤來源的cfDNA短[5]。而來自于胎兒的cfDNA長度比孕婦的cfDNA長度短。血漿中的cfDNA片段平均長度與尿液中cfDNA長度不同，尿液cfDNA相對更短。

據(jù)文獻(xiàn)報道，健康人血漿cfDNA濃度約為1～10 ng/mL[6]，而腫瘤患者的cfDNA水平相對增加。ctDNA能夠在多種腫瘤患者外周血中檢出，其濃度與腫瘤大小、分期等相關(guān)。ctDNA的濃度在不同患者間的差異也可能很大。在癌癥早期患者中，ctDNA可能在cfDNA中占極小比例，絕對濃度也很低，檢測難度很大。

2 cfDNA的檢測方法

cfDNA檢測的方法可以根據(jù)主要技術(shù)原理的不同分為基于實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)技術(shù)、數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)技術(shù)、高通量測序(又稱二代測序，next generation sequencing，NGS)技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(簡稱飛行質(zhì)譜，matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技術(shù)的方法和其他方法，它們的檢測原理、靈敏度、優(yōu)缺點互不相同(表1)。

表1 cfDNA檢測技術(shù)比較[7-8]

注：PNA Clamp-PCR (peptide nucleic acids clamp PCR, 肽核酸-鉗制熒光PCR); LNA/DNA-PCR (locked nucleic acids/DNA chimera PCR, 鎖核酸/DNA嵌合PCR); COLD-PCR(complete enrichment coamplification at lower denaturation temperature PCR, 低變性溫度復(fù)合PCR); ARMS(amplification refractory mutation system, 突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)); ddPCR(droplet digital PCR, 微滴式數(shù)字PCR); BEAMing(beads, emulsion, amplification, magnetics, 數(shù)字PCR-流式技術(shù)); WGS(whole-genome sequencing,全基因組測序); Digital karyotyping(數(shù)字化核型分析)；PARE(personalized analysis of rearranged ends, 個體化分析重排末端)；Targeted Sequencing(靶向測序); TAm-Seq(tagged-amplicon deep sequencing, 標(biāo)記擴(kuò)增深度測序); SAFE-SeqS(safe-sequencing system, 安全測序系統(tǒng)); CAPP-Seq (Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing, 深度測序腫瘤個體化建檔法); iDES(integrated digital error suppression, 集成數(shù)字錯誤抑制); WES(whole-exome sequencing, 全外顯子測序); cSMART(Circulating Single-Molecule Amplification and Resequencing Technology, 環(huán)化單分子擴(kuò)增和重測序技術(shù))。

2.1 基于qPCR技術(shù)的cfDNA檢測方法 qPCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)實時檢測每個循環(huán)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后產(chǎn)物總量的方法。因其操作簡便、靈敏度高、檢測成本低等優(yōu)勢，目前應(yīng)用比較廣泛。例如，Punnoose等[9]對25例Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者的研究表明，基于TaqMan技術(shù)的qPCR在88%(7/8)的患者中可檢出至少一種基因(KRAS、BRAF、PIK3CA、EGFR)突變。Duan等[10]利用ARMS方法對94例非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者進(jìn)行EGFR突變檢測，結(jié)果顯示ctDNA與組織樣品檢測結(jié)果一致性達(dá)80% (75/94,P<0.01)，敏感性和特異性分別為50%(19/38)、100%(49/49)。目前，cobas EGFR Mutation Test v2和therascreen EGFR RGQ PCR Kit這2種基于ARMS進(jìn)行血漿中EGFR突變檢測的qPCR方法已經(jīng)分別獲得美國FDA和歐洲藥監(jiān)局的審批，進(jìn)入臨床應(yīng)用。其聲明的檢測限低至每mL血漿25～100個拷貝或檢出低至0.05%的突變。其他在qPCR技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良的新技術(shù)，如COLD-PCR、LNA/DNA-PCR、PNA clamp-PCR也相繼被報道，其檢測限為0.01%～0.1%不等(表1)，進(jìn)一步推廣前還需要更多大規(guī)模臨床實驗的驗證。

2.2 基于dPCR技術(shù)的cfDNA檢測方法 與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)不同，dPCR將一個樣品稀釋形成大量微小反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，大多數(shù)反應(yīng)中不含有或者只含1個靶分子。反應(yīng)探測到熒光信號計為陽性，未探測到熒光信號計為陰性，再通過泊松分布分析，對樣品實際模板濃度進(jìn)行定量計算。dPCR不受擴(kuò)增曲線Ct值、內(nèi)參基因或標(biāo)準(zhǔn)曲線等因素的影響，因此比傳統(tǒng)qPCR技術(shù)的準(zhǔn)確性、靈敏性和重復(fù)性更高，檢測限可達(dá)0.001%[11]。BEAMing技術(shù)是一種結(jié)合數(shù)字PCR與流式技術(shù)的方法，由Dressman等[12]首先提出，其主要包括小珠(Bead)、乳濁液(Emulsion)、擴(kuò)增(Amplification)、磁性(Magnetic)4個部分，因此稱為BEAMing。PCR反應(yīng)產(chǎn)物可以通過流式細(xì)胞儀檢測熒光標(biāo)記做出評估，檢測限可達(dá)0.01%。Thress等[13]用BEAMing技術(shù)對72份EGFR敏感突變陽性的肺癌患者血漿進(jìn)行檢測，其檢測敏感性達(dá)82%～87%，特異性達(dá)100%。由于血漿中ctDNA的拷貝數(shù)和突變比例都很低，在大量野生型序列背景下檢出目標(biāo)突變序列難度較大。dPCR 通過對DNA分子稀釋、分區(qū)獨立擴(kuò)增，降低了野生基因型的背景干擾信號，使低豐度的目的序列能夠被檢出，特別適用于低拷貝數(shù)突變的檢測，成為目前ctDNA單個點突變分析的金標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 基于高通量測序技術(shù)的cfDNA檢測方法 隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展及成本的不斷降低，高通量測序(NGS)技術(shù)在腫瘤檢測領(lǐng)域顯現(xiàn)出很高的應(yīng)用價值。根據(jù)是否選定目標(biāo)序列，NGS可分為非靶向測序和靶向測序。非靶向測序主要是進(jìn)行全基因組測序(WGS)。靶向測序是通過選定一些特定的基因進(jìn)行測序，該方法的關(guān)鍵是目的基因的富集。根據(jù)富集策略的不同，目前用于cfDNA的NGS主要有靶向擴(kuò)增子測序(Targeted Amplicon Seq，TAS)和目標(biāo)序列捕獲測序(Targeted Capture Sequencing，TCS)。

TAS技術(shù)通過多重PCR擴(kuò)增富集目標(biāo)序列，其代表性方法為TAm-Seq和cSMART(表1)。TCS技術(shù)利用探針對目標(biāo)序列進(jìn)行雜交捕獲富集，典型代表技術(shù)為Newman等[14]發(fā)明的深度測序腫瘤個體化建檔法(CAPP-Seq)。有文獻(xiàn)報道TAm-Seq方法對ctDNA突變頻率的檢測限可低至2%，特異性超過97%，該方法可以發(fā)現(xiàn)腫瘤中未知突變[15]。cSMART技術(shù)對兩端添加了特定標(biāo)簽序列的全部cfDNA片段進(jìn)行環(huán)化，在突變位點附近利用背靠背式的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增完成目的序列的富集，隨后進(jìn)行高通量測序。該技術(shù)檢測ctDNA突變準(zhǔn)確性可達(dá)99%，檢測限低至0.03%[16]。CAPP-Seq技術(shù)利用數(shù)據(jù)庫篩選肺癌相關(guān)突變基因位點，所包含的基因序列覆蓋超過96%的患者，構(gòu)建ctDNA文庫進(jìn)行超深度測序(>10 000×)，對Ⅰ期和Ⅱ～Ⅳ期NSCLC的檢測敏感性分別達(dá)到50%和100%，特異性達(dá)96%[14]。但由于不同國家、種族的患者腫瘤相關(guān)基因突變頻率的差異、腫瘤類型的不同等原因，需要根據(jù)特定區(qū)域、特定種族、特定腫瘤類型的患者選擇需檢測的基因，同時需要大量臨床研究的驗證，目前尚未普遍應(yīng)用。

2.4 基于質(zhì)譜技術(shù)的cfDNA檢測方法 上世紀(jì)九十年代末期，飛行質(zhì)譜技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于核酸檢測領(lǐng)域，如單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、產(chǎn)前診斷、DNA甲基化分析、基因表達(dá)等[17]。該技術(shù)通過檢測核酸的分子量差異實現(xiàn)對目的基因堿基變化的鑒定和分析，代表性的產(chǎn)品有Agena OncoCartaTM試劑盒(用于19個癌癥相關(guān)基因超過230種突變位點檢測)，LungCarta?肺癌體細(xì)胞突變檢測試劑盒(用于評估26種基因中的250多種體細(xì)胞突變)，以及最新的UltraSEEKTM試劑盒(可以對結(jié)直腸癌、肺癌中包括EGFR、KRAS、PIK3CA等基因多個突變位點進(jìn)行低至0.1%的檢測)。Mosko等[18]用飛行質(zhì)譜方法對122例晚期皮膚癌或黑色素瘤患者的突變進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)熱點突變BRAFV600E在ctDNA與組織中的一致率為76.4%(55/72)，BRAFV600E突變檢測飛行質(zhì)譜技術(shù)與ARMS技術(shù)一致率為100%(39/39)，顯示出飛行質(zhì)譜技術(shù)較高的準(zhǔn)確性。飛行質(zhì)譜技術(shù)具有通量高、準(zhǔn)確性好、數(shù)據(jù)分析簡單、價格便宜等優(yōu)點(表1)，儀器已于2014年通過美國FDA認(rèn)證，有望在臨床檢測中進(jìn)一步推廣。

2.5 其他cfDNA檢測技術(shù) 隨著精準(zhǔn)醫(yī)療計劃的實施，基于PCR、突變富集或高通量測序技術(shù)的新型ctDNA檢測方法不斷被報道，如InPlex技術(shù)、COLD-PCR突變富集技術(shù)、SCODA富集突變位點的單堿基突變分析技術(shù)、基于擴(kuò)增子的FAST-SeqS和mFAST-SeqS測序技術(shù)等，這些技術(shù)方法敏感性不同、檢測限各異(表1)，目前僅限于文獻(xiàn)報道，尚需大規(guī)模試驗的驗證。

3 cfDNA的檢測指標(biāo)

3.1 基因突變 cfDNA中腫瘤相關(guān)突變基因與腫瘤的診斷、治療決策、耐藥監(jiān)測、復(fù)發(fā)和預(yù)后評估密切相關(guān)。如結(jié)直腸癌患者KRAS基因的檢測，NSCLC患者EGFR基因突變的檢測對腫瘤臨床診斷和治療具有直接的指導(dǎo)作用[8]。Bettegowda等[19]研究表明，在結(jié)直腸癌患者的外周血中，KRAS基因突變檢測敏感性為87.2%，特異性達(dá)99.2%，且突變含量與患者的生存時間存在負(fù)相關(guān)。因此，分析cfDNA中腫瘤相關(guān)ctDNA可以為惡性腫瘤患者提供治療指導(dǎo)、復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后評估等方面的信息。

3.2 DNA甲基化 在許多腫瘤中，抑癌基因啟動子區(qū)域高甲基化狀態(tài)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。包括乳腺癌、胃癌、卵巢癌在內(nèi)的多項研究表明，ctDNA與腫瘤組織甲基化狀態(tài)呈現(xiàn)良好的一致性。Wedge等[20]研究發(fā)現(xiàn)，LINE1在預(yù)后不良的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者組織和cfDNA中呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，是彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后不良的高風(fēng)險因素。因此，分析cfDNA甲基化狀態(tài)可能為腫瘤診斷與治療提供潛在標(biāo)志物。

3.3 拷貝數(shù)變異 拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)是指染色體區(qū)域的擴(kuò)增或缺失，是癌癥中一種常見的基因變異，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在一項12萬孕婦參與的cfDNA無創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究中，檢出CNVs的10例無任何腫瘤癥狀的母親在檢測結(jié)束后的平均16周內(nèi)均發(fā)現(xiàn)罹患癌癥，其中1例患者在癌癥根治后再次進(jìn)行ctDNA檢測，CNVs改變已全部消失[21]。該研究提示，對cfDNA進(jìn)行CNVs檢測可能輔助腫瘤的診斷，在腫瘤的早期診斷和治療監(jiān)測中具有重要意義。

3.4 微衛(wèi)星不穩(wěn)定分析 微衛(wèi)星是1種由2～6 bp重復(fù)堿基組成的、具高度多態(tài)性、可遺傳、不穩(wěn)定的DNA序列，由于重復(fù)單位的擴(kuò)增或缺失而造成的微衛(wèi)星長度改變稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)。雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)是指位于一對同源染色體上的2個等位基因中的1個(或其中部分核苷酸片段)發(fā)生缺失，MSI的改變造成等位基因的1個基因喪失部分或全部序列，也可以導(dǎo)致LOH。MSI和LOH是腫瘤的重要特征性改變。微衛(wèi)星不穩(wěn)定是絕大多數(shù)遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)記，與結(jié)直腸癌變有關(guān)，高達(dá)85%的結(jié)直腸癌患者存在LOH。研究表明，約35%的結(jié)直腸癌患者cfDNA中可檢測到微衛(wèi)星變異，在至少表現(xiàn)1 個微衛(wèi)星變異的結(jié)直腸癌患者中，cfDNA相應(yīng)變異的檢出率達(dá)30%左右[22]。這些數(shù)據(jù)提示，分析cfDNA MSI改變可能有助于腫瘤的診斷。

4 cfDNA檢測的臨床應(yīng)用

4.1 無創(chuàng)產(chǎn)前診斷 1997 年Lo等在《Lancet》雜志發(fā)表了用PCR的方法從產(chǎn)婦的外周血中擴(kuò)增出了Y染色體來源的DNA片段，開啟了cfDNA用于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(Non-invasive prenatal testing，NIPT)的先河[23]。常規(guī)胎兒染色體非整倍體疾病的產(chǎn)前診斷方法主要為血清學(xué)篩查、絨毛及羊膜腔穿刺。血清學(xué)篩查方法檢出率低，假陽性率和假陰性率均較高。穿刺檢測雖然被譽(yù)為產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是操作較復(fù)雜、檢測報告周期長且具有一定的致流產(chǎn)風(fēng)險。利用孕婦外周血中的cfDNA進(jìn)行染色體非整倍體篩查具有高檢出率(>99%)、低假陽性率、操作簡單、風(fēng)險低等優(yōu)點，因而漸漸成為NIPT的首選。目前，NIPT已經(jīng)廣泛用于21、18、13三體和性染色體異常的診斷。

4.2 腫瘤用藥檢測 采用腫瘤組織進(jìn)行基因檢測一直被認(rèn)為是腫瘤臨床基因診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但部分腫瘤患者由于種種原因(比如高齡患者無法耐受有創(chuàng)檢查，或者某些腫瘤的解剖位置不易活檢)無法獲得組織樣品而確診。多數(shù)患者由于腫瘤時空異質(zhì)性、多次組織活檢困難等因素，無法實時、動態(tài)檢測耐藥突變，導(dǎo)致難以及時調(diào)整或更換治療方案。利用ctDNA作為腫瘤檢測和治療的輔助手段，在臨床上逐漸受到重視。多項研究表明，分析cfDNA中攜帶有腫瘤突變信息的ctDNA能夠用于評估患者腫瘤負(fù)荷，有效指導(dǎo)腫瘤患者用藥選擇與預(yù)后監(jiān)測。當(dāng)ctDNA濃度增加時，患者預(yù)后不良[24]。腫瘤患者血漿ctDNA水平高于健康人對照和良性疾病患者。腫瘤分期越晚期，ctDNA濃度越高[25]。同時，ctDNA檢測可以用于評估腫瘤患者術(shù)后微小殘留灶的存在[25]。

NSCLC約占肺癌總數(shù)的80%，對于有表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)激活突變的NSCLC患者，酪氨酸激酶受體抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)治療具有明顯的臨床療效。Karachaliou等[26]的研究表明，ctDNA檢出EGFR激活突變的患者服用厄洛替尼(EGFR-TKI)后無進(jìn)展生存期延長。在EGFR突變的NSCLC患者中，EGFR-TKIs獲得性耐藥最常見于T790M突變。服用TKIs藥物的中國NSCLC患者中，約50%患者會出現(xiàn)該耐藥位點的突變。一項對患者系列血ctDNA進(jìn)行全外顯子測序的研究發(fā)現(xiàn)，用藥后的6例患者腫瘤突變譜發(fā)生變化，包括耐藥相關(guān)突變頻率的增加和新發(fā)突變的產(chǎn)生[27]。在該項研究中，1例進(jìn)展的患者ctDNA中可檢出T790M突變的產(chǎn)生。因此，檢測血漿ctDNA突變，可以實時反映體內(nèi)該腫瘤基因狀態(tài)的變化，且取樣方便，是監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)、指導(dǎo)治療、監(jiān)測療效和獲得性耐藥的一種無創(chuàng)手段。當(dāng)前，比較公認(rèn)的策略是在進(jìn)行組織活檢之前先進(jìn)行ctDNA液態(tài)活檢，ctDNA的陽性檢測結(jié)果可以替代組織活檢；對ctDNA檢測陰性的患者再行組織活檢。目前美國FDA已擬批準(zhǔn)ctDNA用于攜帶有EGFR突變的NSCLC患者TKI藥物厄洛替尼和奧西替尼用藥選擇的檢測。我國CFDA也于2015年批準(zhǔn)，在腫瘤組織樣本不可評估的條件下，可采用外周血ctDNA作為補(bǔ)充標(biāo)本評估EGFR基因突變。

4.3 腫瘤早期篩查 腫瘤的早期診斷能夠幫助臨床進(jìn)行腫瘤疾病的早期干預(yù)，從而改善患者的預(yù)后。目前已有多項研究報道利用ctDNA進(jìn)行腫瘤疾病的早期診斷。血漿ctDNA檢測可以于臨床癥狀顯現(xiàn)前發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)基因變化[28]。如在結(jié)直腸癌早期診斷中，SEPT9甲基化在Ⅰ期結(jié)直腸癌患者血清中陽性率達(dá)42.9%，且陽性率隨分期增加而升高[29]。2016年4月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)血漿SEPT9甲基化檢測篩查結(jié)直腸癌試劑盒進(jìn)入臨床應(yīng)用。因此，cfDNA甲基化檢測可能為腫瘤早期診斷提供新的方法。

5 cfDNA臨床應(yīng)用的瓶頸

基于循環(huán)核酸檢測的“液態(tài)活檢”在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷和腫瘤檢測臨床應(yīng)用廣泛，在過去的5-10年間受到極大的關(guān)注。隨著技術(shù)的進(jìn)步和研究的深入，cfDNA檢測取得了長足的進(jìn)展。但是，目前尚有許多問題等待我們進(jìn)一步探索和規(guī)范。

首先是標(biāo)準(zhǔn)化問題，包括分析前、分析中和分析后3步。分析前因素如樣品的收集時間、收集過程、存儲條件、處理方法、患者基本情況等都可能對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響；分析中因素如cfDNA的提取、分析平臺和技術(shù)的差異等也會產(chǎn)生不同的試驗結(jié)果；分析后因素如結(jié)果的處理、判定、解讀等也在不同程度上影響著檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前，由于實驗平臺、技術(shù)、分析手段等缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同實驗室給出的檢測結(jié)果通常存在差異，造成檢測結(jié)果互認(rèn)和比較的障礙。因此，實現(xiàn)cfDNA檢測標(biāo)準(zhǔn)化是當(dāng)前的首要問題。

其次，由于cfDNA濃度低，并且存在大量野生型DNA干擾，如何實現(xiàn)cfDNA的有效提取和準(zhǔn)確檢測成為一大挑戰(zhàn)。目前，各種商品化試劑盒之間cfDNA提取效率存在差異，各種提取方法缺乏大規(guī)模的驗證。高靈敏度和高特異性的檢測平臺是cfDNA檢測技術(shù)發(fā)展的必要條件。但是，無論是dPCR、NGS還是qPCR、飛行質(zhì)譜技術(shù)，均存在靈敏度不足或假陽性的問題。這些技術(shù)發(fā)展和儀器設(shè)備制造的局限性，需要隨著技術(shù)的更新和研發(fā)的深入逐步解決。

最后，現(xiàn)有檢測標(biāo)志物的不足也是制約cfDNA檢測的一大瓶頸。目前cfDNA的檢測多局限于文獻(xiàn)報道，不同研究者選定的標(biāo)志物不同，缺乏對特定標(biāo)志物的大規(guī)模臨床驗證。同時，由于東、西方人群存在基因突變頻率的差異，西方國家的研究數(shù)據(jù)難以直接應(yīng)用于東方人群，因此迫切需要從國家層面著手，開發(fā)新的診斷標(biāo)志物，檢驗候選標(biāo)志物的敏感性和特異性，開展大規(guī)模、多中心的臨床試驗，為cfDNA標(biāo)志物的臨床應(yīng)用提供足夠的循證醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)。總之，基于cfDNA的液態(tài)活檢在大量基礎(chǔ)與臨床研究支撐下、在檢測技術(shù)與設(shè)備的不斷發(fā)展中，必將在未來的精準(zhǔn)醫(yī)療中發(fā)揮越來越重要的作用。

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(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.02

國家自然科學(xué)基金(81672922)；核酸分子診斷學(xué)浙江省創(chuàng)新學(xué)科。

丁春明，1975年生，男，研究員，博士，博士研究生導(dǎo)師，研究方向為核酸分子診斷，E-mail:cmdingchina@qq.com。

R446；R73

A

2017-07-02)