張宏毅 劉明輝 李穎 李永文 徐嵩 潘振華 李明彪 范海洋 劉紅雨 陳軍

腫瘤治療包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療以及生物治療等。化療能抑制惡性腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展，并在一定程度上殺死腫瘤細(xì)胞。但是，目前常用的化療藥物均缺乏特異性，往往在抑制腫瘤的同時(shí)對(duì)機(jī)體增殖旺盛的細(xì)胞，如骨髓細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、生殖細(xì)胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞有一定的影響；有些藥物還對(duì)肝、腎、心功能有損傷，少數(shù)藥物還對(duì)皮膚及其附件、肺、內(nèi)分泌系統(tǒng)有不同程度的損傷；此外，多數(shù)抗腫瘤藥物都有免疫抑制作用，有潛在的致畸和致癌作用。

Tuftsin是IgG分子Fc段降解產(chǎn)生的由四個(gè)氨基酸組成的一段生理肽（Thr-Lys-Pro-Arg, TKPP）[1]，被人們認(rèn)知及研究已有40多年，文獻(xiàn)[2,3]證實(shí)Tuftsin在體內(nèi)具有顯著的抗腫瘤活性，可以通過(guò)巨噬細(xì)胞廣泛作用于人體的免疫系統(tǒng)，而且毒性較低。但是合成的Tuftsin一直難以應(yīng)用于臨床。首先，合成的Tuftsin由于蛋白酶的水解作用，其體內(nèi)半衰期僅有0.27 h，進(jìn)入體內(nèi)后很快被水解，難以發(fā)揮作用。因此阻礙了其在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用。T肽是Tuftsin的衍生物，與Tuftsin具有相似的生物學(xué)功能，但在藥代動(dòng)力學(xué)上優(yōu)于Tuftsin。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為（TKPR），分子量2,516。研究[4]表明，T肽表現(xiàn)出了比較明顯的腫瘤抑制作用和較小的毒副作用。目前，T肽廣泛用于多種惡性腫瘤術(shù)后抗腫瘤治療，主要是通過(guò)提高腫瘤患者自身免疫力而達(dá)到抗腫瘤的作用。

鉑類化療藥廣泛用于各類腫瘤的治療中，主要是通過(guò)破壞DNA的復(fù)制抑制細(xì)胞增殖。由于鉑類藥物對(duì)DNA合成的破壞作用是非特異性的，因此在破壞腫瘤細(xì)胞復(fù)制的同時(shí)會(huì)對(duì)增殖活躍的骨髓干細(xì)胞有一定抑制作用?；赥肽具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞分化增殖的作用，本研究探討T肽能否與鉑類化療藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)化療藥的抗腫瘤作用，減輕化療藥物的毒副作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和材料 人U937巨噬細(xì)胞株購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿，37oC、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。T肽，白色凍干粉末，純度＞98%、0.9%NaCl稀釋至1 mg/mL，分裝成200 μL后儲(chǔ)蓄在-20oC冰箱備用。順鉑白色粉末，用0.9%NaCl稀釋后分裝備用。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和干擾素-γ（interferon-γ,IFN-γ）的酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海博谷公司。CD14、F4/80抗體均購(gòu)于BD公司。

1.2 T肽對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌作用的研究 U937巨噬細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)、傳代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組：順鉑組以5 μg/mL處理細(xì)胞，T肽組以濃度為400 μmol T肽處理細(xì)胞，以及T肽+順鉑組（T肽400 μmol，順鉑5 μg/mL），對(duì)照組為0.9%NaCl。處理72 h后收集細(xì)胞上清液，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)不同處理組細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的變化情況。ELISA實(shí)驗(yàn)按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.3 肺癌移植瘤模型探討T肽聯(lián)合順鉑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用人鱗癌小鼠模型的建立及分組：新鮮人肺鱗癌組織，剪碎，接種于1只-3只裸鼠右側(cè)后肢皮下，使其成瘤。3周后，在無(wú)菌條件下分離出腫瘤組織。打碎腫瘤組織后植入40只小鼠左前肢皮下。腫瘤體積達(dá)到200 mm3-300 mm3時(shí)入組。分組：A組（T肽）、B組（T肽+順鉑）、C組（順鉑）、D組（control）。藥物：實(shí)驗(yàn)期間每隔5天給藥一次，共給藥3次。濃度、給藥途徑及用藥劑量見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理以《細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》和《抗腫瘤藥效學(xué)指導(dǎo)原則討論稿》為指導(dǎo)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。腫瘤體積計(jì)算：V=L*W2/2（V=腫瘤體積，L=長(zhǎng)徑，W=短徑）；腫瘤生長(zhǎng)抑制率（瘤重）=（空白對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重）/空白對(duì)照組瘤重*100%，腫瘤生長(zhǎng)抑制率（體積）=（空白對(duì)照組體積-給藥組體積）/空白對(duì)照組體積*100%[1]。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)（f l uorescence activated sorter, FACs）檢測(cè)小鼠血中巨噬細(xì)胞變化 毛細(xì)管蘸抗凝劑取鼠尾血20 μL，加入含500 μL PBS的EP管中，混懸細(xì)胞，防止凝集。1,500 rpm離心4 min，去上清。每管加入300 μL紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解10 min。加入500 μL PBS，混勻，1,500 rpm，4oC離心4 min，棄紅色上清。加入100 μL Binding buffer重懸細(xì)胞沉淀，加入CD14-FITC及F4/80-PE抗體各1 μg，避光孵育20 min，1 500 rpm離心4 min，加入300 μL PBS重懸，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 免疫組化檢測(cè)小鼠瘤塊中Ki67表達(dá) 處死小鼠后無(wú)菌條件下分離瘤塊，常規(guī)石蠟包埋切片，常規(guī)切片，用兔抗鼠Ki67單克隆抗體，采用ABC法、DAB顯色，蘇木精復(fù)染。常規(guī)光鏡檢測(cè)Ki67的表達(dá)情況。以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，隨機(jī)讀取10個(gè)高倍視野，共計(jì)數(shù)1,000個(gè)細(xì)胞，以Ki67陽(yáng)性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)作Ki67指數(shù)，以評(píng)估Ki67表達(dá)水平。染色后顯微鏡下觀察照相。Ki67陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞胞核上呈現(xiàn)棕黃色顆粒；分別對(duì)鏡下陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度給予評(píng)分。陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，76%-100%為4分。陽(yáng)性著色強(qiáng)度：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者計(jì)分相乘即為陽(yáng)性等級(jí)：0分為陰性（-），1分-4分為弱陽(yáng)性（+），5分-8分為陽(yáng)性（++），9分-12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）[5-7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析法（ANOVA）分析ELISA、細(xì)胞流式術(shù)、各組間小鼠腫瘤體積變化，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ分泌結(jié)果 在T肽組和T肽聯(lián)合順鉑組中， U937細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α及IFN-γ濃度明顯高于對(duì)照組和順鉑組，且各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。T肽聯(lián)合順鉑組、T肽組vs對(duì)照組、順鉑組TNF-α：［72 h: (54.10±3.98) μmol/L, (28.70±5.19) μmol/Lvs(3.19±1.13) μmol/L, (1.83±0.74) μmol/L,P＜0.05］；IFN-γ［72 h: (147.23±8.79) μmol/L, (66.75±5.74) μmol/Lvs(2.54±0.99) μmol/L, (1.90±0.74) μmol/L,P＜0.05］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明T肽具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌腫瘤殺傷因子TNF-α、IFN-γ的作用，而且表明T肽能夠減弱順鉑對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的抑制作用（圖1）。

2.2 用藥后小鼠體重及移植瘤生長(zhǎng)結(jié)果 結(jié)果顯示T肽聯(lián)合順鉑組對(duì)人鱗癌移植瘤生長(zhǎng)抑制率優(yōu)于順鉑組和T肽組（分別為92%vs84%，P＜0.05；92%vs48%，P＜0.05）（表1）。此外，本實(shí)驗(yàn)期間順鉑組有3只小鼠死亡，其余組未見(jiàn)急性中毒反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)記錄實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體重描繪出體重變化曲線，從曲線中可以觀察到T肽聯(lián)合順鉑組、T肽組與對(duì)照組體重在實(shí)驗(yàn)期間變化不大，而單純順鉑組小鼠體重呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖2，圖3）。

2.3 Ki67免疫組化結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取出小鼠體內(nèi)腫瘤進(jìn)一步應(yīng)用免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，各組中腫瘤組織Ki67評(píng)分分別為T(mén)肽組vsControl組vsT肽+順鉑組vs順鉑組（++,+++, +, +）（圖3）。

2.4 細(xì)胞流式結(jié)果 實(shí)驗(yàn)收集用藥期間小鼠尾靜脈血觀察T肽在小鼠移植瘤模型中對(duì)外周血巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響。結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組小鼠尾靜脈血中巨噬細(xì)胞比例明顯增高。T肽聯(lián)合順鉑組vsT肽組vs順鉑組vs對(duì)照組Day 1：[(2.24%±0.96%)vs(2.31%+0.77%)vs(2.29%±0.63%)vs(2.32%±0.51%)]、Day 15：[(11.69%±1.10%)vs(7.19%±0.99%)vs(0.62%±0.13%)vs(2.43%±0.77%)]（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

T肽是Tuftsin的衍生物，Tuftsin是機(jī)體脾臟生成的一段生理活性肽，其基本功能是刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因

表1 T肽在小鼠移植瘤模型中的腫瘤抑制作用Tab 1 Anti-tumor activity of T peptide in exnograft mice model

圖1 T肽對(duì)U937細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的作用研究。不同處理組在72 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IFN-γ濃度的變化情況。*P＜0.05。Fig 1 The concentration of TNF-α and IFN-γ of U937 cells treated with T piptide and/or cis-platinum after 72 h. *P＜0.05. TNF-α: tumor necrosis factor-α; IFN-γ:interferon-γ.

圖2 荷瘤小鼠模型以T肽和/或順鉑處理期間腫瘤體積及小鼠體重變化。A：小鼠腫瘤體積變化；B：用藥期間小鼠體重變化情況。*P＜0.05。Fig 2 The tumor volume and weight of exnograft mice when treated with T peptide and/or cis-platinum. A:The tumor volume were measured during the treatment. B: The mice weight were measured during the treatment. *P＜0.05.

圖3 移植瘤小鼠模型用藥后各組瘤塊重量及ki67表達(dá)情況。A：荷瘤小鼠模型試驗(yàn)結(jié)束各組瘤塊重量；B：各組瘤塊免疫組化Ki-67染色表達(dá)率. a：T peptide；b：control；c：T peptide +cis-platinum；d：cisplatinum；*P＜0.05。Fig 3 The tumor weight and Ki67 expression rate of Exnograft mice. A: The mice were sacrificed and tumors were removed and weighted; B:Immunohistochemistry assay for detectingthe proliferation marker Ki-67 in xenograft tumor sections. Representative microscopic images showing Ki-67-positive cells in each group. a: T peptide; b: control; c: T peptide+cis-platinum; d: cisplatinum. *P＜0.05.

2,000子和巨噬細(xì)胞增殖。Tuftsin不能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，但可以通過(guò)提高機(jī)體自身免疫力，增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞毒性間接加強(qiáng)對(duì)腫瘤殺傷效應(yīng)。早期研究認(rèn)為腫瘤抗原的加工呈遞主要由樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)，巨噬細(xì)胞主要加工呈遞外源性病原體抗原。2012年，Barrio等[8]通過(guò)研究黑色素瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞能夠加工呈遞黑色素瘤特異性抗原給T細(xì)胞從而激發(fā)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞主要是通過(guò)抗原呈遞和分泌具有腫瘤殺傷作用的細(xì)胞因子。巨噬細(xì)胞通過(guò)腫瘤抗原呈遞激活上調(diào)T細(xì)胞和B細(xì)胞的MHC-II表達(dá)，導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞反應(yīng)性提高，從而促進(jìn)誘導(dǎo)T細(xì)胞的增生以及活化細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，殺滅腫瘤細(xì)胞。在II期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Tuftsin單獨(dú)用于早期腫瘤患者治療效果并不理想[9]，但與化療藥物聯(lián)合使用對(duì)小細(xì)胞肺癌的治療效果非常顯著[10]。由于其生物活性低，在體內(nèi)易于水解失效，在此基礎(chǔ)上合成其衍生物T肽，T肽具有更高的生物活性。T肽擁有4個(gè)Tuftsin樣結(jié)構(gòu)，體內(nèi)藥物代謝研究表明，T肽在體內(nèi)的半衰期約2 h-4 h，與Tuftsin在體內(nèi)2.8 h[11]的半衰期相比，明顯增強(qiáng)了生物活性。

圖4 荷瘤小鼠模型以T肽和/或順鉑處理，外周血巨噬細(xì)胞的變化。A：用藥期間各組小鼠外周血巨噬細(xì)胞變化曲線；B：用藥周期結(jié)束時(shí)各組小鼠中隨機(jī)抽取一只小鼠外周血巨噬細(xì)胞流式圖。a：T peptide；b：control；c：T peptide+cis-platinum；d：cisplatinum。*P＜0.05。Fig 4 The percentages of in were measured by FACS. A: The curve of exnograft mice peripheral blood macrophages during medication. B:Randomly selected flow cytometry of each group at the end of medication. a: T peptide; b: control; c: T peptide +cis-platinum; d: cisplatinum.*P＜0.05.

T肽基本功能與Tuftsin相似，主要效應(yīng)細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)中巨噬細(xì)胞具有重要的地位，可直接或者通過(guò)呈遞腫瘤相關(guān)抗原誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答殺傷腫瘤細(xì)胞。目前腫瘤間質(zhì)中存在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages, TAM）在腫瘤微環(huán)境的調(diào)控下可以變換表型，演變?yōu)橐种颇[瘤生長(zhǎng)的M1型或促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的M2型[12,13]。相關(guān)研究[14]表明T肽可以結(jié)合巨噬細(xì)胞表面的特異性抗體，激活NF-?B信號(hào)通路，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能同時(shí)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)Th1相關(guān)的細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-12、IFN-γ等。在巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子中TNF-α、IFN-γ是巨噬細(xì)胞分泌的具有抗腫瘤效果的主要細(xì)胞因子，TNF-α是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，可引起腫瘤細(xì)胞凋亡[15]，只有活化的巨噬細(xì)胞才具有分泌細(xì)胞因子的作用。已有研究證實(shí)T肽具有激活巨噬細(xì)胞并促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)T肽聯(lián)合順鉑后細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ分泌明顯高于其他三組。

在小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示T肽與順鉑聯(lián)合用藥組腫瘤抑制作用優(yōu)于其他三組的同時(shí)，小鼠一般情況好，未見(jiàn)順鉑引起的嚴(yán)重毒性反應(yīng)。用藥期間流式檢測(cè)結(jié)果提示聯(lián)合用藥組小鼠外周血中活化巨噬細(xì)胞明顯高于順鉑單藥組。對(duì)比順鉑單藥組與聯(lián)合用藥組，聯(lián)合用藥組對(duì)巨噬細(xì)胞的活化作用明顯強(qiáng)于順鉑單藥組，這可能與T肽刺激單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化并活化巨噬細(xì)胞有關(guān)。T肽作為化療輔助用藥，不僅能提高化療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用的同時(shí)還可以增強(qiáng)免疫功能減少化療對(duì)正常免疫細(xì)胞的毒副作用。

在臨床腫瘤治療中，通常采用手術(shù)切除腫瘤后輔助放化療。但是手術(shù)僅解決肉眼可見(jiàn)的實(shí)體瘤，一些微小病灶或手術(shù)操作中掉落的腫瘤細(xì)胞并無(wú)法通過(guò)手術(shù)根除。由于腫瘤患者一般狀態(tài)較差并且手術(shù)對(duì)機(jī)體造成二次創(chuàng)傷，大部分術(shù)后短期內(nèi)無(wú)法使用化療藥物。因此防止術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)成為腫瘤術(shù)后的難題。在術(shù)后與第一次化療治療期間的空窗期為腫瘤二次生長(zhǎng)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造機(jī)會(huì)。因?yàn)門(mén)肽具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)，通過(guò)巨噬細(xì)胞增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。介于T肽具有通過(guò)調(diào)節(jié)自身免疫間接殺傷腫瘤細(xì)胞，我們認(rèn)為可能早期在術(shù)后使用T肽可以減少術(shù)后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，患者是否可以獲益仍需要更多臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T肽能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖和提高其分泌腫瘤細(xì)胞殺傷因子（TNF-α、IFN-γ）；在體外動(dòng)物模型中，T肽能夠與化療藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，提高化療藥物如順鉑的療效，同時(shí)能夠減輕化療藥物的毒副作用。