楊超君+王笑笑+黃蕓

[摘要] 目的 依據(jù)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的穩(wěn)定性機(jī)理，結(jié)合清火梔麥片的制法，以君藥穿心蓮主要成分穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯為指標(biāo)，優(yōu)化HPLC法測(cè)定清火梔麥片中穿心蓮含量的提取條件。 方法 分析比較不同提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間及提取溫度對(duì)HPLC法測(cè)定穿心蓮含量結(jié)果的影響。 結(jié)果 與其他提取溶劑相比，甲醇對(duì)穿心蓮的提取效率較高，且提取液的雜質(zhì)含量更低；提取中超聲前是否冷浸、加冰或常溫對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響不大；提取時(shí)超聲1 h較超聲30 min的提取效果更好；而在低溫時(shí)，隨著溫度的上升有助于主要成分的提取，但當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí)發(fā)生降解。 結(jié)論 以甲醇為溶媒，常溫超聲1 h時(shí)提取純度和提取效率較優(yōu)。

[關(guān)鍵詞] 清火梔麥片；穿心蓮內(nèi)酯；脫水穿心蓮內(nèi)酯；甲醇；超聲

[中圖分類號(hào)] R284 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）22-0039-04

[Abstract] Objective To optimize the extraction conditions of HPLC for the determination of andrographis paniculata in Qinghuo Zhimai tablets， based on the stability mechanism of andrographolide and dehydroandrographolide combined with the preparation method of Qinghuo Zhimai tablets， with the indicator of the main ingredient of herbs andrographis including andrographolide and dehydrated andrographolide. Methods The effects of different extraction solvents， extraction methods， extraction time and extraction temperature on the determination of andrographis paniculata by HPLC were analyzed and compared. Results Compared with other extraction solvents， the extraction efficiency of methanol to andrographis paniculata was higher， and the impurity content of the extract was lower. Whether cold dip， adding ice，room temperature or not had little effect on the detection result. The extraction effect of ultrasound for 1 h was better than that of ultrasound for 30 min. While at low temperature， the increase of temperature was helpful to the extraction of the main components， but the degradation occurred when the temperature exceeded 60℃. Conclusion The extraction purity and extraction efficiency were better when using methanol as the solvent at room temperature for 1 h.

[Key words] Qinghuo Zhimai tablets； Andrographolide； Dehydroandrographolide； Methanol； Ultrasound

清火梔麥片是由穿心蓮、梔子和麥冬三味藥組成，取部分穿心蓮和麥冬粉碎成細(xì)粉、剩余穿心蓮和梔子經(jīng)水煎煮、濃縮成稠膏，最后加入細(xì)粉混勻壓制而成的具有清熱解毒、涼血消腫功效的中藥片劑[1]。其主要成分穿心蓮又名一見(jiàn)喜、苦草、四方草、印度草等，為爵床科植物的干燥地上部分。味苦、性寒，歸心、肺、大腸、膀胱經(jīng)?！度荼静荨酚涊d其有“清熱解毒、消炎退腫，治療咽喉炎、痢疾、高熱等功效”，為清熱解毒類常用中草藥，素有“中藥抗生素”的美譽(yù)[2，3]。故現(xiàn)清火梔麥片常用于臨床咽喉腫痛、急性扁桃體炎、發(fā)熱、頭痛、牙痛、目赤、心火旺盛、睡眠不佳等癥狀的患者。

隨著清火梔麥片的臨床應(yīng)用，有關(guān)其分析方法的研究也日益增多。早年其有效成分的測(cè)定方法有比色法、重量法等[3]，近年多以薄層掃描法[4，5]、高效液相色譜法（HPLC）等為主[6-9]，此外隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展新型色譜法以及質(zhì)譜法等也用于其測(cè)定[10， 11]。但因HPLC法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，含量測(cè)定準(zhǔn)確且重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，HPLC法測(cè)定清火梔麥片有效成分的方法研究較多。其檢測(cè)多用紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器等[3，12，13]，且隨著分析方法的進(jìn)一步探索可同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定2～3種有效成分[14-18]。故本文主要是依據(jù)穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的穩(wěn)定性機(jī)理，從提取方式、提取溶媒以及熱穩(wěn)定性的角度出發(fā)研究清火梔麥片中穿心蓮含量測(cè)定的影響因素?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器；UPT-Ⅱ-10T型制水器，成都超純科技有限公司；Mettler XS-205型電子天平；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，工作頻率40 kHz，功率200 W，昆山市超聲儀器有限公司。endprint

1.2 樣品與試劑

清火梔麥片，批號(hào)：140505，廣西圣特藥業(yè)有限公司；批號(hào)120601，廣西金海堂藥業(yè)有限責(zé)任公司；批號(hào)：110208，廣西圣特藥業(yè)有限公司；穿心蓮內(nèi)酯，批號(hào)0797-200106，含量100%，經(jīng)五氧化二磷減壓干燥處理12 h以上，中檢院提供；脫水穿心蓮內(nèi)酯，批號(hào)0854-200204，含量100%，經(jīng)五氧化二磷減壓干燥處理12 h 以上，中檢院提供；除流動(dòng)相用甲醇為色譜純，其余均為分析純。

2含量測(cè)定

2.1色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB C-18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相：甲醇-水（55∶45），流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：穿心蓮內(nèi)酯230 nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯250 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取穿心蓮內(nèi)酯19.19 mg和脫水穿心蓮內(nèi)酯15.86 mg制成每1 mL各含38.38 μg和31.72 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3含量測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.4提取溶劑的考察

查《中國(guó)藥典》（2015年版）穿心蓮藥材、穿心蓮片和清火梔麥片含量測(cè)定的提取溶劑，再結(jié)合蔡松濤等[19]對(duì)穿心蓮片中含量測(cè)定提取溶劑的考察結(jié)果，本文在其研究基礎(chǔ)上分析比較甲醇、70%甲醇與乙醇的提取效率，結(jié)果與蔡松濤等[19]的研究一致：甲醇對(duì)穿心蓮的提取效率最高，且提取液的雜質(zhì)含量更低。（1.6805 mg/片>1.5085 mg/片）。

2.5 提取方法與時(shí)間的考察

設(shè)定超聲提取30 min[1]、超聲提取1 h；加冰超聲提取30 min、45 min和1 h；先冷浸1 h再超聲提取1 h及回流提取1 h[20]作為考察對(duì)象。方法：取同批清火梔麥片（140505）20片，去糖衣，稱總重，研細(xì)，取細(xì)粉約0.3 g，精密稱定，再精密加入甲醇50 mL，稱定重量，按上述各種方式提取，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按2.3測(cè)定。見(jiàn)封三圖5、表1。

2.6 提取溫度的考察

多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道[21-23]，穿心蓮主要成分穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)熱不穩(wěn)定。特別是在高熱[24]（90℃、100℃、110℃、120℃）的情況下，隨著溫度的升高，兩者的降解速度加?。黄渲写┬纳弮?nèi)酯隨著溫度的升高轉(zhuǎn)化率降低，幾乎以降解為主，脫水穿心蓮內(nèi)酯的降解速度隨溫度升高快于穿心蓮內(nèi)酯。結(jié)合文獻(xiàn)，本人比較了加冰超聲、常溫超聲（不設(shè)置溫度，水溫會(huì)隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而升高）、40℃、50℃、60℃和70℃恒溫超聲提取1 h的提取效果。方法：取同批清火梔麥片（140505）細(xì)粉約0.3 g，精密稱定，再精密加入甲醇50 mL，稱定重量，按上述各種方式提取，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按2.3測(cè)定。見(jiàn)圖1、表1。

3討論

《中國(guó)藥典》（2015年版）新標(biāo)準(zhǔn)是在2010年版藥典和蘇建等[21]對(duì)清火梔麥膠囊HPLC特征圖譜的建立和3種成分測(cè)定的基礎(chǔ)上建立的新標(biāo)準(zhǔn)，其含量提取方法將提取溶劑更換為70%甲醇，超聲功率從原來(lái)的250 W，33 kHz更改為250 W，40 kHz，物料比和超聲時(shí)間30 min不變。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件的考察是在2015年版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，期望通過(guò)優(yōu)化提取條件，進(jìn)一步提高測(cè)定的準(zhǔn)確性。

一些研究發(fā)現(xiàn)，清火梔麥片中穿心蓮主要成分含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。而清火梔麥片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量變化的考察結(jié)果[22]也顯示，清火梔麥片在溫度（40.0±2.0）℃，相對(duì)濕度為（75.0±5.0）% 條件下6個(gè)月后，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量都發(fā)生了變化。其中穿心蓮內(nèi)酯含量隨著時(shí)間相應(yīng)降低，而脫水穿心蓮內(nèi)酯含量則隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)先增加而后趨于平緩，但其增加的量與穿心蓮內(nèi)酯降解的量并不成正比，提示在高溫下，穿心蓮內(nèi)酯可能一部分轉(zhuǎn)換成脫水穿心蓮內(nèi)酯。此外，一項(xiàng)分析穿心蓮片中穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯變異因素的試驗(yàn)[21]提出，采用新鮮的穿心蓮藥材，減少藥典工藝中的加熱時(shí)間和溫度等影響因素，是提高穿心蓮片質(zhì)量的有效途徑。而清火梔麥片中的有效成分亦為穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯，故可推測(cè)加熱時(shí)間和溫度可以影響其含量測(cè)定。而以上結(jié)果均提示清火梔麥片中的有效成分存在不穩(wěn)定性，即提取條件可能影響其測(cè)定的準(zhǔn)確性。但因清火梔麥片中穿心蓮主成分的不穩(wěn)定性，其提取條件可能影響HPLC法的測(cè)定。如顏玉貞[22]報(bào)道，穿心蓮中的主成分穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯不穩(wěn)定，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)部分穿心蓮內(nèi)酯會(huì)轉(zhuǎn)化為脫水穿心蓮內(nèi)酯；曾慧芳等[20]報(bào)道，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯在雜質(zhì)較少的狀態(tài)下相對(duì)較穩(wěn)定，在高溫加熱狀態(tài)下穿心蓮內(nèi)酯以降解為主，轉(zhuǎn)化為輔；另有何詠梅[21]采用初均速法研究清火梔麥片中梔子苷的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)梔子苷在25℃下降解10%的時(shí)間為1.62年；黃竹英等[18]采用加速穩(wěn)定性試驗(yàn)法研究清火梔麥片的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)放置6 個(gè)月之后梔子苷含量無(wú)顯著差異，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量則均下降，并指出清火梔麥片不適宜存放于高溫高濕環(huán)境。

故本文結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，通過(guò)對(duì)提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間以及提取溫度的比較，對(duì)清火梔麥片中穿心蓮含量測(cè)定的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，HPLC法測(cè)定清火梔麥片中穿心蓮含量時(shí)的提取溶劑包括乙醇、70%乙醇、50%乙醇和甲醇等[4-8]，而周國(guó)兒等[6]研究顯示70%乙醇較50%乙醇提取效果好，故我們選擇乙醇、70%乙醇和甲醇作為提取溶劑分別試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇對(duì)穿心蓮的提取效率最高，且提取液的雜質(zhì)含量更低。而后我們綜合以往研究中的不同提取方法[4-8]，選擇比較超聲提取、先冷浸再超聲提取和加熱回流提取三種不同提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先冷浸再超聲較直接超聲的提取效率稍高，但無(wú)顯著差異；而加熱回流提取的效率較超聲和先浸再超法顯著降低，故穿心蓮的提取選擇直接超聲法即可。但不同提取方法時(shí)（冷超和熱超），超聲提取1 h的效率均較30 min好，故提取1 h的時(shí)間可能更為合理。穿心蓮的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果[19-22，24]提示，穿心蓮主要成分對(duì)熱不穩(wěn)定，特別是在高熱時(shí)會(huì)隨著溫度的升高加速降解。故我們比較了加冰、常溫、40℃、50℃、60℃和70℃等不同溫度下超聲1h的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加冰和常溫超聲的提取效果較好，在低溫（<60℃）的情況下，隨著溫度的上升有助于主要成分的提取，但當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí)提取效率降低。提示提取溫度過(guò)高時(shí)清火梔麥片主要成分可能發(fā)生降解，且該結(jié)果可能提示了穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯熱降解動(dòng)力學(xué)的溫度拐點(diǎn)。endprint

綜上，甲醇常溫超聲1 h為清火梔麥片中穿心蓮含量測(cè)定的合適提取條件。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1535.

[2] 賀奮義.穿心蓮內(nèi)酯提取方法及其藥理作用研究進(jìn)展[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2010，29（5）： 27-29.

[3] 徐志勇，劉啟德. 穿心蓮及其制劑中有效成分分析方法的研究進(jìn)展[J]. 廣東藥學(xué)， 2003，13（6）：39-41.

[4] 徐東來(lái)，陳紅軍. 薄層掃描法測(cè)定清火梔麥片中脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2001，2（1）：37-39.

[5] 周繼斌. 薄層掃描測(cè)定清火梔麥膠囊脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 海峽藥學(xué)，2000，12（1）：55-56.

[6] 周國(guó)兒，李彬. HPLC法測(cè)定清火梔麥膠囊中脫水穿心蓮內(nèi)酯[J]. 中草藥，2006，37（8）：1186-1187.

[7] 李軍依. 清火梔麥膠囊中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測(cè)定[J]. 中國(guó)藥業(yè)， 2008，17（12）：39-40.

[8] 王文忠，楊葳，馬占新，等. HPLC法測(cè)定清火梔麥口服液中脫水穿心蓮內(nèi)酯和梔子苷含量[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，4（9）：633-635.

[9] 蘇建，劉永利. 清火梔麥膠囊HPLC特征圖譜的建立和3種成分的測(cè)定[J]. 中成藥，2016，38（4）：810-815.

[10] 李成平，朱硯屏，高捷，等. 生物分配膠束色譜法同時(shí)測(cè)定清火梔麥片中3種有效成分[J]. 藥物分析雜志，2016，（5）：816-820.

[11] 張加余，喬延江，高曉燕，等. 清火梔麥片中化學(xué)成分的SPE-HPLC-ESI- MS n快速識(shí)別與鑒定[J]. 中國(guó)中藥雜志，2013，38（02）：186-192.

[12] 鄒盛勤，陳小玲. 反相高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器法測(cè)定清火梔麥片中梔子苷的含量[J]. 生命科學(xué)儀器，2008，6（5）：52-54.

[13] 郭炎榮，路玫. SPE-HPLC法測(cè)定清火梔麥片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14（8）：17-19.

[14] 郭敏，鐘保恒，李可林. HPLC法同時(shí)測(cè)定清火梔麥膠囊中脫水穿心蓮內(nèi)酯和梔子苷的含量[J]. 藥物分析雜志，2008，（11）：1921-1923.

[15] 顏軍，茍小軍，鄔曉勇，等. HPLC法測(cè)定穿心蓮中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（8）：3576-3577.

[16] 陳深. HPLC法測(cè)定清火梔麥片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[J]. 海峽藥學(xué)，2008，20（7）：75-77.

[17] 藍(lán)曉玉，林華. HPLC法同時(shí)測(cè)定清火梔麥片中3種有效成分的含量[J]. 藥物分析雜志，2011，（2）：228-230.

[18] 黃竹英，李淑如，覃仁安.清火梔麥片的穩(wěn)定性研究[J].藥學(xué)研究，2015，34（5）：285-288 .

[19] 蔡松濤，陳向紅，馬琳，等.影響穿心蓮片中穿心蓮、內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測(cè)定的因素[J]. 中成藥，2005， 27（3）：361-362.

[20] 曾惠芳，黃曉丹，蘇子仁，等.試析穿心蓮片中穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯的變異因素[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2006，17（4）：299-302.

[21] 何詠梅，陳燕軍.清火梔麥片的穩(wěn)定性研究[J].中南藥學(xué)，2003，1（1）：28-29.

[22] 顏玉貞、謝培山.穿心蓮質(zhì)量控制的再評(píng)價(jià)[J].中藥新藥與臨床藥理，1998，9（4）：204-206.

[23] 黃曉丹，蘇子仁，賴小平，等.穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯和穿心蓮SFE-CO2萃取物的熱降解動(dòng)力學(xué)[J].中藥新藥與臨床藥理，2003，14（1）：53-56.

[24] 蘇建，劉永利.清火梔麥膠囊HPLC特征圖譜的建立和3種成分的測(cè)定[J].中成藥，2016，38（4）：810-815.

（收稿日期：2017-04-21）endprint