王欣卉，王 穎,2,*，徐炳政，佐兆杭，劉淑婷，宮 雪，張東杰,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.青島瑯琊臺集團股份有限公司，山東 青島 266400）

酵母源金屬硫蛋白排汞及對汞致肝臟及機體氧化損傷的修復(fù)作用

王欣卉1，王 穎1,2,*，徐炳政3，佐兆杭1，劉淑婷1，宮 雪1，張東杰1,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.青島瑯琊臺集團股份有限公司，山東 青島 266400）

目的：探討兩種酵母源金屬硫蛋白（metallothioneins，MT）-1、MT-2對氯化汞急性汞中毒小鼠排汞及對汞致肝臟及機體氧化損傷的修復(fù)作用。方法：氯化汞急性汞中毒小鼠模型通過頸部皮下注射氯化汞生理鹽水溶液構(gòu)建，急性汞中毒小鼠經(jīng)連續(xù)灌胃二巰基丙磺酸鈉（dimercaptopropansulfonate sodium，DMPS）及不同劑量（0.16、0.40、0.80 mg/（kg·d））酵母源MT 14 d后，測定小鼠體質(zhì)量、肝臟臟器系數(shù)、血液及肝臟Hg2＋的含量、血清谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、機體總抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和兩項肝功能指示指標(biāo)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）活力。結(jié)果：相較于正常組小鼠，模型組小鼠體質(zhì)量下降、肝臟臟器系數(shù)上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；血液及肝臟Hg2＋含量顯著上升（P＜0.05）；血清GSH-Px、SOD活力及T-AOC顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05）；兩項肝功能指標(biāo)ALT及AST活力顯著升高（P＜0.05）。經(jīng)灌胃給藥處理后，與模型組小鼠相比，酵母源MT中、高劑量處理組及陽性對照組小鼠體質(zhì)量均顯著上升（P＜0.05），并與正常組小鼠無顯著性差異（P＞0.05）；各給藥處理組小鼠臟器系數(shù)均較模型組小鼠顯著下降（P＜0.05）且呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。各灌胃給藥處理組小鼠血液及肝臟Hg2＋含量均不同程度下降；血清GSH-Px、SOD活力及T-AOC均不同程度回升，MDA含量及兩項肝功能指標(biāo)ALT及AST活力均不同程度降低。在0.16～0.80 mg/kg劑量范圍內(nèi)，高劑量酵母源MT給藥效果最佳，與其他灌胃給藥處理組差異顯著（P＜0.05）。結(jié)論：兩種酵母源MT對急性汞中毒小鼠具有良好的結(jié)合機體內(nèi)游離Hg2＋及修復(fù)肝臟損傷及機體氧化損傷作用，且作用效果與給藥劑量呈正相關(guān)。

酵母源金屬硫蛋白；排汞；修復(fù)；肝臟；氧化損傷

王欣卉, 王穎, 徐炳政, 等. 酵母源金屬硫蛋白排汞及對汞致肝臟及機體氧化損傷的修復(fù)作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17): 233-237. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717038. http://www.spkx.net.cn

WANG Xinhui, WANG Ying, XU Bingzheng, et al. Effect of yeast metallothioneins on mercury elimination and repairing of mercury-induced acute body and liver injury[J]. Food Science, 2017, 38(17): 233-237. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717038. http://www.spkx.net.cn

汞作為全球性危害極強的污染物，已被各界學(xué)者廣泛重視[1-3]。汞可由食物鏈的富集作用進入人體，并在人體中以離子形式及螯合物形式存在[4]。汞進入機體中，可通過小腸壁及胃黏膜吸收作用進入機體，可隨血液流經(jīng)全身，蓄積于肝臟等組織中，并可與肝臟等組織細(xì)胞的細(xì)胞膜表面巰基蛋白結(jié)合，破壞其結(jié)構(gòu)，使之變性失活隨之造成細(xì)胞膜通透性改變，造成細(xì)胞腫脹，產(chǎn)生炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象[5]。

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）為胞內(nèi)小分子功能性蛋白，結(jié)構(gòu)中富含大量巰基，易結(jié)合金屬離子，對機體內(nèi)重金屬離子具有良好的排除作用，同時可抑制機體氧化應(yīng)激反應(yīng)并修復(fù)重金屬離子致機體受損組織[6-8]。酵母源金MT鋅離子誘導(dǎo)酵母細(xì)胞所分泌的一類MT，較比傳統(tǒng)方生產(chǎn)的MT生產(chǎn)周期短，提取方法也更為簡易[9]。本實驗以金屬螯合劑類藥物，二巰基丙磺酸鈉（dimercaptopropansulfonate sodium，DMPS）為對照，探究了具自主知識產(chǎn)權(quán)酵母源MT促排Hg2＋及其對汞致肝臟及機體氧化損傷的修復(fù)作用，旨在為其促排機體內(nèi)Hg2＋及修復(fù)機體氧化損傷及受損肝臟組織提供理論參考及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級昆明雄性小鼠：SCXK（吉）2011-0003，體質(zhì)量（18±2） g，由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。

酵母源MT（MT-1、MT-2，純度95%） 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院自制；DMPS（純度95%） 上海研臣實業(yè)有限公司；HgCl2（純度9.5%） 上海撫生生物技術(shù)有限公司；生理鹽水、肝素鈉、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidative capacity，T-AOC）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

YB-P50001型電子天平 北京長拓銳新科技發(fā)展有限公司；AFS-920雙道原子熒光光度計 北京吉天儀器有限公司；BS-330全自動生化分析儀 深圳麥瑞有限公司；酶標(biāo)儀 力臻卓越科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型建立

SPF級昆明雄性小鼠90 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d稱體質(zhì)量后分為9 組，每組小鼠10 只，其中急性汞中毒小鼠共分為8 組，分別為：模型組（MOD）、陽性對照組（DMPS）、酵母源MT-1、MT-2低、中、高劑量處理組（MT-1-L、MT-1-M、MT-1-H、MT-2-L、MT-2-M、MT-2-H），其余小鼠為正常組（NOR）。實驗期間小鼠飼養(yǎng)于專用塑料鼠籠，室溫（24±2）℃、相對濕度（45±3）%、光照12 h/ d。

小鼠每日食用實驗基礎(chǔ)飼料，自由飲用去離子水，急性汞中毒小鼠頸部皮下注射氯化汞生理鹽水溶液（0.5 mg/（kg·d），以體質(zhì)量計）連續(xù)3 d，正常組小鼠頸部皮下注射等容量生理鹽水，急性汞中毒造模24 h后，各組小鼠每日在同一時間灌胃給藥連續(xù)14 d，正常組與模型組小鼠灌胃等體積（0.2 mL）生理鹽水，各組小鼠具體藥劑分配見表1。

表 1 實驗小鼠藥劑分配Table 1 Drugs administered to mice

1.3.2 指標(biāo)測定

末次灌胃給藥24 h后，每組小鼠隨機選取5 只摘除眼球取血分離血清，應(yīng)用試劑盒方法測定小鼠血清中GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC及MDA含量，全自動生化分析儀測定血清中ALT與AST水平，其余小鼠摘除肝臟稱質(zhì)量后按以下公式計算肝臟臟器系數(shù)，并保存全血（肝素鈉抗凝），雙道原子熒光光度計測定肝臟及血液汞含量。

式中：m1為肝臟濕質(zhì)量/g；m為小鼠體質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用±s表示，采用SAS 9.1軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Origin 7.5軟件繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母源MT對急性汞中毒小鼠體質(zhì)量及肝臟臟器系數(shù)的影響

表 2 小鼠體質(zhì)量及肝臟臟器系數(shù)Table 2 Body weight and liver index in mice

小鼠體質(zhì)量及肝臟臟器系數(shù)如表2所示，小鼠經(jīng)頸部皮下注射氯化汞生理鹽水溶液造急性汞中毒模型后，與正常組小鼠相比體質(zhì)量顯著下降（P＜0.05），肝臟臟器系數(shù)顯著增加（P＜0.05），灌胃給藥后，相較于模型組小鼠，DMPS陽性對照組及兩種酵母源MT中、高劑量處理組小鼠體質(zhì)量均顯著上升（P＜0.05），且與正常組無顯著性差異（P＞0.05），但兩組間并無顯著性差異。各給藥處理組小鼠肝臟臟器系數(shù)均較模型組小鼠顯著下降（P＜0.05），且呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其中酵母源MT-1、MT-2高劑量處理組小鼠肝臟臟器系數(shù)趨于NOR組小鼠，DMPS陽性對照組小鼠與酵母源MT-1中、高劑量組及MT-2高劑量處理組小鼠無顯著性差異（P＞0.05），綜合比較各處理組小鼠體質(zhì)量及肝臟臟器系數(shù)，在0.16～0.80 mg/kg劑量范圍內(nèi)，高劑量酵母源MT-1對小鼠體質(zhì)量及肝臟臟器系數(shù)具有最佳的改善效果。

2.2 酵母源MT對急性汞中毒小鼠血液及肝臟汞含量的影響

圖 1 實驗小鼠血液（A）及肝臟（B）汞含量Fig. 1 Mercury levels in blood (A) and liver (B) of experimental mice

小鼠血液及肝臟汞含量由圖1所示，相較于正常組小鼠，模型組小鼠血液及肝臟汞含量均顯著上升（P＜0.05），經(jīng)灌胃給藥處理14 d后，與模型組小鼠相比，各藥物處理組小鼠血液及肝臟Hg2＋含量均不同程度降低。在0.16～0.80 mg/（kg·d）劑量范圍內(nèi)，兩種酵母源MT對血液及肝臟中Hg2＋的排除作用與劑量呈正相關(guān)，其中高劑量的兩種酵母源MT對血液及肝臟汞含量顯示出更加優(yōu)異的結(jié)合Hg2＋效果。DMPS對于血汞的排除效果顯著高于低、中劑量的兩種酵母源MT（P＜0.05），對于肝臟汞的排除效果與高劑量的兩種酵母源MT無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 酵母源MT對急性汞中毒小鼠血清抗氧化酶指標(biāo)、T-AOC及MDA含量影響

小鼠血清GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC及MDA含量如表3所示。相較于正常組小鼠，經(jīng)氯化汞生理鹽水溶液急性染毒后，模型組小鼠血清GSH-Px活力、SOD活力及T-AOC顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05）。灌胃給藥14 d后，與模型組小鼠相比，各灌胃給藥處理組小鼠血清抗氧化酶活力及機體T-AOC均有所回升，血清MDA含量均不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩種酵母源MT灌胃給藥處理組小鼠血清指標(biāo)顯示，兩種高劑量的酵母源MT對急性汞中毒小鼠顯示了更加優(yōu)異的改善效果，其提高血清抗氧化酶活力、機體T-AOC及降低血清MDA含量的作用顯著優(yōu)于酵母源MT中、低劑量組及DMPS處理組（P＜0.05）。

表 3 實驗動物血清GSH-Px、SOD活力、T-AOC及MDA含量Table 3 GSH-Px, SOD activity and T-AOC and MDA levels in experimental mice

2.4 酵母源MT對慢性汞中毒小鼠肝功能指標(biāo)的影響

圖 2 實驗小鼠肝功能指標(biāo)Fig. 2 Liver ALT and AST activities of experimental mice

ALT和AST兩項肝功能指示結(jié)果如圖2所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠經(jīng)急性氯化汞染毒后，血清ALT、AST活力顯著升高（P＜0.05），灌胃給藥處理后，各灌胃給藥處理組小鼠血清ALT、AST活力較模型組小鼠顯著下降（P＜0.05），在0.16～0.80 mg/（kg·d）劑量范圍內(nèi)，兩種酵母源MT對急性汞中毒小鼠肝功改善作用與劑量呈正相關(guān)，高劑量酵母源MT對降低小鼠血清ALT及AST活力作用效果最佳。DMPS對急性汞中毒小鼠肝功能指標(biāo)改善的作用效果與酵母源MT-1中、高劑量及酵母源MT-2高劑量無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

汞可以離子形式存在與機體當(dāng)中，通過結(jié)合胃黏膜細(xì)胞及小腸腸壁細(xì)胞的細(xì)胞膜巰基機構(gòu)，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，功能性喪失，導(dǎo)致機體消化功能紊亂，對食物的吸收率降低，導(dǎo)致體質(zhì)量下降[10]。同時汞可隨血液循環(huán)流經(jīng)全身各組織，并主要蓄積于肝臟等靶器官，使肝組織受損，導(dǎo)致兩項肝功能指示指標(biāo)ALT、AST活力顯著增加[11]。Hg2＋損傷肝臟組織的主要機制與其可與肝細(xì)胞細(xì)胞膜表面糖蛋白及巰基蛋白結(jié)合相關(guān)，Hg2＋通過與膜表面蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合[12-13]，造成蛋白結(jié)構(gòu)改變，蛋白生物活性喪失，細(xì)胞膜通透性改變[14-15]，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外Ca2＋濃度失衡，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載[16-17]，最終導(dǎo)致細(xì)胞水腫凋亡，肝臟臟器系數(shù)顯著增加[18-19]。另外汞可參與自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生大量自由基[20]，并可與體內(nèi)GSH-Px、SOD的中心作用位點結(jié)合，使酶活性位點改變，抗氧化活性喪失[21]，最終造成機體氧化損傷及脂質(zhì)過氧化物和大量MDA的積累。目前對急性汞中毒的治療一般采用金屬離子螯合劑DMPS，此藥物雖可與Hg2＋結(jié)合，但其在體內(nèi)會同時結(jié)合Ca2＋、Zn2＋等有益金屬離子，造成體內(nèi)有益金屬離子流失、金屬離子穩(wěn)態(tài)失衡，并且其藥物副作用尚不明確，缺乏一定的安全性[22]。

MT為胞內(nèi)小分子功能性蛋白，其結(jié)構(gòu)內(nèi)富含大量巰基，在機體中易結(jié)合Hg2＋，可結(jié)合機體內(nèi)游離Hg2＋，減少Hg2＋對機體造成的損傷。酵母源MT由鋅離子誘導(dǎo)合成，富含大量金屬-巰基簇合物，外源攝入的酵母源MT可結(jié)合機體內(nèi)的Hg2＋，形成穩(wěn)定簇合物，防止Hg2＋對機體蛋白結(jié)構(gòu)及其他生物大分子的損傷。酵母源MT可防止Hg2＋結(jié)合細(xì)胞膜巰基蛋白，平衡胞內(nèi)外Ca2＋濃度，抑制細(xì)胞水腫并修復(fù)受損細(xì)胞[23]。同時酵母源MT可釋放結(jié)構(gòu)內(nèi)含有的Zn2＋，調(diào)節(jié)機體金屬離子穩(wěn)態(tài)濃度，使機體內(nèi)金屬離子維持于穩(wěn)定狀態(tài)[24-25]。并且其結(jié)構(gòu)內(nèi)富含的巰基可以作為給電子基團，結(jié)合機體內(nèi)過量的自由基，并可減少脂質(zhì)過氧化總產(chǎn)物MDA的含量，另外酵母源MT結(jié)構(gòu)中的Zn2＋作為SOD與GSH-Px所需要的活性中心位點離子，以激活體內(nèi)抗氧化酶并維持抗氧化酶系在體內(nèi)含量，修復(fù)機體抗氧化體系，從而提高機體總抗氧化能力[26]。

從本實驗結(jié)果可以看出，兩種酵母源MT（MT-1、MT-2）在促排體內(nèi)Hg2＋、修復(fù)抗氧化酶、提高機體總抗氧化能力及降低MDA含量、修復(fù)受損肝臟方面顯示了優(yōu)異的作用效果，在0.16～0.80 mg/（kg·d）劑量范圍內(nèi)，高劑量灌胃給藥的酵母源MT效果最佳，實驗結(jié)果為酵母源MT在結(jié)合體內(nèi)游離Hg2＋、修復(fù)機體氧化損傷及肝臟損傷方面提供了數(shù)據(jù)支持，結(jié)果與課題組在酵母源MT促排體內(nèi)Pb2＋的實驗作用效果相當(dāng)[27-30]，因此可表明酵母源MT在重金屬離子促排和修復(fù)機體重金屬離子致機體氧化損傷及臟器損傷修復(fù)方面具有優(yōu)異的效果及廣闊的發(fā)展空間，有待學(xué)者們更進一步的開發(fā)與利用。

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Effect of Yeast Metallothioneins on Mercury Elimination and Repairing of Mercury-Induced Acute Body and Liver Injury

WANG Xinhui1, WANG Ying1,2,*, XU Bingzheng3, ZUO Zhaohang1, LIU Shuting1, GONG Xue1, ZHANG Dongjie1,*
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Daqing 163319, China; 3. Qingdao Langyatai Co. Ltd., Qingdao 266400, China)

Objective: To investigate the effect of two yeast metallothioneins (MT-1 and MT-2) on mercury elimination and the repairing of liver damage and oxidative damage in mice with acute mercury chloride poisoning. Methods: A mouse model of acute mercury poisoning was established by subcutaneous injection of mercuric chloride in normal saline in the neck. The acute mercury poisoning mice were lavaged with each MT at different doses or DMPS for 14 continuous days. At the end of the treatment period, the body weight, liver coeffi cient, mercury levels in blood and liver, superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) activities, malondialdehyde (MDA) content and total antioxidant capacity (T-AOC) in serum, and liver alanine aminotransferase (ALT) and aspartate transaminase (AST) activities were measured. Results: Compared with the normal group, body weight in the model group was significantly decreased (P ＜ 0.05), and liver coeffi cient was increased (P ＜ 0.05); serum mercury levels were increased signifi cantly (P ＜ 0.05); SOD and serumGSH-Px activities and T-AOC were decreased signifi cantly (P ＜ 0.05); serum MDA level and liver ALT and AST activities were increased significantly (P ＜ 0.05). Yeast MT at middle and high doses and the positive control dimercaptopropansulfonate sodium resulted in significantly higher body weight compared with the model group (P ＜ 0.05), and exhibited no significant difference from the normal group (P ＞ 0.05). The treatments resulted in signifi cantly dose-dependently reduced liver coeffi cient in comparison with the model group (P ＜ 0.05). For all treatment groups, Hg2+levels in serum and liver, serum MDA level, and liver ALT and AST activities were decreased to different extents, and serum GSH-Px and SOD activities and T-AOC were increased to different extents. High-dose yeast metallothioneins had the best effect in the dose range of 0.16–0.80 mg/kg, and the effect was significantly different from that of other groups (P ＜ 0.05). Conclusion: Both yeast MT could significantly dose-dependently bind free Hg2+in mice with acute mercury chloride poisoning and re pair liver damage and oxidative damage.

yeast metallothioneins; mercury elimination; repairing; liver; oxidative damage

10.7506/spkx1002-6630-201717038

TS202.3

A

1002-6630（2017）17-0233-05引文格式：

2017-03-10

黑龍江省博士后落地資助項目（LBH-Q15116）；黑龍江省新世紀(jì)優(yōu)秀人才培養(yǎng)計劃項目（1254-NCET-015）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)青年創(chuàng)新人才項目（CXRC2016-15）；新世紀(jì)優(yōu)秀人才項目（1254-NCET-015）；2015年度國家星火計劃項目（2015GA670008）；

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項目（YJSCX2017-Y56；YJSCX2017-Y57）

王欣卉（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)及食品質(zhì)量安全。E-mail：w604466213@163.com

*通信作者：王穎（1979—），女，副教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程及食品質(zhì)量安全。E-mail：wychen156@163.com張東杰（1966—），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工與安全。E-mail：byndzdj@126.com