葉亮 李慧娟 張方 呂鏜烽 劉紅兵 宋勇

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康，是致死率最高的惡性腫瘤之一，給社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1,2]。雖然近年發(fā)現(xiàn)了許多新的治療方式，但發(fā)現(xiàn)時(shí)大多處于中晚期，預(yù)后仍未得到顯著改善[3]。從分子水平研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制有利于發(fā)現(xiàn)新的分子靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)新的治療手段，對(duì)于減少患者痛苦和延長(zhǎng)患者生存時(shí)間極為重要[4]。

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)是目前全球最大的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，旨在挖掘癌癥基因信息。通過(guò)大學(xué)或研究機(jī)構(gòu)郵箱可以免費(fèi)注冊(cè)使用。迄今為止，該數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)收集了715個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，86,733個(gè)癌癥組織和正常組織的樣本數(shù)據(jù)。利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)可以比較常見(jiàn)癌癥類型和各自正常組織的差異表達(dá)分選，也可以探索各種癌癥亞型以及基于臨床和病理學(xué)的分析，進(jìn)行差異表達(dá)分選、共表達(dá)分析，查找某中癌癥中差異表達(dá)的基因，確定目的基因，進(jìn)而確定研究方向，不僅可以節(jié)省科研成本，而且其信息也更加全面。

驅(qū)動(dòng)蛋白超家族（kinesin family member, KIF）是一類基于微管的分子馬達(dá)蛋白，介導(dǎo)多種功能，其異常表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色[5,6]。KIF23基因隸屬于KIF家族，研究發(fā)現(xiàn)，其在有絲分裂的胞質(zhì)分離過(guò)程中起著重要作用，其表達(dá)缺失可導(dǎo)致有絲分裂停滯[7]。盡管既往研究表明KIF23在多種腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)增高[8,9]，但是在非小細(xì)胞肺癌組織中鮮有系統(tǒng)研究。

本研究利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)和Kaplan-Meier Plotters數(shù)據(jù)庫(kù)分析KIF23在NSCLC中的表達(dá)和預(yù)后，通過(guò)二次分析薈萃KIF23和NSCLC可能存在的關(guān)系，為進(jìn)一步研究KIF23在NSCLC發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制提供線索和依據(jù)，同時(shí)也為利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘腫瘤基因?qū)W數(shù)據(jù)提供良好范例。

1 資料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)提取數(shù)據(jù) Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)基于基因芯片的數(shù)據(jù)庫(kù)和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，在此數(shù)據(jù)中可根據(jù)自己的需求設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件。本研究中，我們?cè)O(shè)定的篩選條件為：①“Cancer Type: Lung cancer”；②“Gene: KIF23”；③“Data Type: mRNA和DNA copy number”；④“Analysis Type: Cancer vs Normal Analysis”；⑤臨界值設(shè)定條件（P value＜1E-4, fold change＞2, gene rank=top 10%）。選擇柱狀圖展示結(jié)果。

1.2 Kaplan-Meier Plotter進(jìn)行患者生存周期分析 利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmplot.com/analysis/）的NSCLC數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析。篩選條件如下：①“Cancer: Lung Cancer”；②“Gene: KIF23”；③“Survival: OS”。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 正常組織與NSCLC病例組之間KIF23表達(dá)的差異采用t檢驗(yàn)。KIF23表達(dá)與NSCLC預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier模型分析。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KIF23在常見(jiàn)腫瘤類型中的表達(dá)結(jié)果 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集了447項(xiàng)不同類型的研究結(jié)果（圖1），其中關(guān)于KIF23表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的研究結(jié)果有67項(xiàng)，KIF23表達(dá)增高的研究有64項(xiàng)，表達(dá)降低的研究有3項(xiàng)。

2.2 KIF23在NSCLC中的表達(dá)結(jié)果 在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中我們發(fā)現(xiàn)，自2000年開(kāi)始，共有16項(xiàng)研究涉及KIF23在NSCLC組織和正常組織中的表達(dá)（圖2），共有1,189個(gè)樣本，包括肺腺癌、鱗癌及大細(xì)胞肺癌與正常組織比較。文章分別發(fā)表于Nat Med[10]、Genome Res[11]、Cancer Res[12,13]、PLoS One[14,15]、BMC Genomics[16]、Bioinformatics[17]、Proc Natl Acad Sci U S A[18,19]和Am J Pathol[20]。在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中薈萃分析16項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，KIF23基因在所有差異表達(dá)基因中其中位數(shù)值排名為635.5，P=4.14E-8，提示KIF23在NSCLC中高表達(dá)。

2.3 KIF23在不同NSCLC研究芯片中的表達(dá)差異 圖3所示為Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中KIF23在不同NSCLC研究芯片中的表達(dá)結(jié)果。分別在Beer等[10]、Okayaman等[12]、Stearman等[20]、Garber等[18]和Hou等[14]這5項(xiàng)研究中，KIF23在NSCLC中的表達(dá)量高于正常組（P均＜0.001）。

2.4 KIF23與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：KIF23表達(dá)水平對(duì)患者的總生存時(shí)間有著顯著影響。與低表達(dá)組相比，KIF23高表達(dá)組NSCLC患者的總生存時(shí)間顯著降低。進(jìn)一步亞組分析發(fā)現(xiàn)，KIF23表達(dá)水平對(duì)肺腺癌患者預(yù)后有顯著影響，而在鱗癌患者中，其表達(dá)水平對(duì)預(yù)后無(wú)顯著影響（圖4）。

3 討論

肺癌是目前全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。并且流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)肺癌中的肺腺癌發(fā)病率越來(lái)越高，已經(jīng)取代肺鱗癌成為發(fā)病率最高的NSCLC[21]。長(zhǎng)期以來(lái)，NSCLC的預(yù)后一直較差，直到近十年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了EGFR、KARS、ALK等一批肺腺癌驅(qū)動(dòng)基因[22]，進(jìn)而開(kāi)發(fā)出一些靶向治療藥物，極大地改善了肺腺癌患者的預(yù)后[23]，然而這些基因的突變僅存在于肺腺癌當(dāng)中的部分患者中。因此，尋找NSCLC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子或靶點(diǎn)，對(duì)于開(kāi)發(fā)治療肺癌的新的靶向藥物具有重要的理論和臨床意義，一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

驅(qū)動(dòng)蛋白（kinesin）是一類能利用ATP水解所釋放的能量驅(qū)動(dòng)自身所攜帶的貨物分子沿微管運(yùn)動(dòng)的馬達(dá)蛋白，與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)，參與囊泡、細(xì)胞器、染色體及RNA結(jié)合蛋白等的轉(zhuǎn)運(yùn)，在胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及有絲分裂過(guò)程中起著重要的作用。到目前為止，在人和小鼠體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)45種驅(qū)動(dòng)蛋白，它們分屬14個(gè)蛋白家族，根據(jù)馬達(dá)結(jié)構(gòu)域在重鏈上的位置不同，將驅(qū)動(dòng)蛋白劃分為3種類型：馬達(dá)結(jié)構(gòu)域在C末端的C-kinesin、馬達(dá)結(jié)構(gòu)域在中間的M-kinesin和馬達(dá)結(jié)構(gòu)域在N末端的N-kinesin[24]，大多數(shù)的驅(qū)動(dòng)蛋白是N-kinesin。KIF23屬于N-kinesin，定位于細(xì)胞胞漿和胞核，與細(xì)胞的分化增殖能力有關(guān)[25]。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌及胃癌中均存在KIF23高表達(dá)現(xiàn)象。乳腺癌中KIF23過(guò)表達(dá)與乳腺癌的腫瘤分級(jí)、侵襲性及預(yù)后顯著相關(guān)[6]。腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞KIF23的高表達(dá)可能與轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除KIF23可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力[9]。此外，在胃癌中也發(fā)現(xiàn)，KIF23在mRNA水平顯著升高，并且與較差的預(yù)后相關(guān)[8]。Kato等[26]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中，特別是腺癌組織中KIF23表達(dá)明顯增高，且高表達(dá)患者通常預(yù)后比較差。我們通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)研究，亦同樣發(fā)現(xiàn)KIF23在多種腫瘤中具有表達(dá)增高趨勢(shì)。

盡管多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)KIF23在多種腫瘤包括NSCLC中高表達(dá)，但由于獨(dú)立研究存在樣本量小易導(dǎo)致抽樣誤差等原因，缺乏較高的可信度。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)是目前全球最大的基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，注冊(cè)賬戶后可用于挖掘腫瘤相關(guān)基因的信息。我們首先通過(guò)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘KIF23基因在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌等常見(jiàn)腫瘤表達(dá)信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的67項(xiàng)研究中，64項(xiàng)研究表明KIF23在常見(jiàn)腫瘤中處于高表達(dá)狀態(tài)。進(jìn)一步利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)薈萃分析了肺癌芯片檢測(cè)結(jié)果，同樣證明，在超過(guò)1,000例的標(biāo)本中，KIF23在NSCLC組織中高表達(dá)，尤其是在肺腺癌中高表達(dá)。TheKaplan-MeierPlotter數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmplot.com/analysis/）是一個(gè)目前世界上最廣為接收的預(yù)后相關(guān)的在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)，涵蓋了2,437例肺癌樣本，可對(duì)54,675個(gè)基因進(jìn)行相關(guān)預(yù)后分析，并得出真實(shí)可信客觀的結(jié)果。本文首次通過(guò)KM plotter數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)了KIF23在NSCLC中的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果顯示，KIF23的表達(dá)量與NSCLC總體生存率明確相關(guān)，KIF23高表達(dá)患者的總生存時(shí)間顯著降低。進(jìn)一步亞組分析發(fā)現(xiàn)，KIF23表達(dá)水平對(duì)肺腺癌患者預(yù)后有顯著影響，而在鱗癌患者中，其表達(dá)水平對(duì)預(yù)后無(wú)顯著影響。KIF23的高表達(dá)可能影響腫瘤的發(fā)生，或許由于驅(qū)動(dòng)蛋白家族表達(dá)的過(guò)度能夠影響有絲分裂的正常進(jìn)行，并導(dǎo)致分裂阻滯或異常分裂的發(fā)生，從而產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞，最終引起腫瘤的發(fā)生。我們的所有數(shù)據(jù)都來(lái)自基因芯片，研究方法一致，且包含了迄今為止最大的樣本量，去除了因?yàn)闃颖玖康膯?wèn)題導(dǎo)致的誤差，增加了結(jié)論的可信度。

圖1 KIF23在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中所有腫瘤研究中的表達(dá)Fig 1 Expression data for KIF23 in a variety of normal and cancerous human tissues in database Oncomine

圖2 KIF23在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)。1-16分別表示16項(xiàng)研究結(jié)果，紅色越深表示KIF23基因在該芯片中表達(dá)越高。Fig 2 Expression of KIF23 in NSCLC in the studies identified in the Oncomine database. 1-16 represent the 16 studies on the expressions of KIF23 in NSCLC. Darker red indicates higher KIF23 expression in the chips.

圖3 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中KIF23在不同NSCLC研究芯片中的表達(dá)。*：P＜0.05。Fig 3 Expression of KIF23 in NSCLC in different studies identified in the Oncomine database. *: P＜0.05.

圖4 KIF23表達(dá)與NSCLC預(yù)后之間的關(guān)系Fig 4 Relationship between the expression of KIF23 and the prognosis of NSCLC

綜上所述，我們通過(guò)對(duì)NSCLC組織中KIF23相關(guān)信息的深入挖掘，提出KIF23在NSCLC組織中高表達(dá)，且與NSCLC預(yù)后相關(guān)。采用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行大樣本分析，可以避免單一研究樣本量過(guò)小產(chǎn)生的誤差，對(duì)臨床治療提供重要理論依據(jù)。KIF23在NSCLC疾病發(fā)展中的具體作用機(jī)制，未來(lái)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。