類成龍，姜玥璐，周 進(jìn)，勞永民，何永紅，蔡中華

(1：清華大學(xué)生命學(xué)院，北京 100084)(2：清華大學(xué)深圳研究生院，深圳 518055)

基于矩陣模型進(jìn)行抗熒光干擾的藍(lán)藻原位檢測方法

類成龍1,2，姜玥璐2，周 進(jìn)2，勞永民2，何永紅2，蔡中華2

(1：清華大學(xué)生命學(xué)院，北京 100084)(2：清華大學(xué)深圳研究生院，深圳 518055)

藻藍(lán)蛋白與葉綠素a作為特征色素常用于表征藍(lán)藻的生物量. 藻藍(lán)蛋白與葉綠素a通常用熒光光譜或原位熒光強度檢測，但是在實際水體中藻藍(lán)蛋白與葉綠素a的熒光效應(yīng)相互干擾會影響測量精度，極大限制了該方法的應(yīng)用. 本文根據(jù)朗伯比爾定律，利用二階矩陣模型設(shè)計了一套在熒光檢測過程中“激發(fā)光-發(fā)射光”優(yōu)化抗干擾的波長選擇方法，并利用多元線性回歸分析建立了兩種色素濃度與熒光強度之間的多元校正線性模型，實驗驗證了所篩選藍(lán)藻熒光分析法中特定激發(fā)光和發(fā)射光波長的有效性. 本研究實現(xiàn)了兩種色素檢測過程中的成功解耦，可在藻藍(lán)蛋白的原位檢測中排除水體中藻藍(lán)蛋白與葉綠素a之間的相互干擾，提高藻藍(lán)蛋白和葉綠素a的原位檢測精度，為開發(fā)便攜式藍(lán)藻檢測傳感器時的波長選擇提供理論基礎(chǔ).

藻藍(lán)蛋白；葉綠素a；熒光檢測；解耦；抗熒光干擾

中國是世界上藍(lán)藻水華暴發(fā)最嚴(yán)重、分布最廣泛且藍(lán)藻種類最多的國家之一[1]，太湖、滇池、巢湖等內(nèi)陸湖泊均已成為我國藍(lán)藻水華暴發(fā)的高頻地區(qū)[2]. 藍(lán)藻水華的暴發(fā)會引起水體缺氧而導(dǎo)致水生動植物大量死亡，破壞水體生態(tài)系統(tǒng)[3-4]；其分泌的藻毒素進(jìn)入水體后，通過食物鏈、食物網(wǎng)或者飲用水進(jìn)入人體，對公眾健康造成極大的威脅[5-6]；藻類大量繁殖影響水質(zhì)以及水廠的運行，造成供水危機[7]；水華消亡時還會散發(fā)惡臭氣味，影響周邊的環(huán)境[8]. 因此，對藍(lán)藻水華的預(yù)報、預(yù)警以及控制是水生生態(tài)環(huán)境治理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對藍(lán)藻生物量的原位檢測是藍(lán)藻水華治理過程的核心，是水華預(yù)報與預(yù)警的基礎(chǔ)[9].

目前針對藍(lán)藻生物量的檢測主要有以下幾種方法：群落計數(shù)法[10]、吸光光度法[11-12]、多光譜遙感技術(shù)[13]、熒光檢測法[14-17]、流式細(xì)胞法[18]以及液相色譜法[19]等. 這些方法給日常監(jiān)測與科學(xué)研究帶來便利的同時，也均存在不足，主要體現(xiàn)在精度、準(zhǔn)確性、時效性以及人耗/時耗等方面，尤其在原位監(jiān)測上，更是存在瓶頸[20]. 藍(lán)藻生物量的熒光檢測法因其簡便性、靈敏度高、可原位檢測等特點而被廣泛使用，其中多以藻藍(lán)蛋白作為特征色素，利用二維熒光光譜法進(jìn)行檢測[21]. 目前用熒光檢測法檢測藍(lán)藻生物量的大多數(shù)研究皆是在藻藍(lán)蛋白的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜中選擇激發(fā)光與發(fā)射光波長(多選擇激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的峰值波長)，并建立藻藍(lán)蛋白濃度與熒光強度的線性關(guān)系[15,17,22-27]. 這些研究方法在單一色素的檢測中表現(xiàn)出很高的精確度，而在實際水體中，因藻藍(lán)蛋白與葉綠素a熒光效應(yīng)的相互干擾而影響測量精度，從而難以將藍(lán)藻與其他真核藻類進(jìn)行有效區(qū)分，極大限制了該方法的原位應(yīng)用.

本文以簡單易行的熒光分析法為基礎(chǔ)，運用二階矩陣模型，建立了一種以減少兩種色素相互干擾為目標(biāo)的特定波長篩選方法，再結(jié)合多元線性回歸分析對藻藍(lán)蛋白、葉綠素a、混合藻類的檢測實驗進(jìn)行驗證. 驗證結(jié)果表明，本文方法可抑制藻藍(lán)蛋白與葉綠素a的相互耦合，避免其他真核藻類對藍(lán)藻檢測的干擾，使藻藍(lán)蛋白的檢測達(dá)到抗熒光干擾的效果，從而實現(xiàn)藍(lán)藻生物量的精確檢測.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葉綠素a與藻藍(lán)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品均為Sigma標(biāo)準(zhǔn)試劑(藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-52468；葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-C5753)，所用溶劑為15%的乙醇PBS溶液(由PBS溶液中加入150 ml乙醇后定容至1 L而得，且在此溶劑中，葉綠素a與藻藍(lán)蛋白可以實現(xiàn)較大范圍濃度比的混合)；藻類培養(yǎng)使用BG-11培養(yǎng)基；藻類計數(shù)采用血球計數(shù)板；實驗中所用的儀器為熒光分光光度計(TECON-INFINITE-M200PRO，奧地利)，儀器參數(shù)為：Read: Number of flashes, 25; Read-Settle time, 0 ms; Mode: Top; Z-position: Manual, 20000 μm; Gain: Manual, 110；Integration: time, 20 μs；實驗中所用的藻類包括銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)(藍(lán)藻)和小球藻(Chlorellavulgaris，F(xiàn)ACHB-8)(綠藻)，均來自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB).

1.2 波長篩選方法的建立

藍(lán)藻生物量的熒光檢測法基于朗伯比爾定律[25]，以藻藍(lán)蛋白為特征色素建立其濃度與熒光強度的關(guān)系. 強度為I0的入射光平行照射到厚度為l、濃度為c的溶液表面，當(dāng)藍(lán)藻溶液極稀(滿足K·l·c≤0.05)時[14]，熒光發(fā)射光強If為：

If=2.3η·I0·K·l·c

(1)

式中，η為物質(zhì)的熒光系數(shù)，K為物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù).

在混合色素的熒光檢測過程中，不耦合檢測是指檢測過程中兩種色素產(chǎn)生的熒光互不干擾. 而用熒光分析法檢測藻藍(lán)蛋白與葉綠素a時，兩者存在很強的耦合效應(yīng). 結(jié)合多元線性回歸分析以及熒光光譜的疊加效應(yīng)[28]，可建立多元線性熒光檢測模型：

u1=h11·C1+h12·C2+b1u2=h21·C1+h22·C2+b2

(2)

式中，u1和u2分別為葉綠素a和藻藍(lán)蛋白的濃度；hij為線性系數(shù)；C1和C2分別為葉綠素a和藻藍(lán)蛋白檢測方法下的相對熒光強度值；b1和b2分別為葉綠素a和藻藍(lán)蛋白檢測模型公式中的常數(shù)項，即為朗伯比爾定律中提出線性項后的殘余項，也是儀器與環(huán)境噪聲的反映項.

定義熒光系數(shù)矩陣(H)為：

(3)

由上，特定波長的不同組合會導(dǎo)致熒光系數(shù)矩陣中的元素不同，H陣也代表了不同色素之間的干擾程度. 基于以上原理，可以結(jié)合矩陣中向量相關(guān)性原理尋找兩種色素相互干擾最小時的條件.

將(2)式轉(zhuǎn)換為：

(4)

定義檢測矩陣(A)為：

(5)

在不耦合雙色素系統(tǒng)的檢測中，熒光強度與色素濃度關(guān)系的模型應(yīng)為：

(6)

也即A陣應(yīng)為對角陣. 因而對于不同的方法組合，需要尋找一種方法使得檢測矩陣最接近于對角陣，也即使得A陣的兩個行向量相關(guān)性最差.

定義檢測解耦參數(shù)(S)為：

(7)

則由向量相關(guān)性理論可推導(dǎo)，S值越大，則矩陣中兩個行向量相關(guān)性越小. 因此S值可表示熒光檢測葉綠素a與藻藍(lán)蛋白時兩者熒光光譜實現(xiàn)分離的程度，也即分離程度越大，兩者的相互干擾越小.

通過對激發(fā)波長與發(fā)射波長的不同組合，得到一系列A矩陣，找到S值最大時所對應(yīng)的A矩陣，此時的方法組合即為最優(yōu)的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長. 而后根據(jù)多元線性回歸分析建立熒光強度與兩種色素濃度的關(guān)系，即為檢測藻藍(lán)蛋白與葉綠素a混合色素的模型.

具體激發(fā)光波長與發(fā)射光波長篩選流程如圖1 所示. 其中，C1、C2分別為預(yù)選的檢測葉綠素a的激發(fā)光波長范圍與發(fā)射光范圍；P1、P2分別為預(yù)選的檢測藻藍(lán)蛋白的激發(fā)光波長范圍與發(fā)射光范圍；Ni為特定波長組合的方法i. 所有數(shù)據(jù)處理在Matlab軟件(Matlab-R2012a)中完成，實現(xiàn)S值的篩選.

圖1 波長篩選方法Fig.1 Method of wavelength selection

1.3 驗證實驗

在驗證實驗中，對以下3種方法做對比：

本文研究方法(M1)：是指以本研究所篩選出的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長進(jìn)行檢測，結(jié)合多元線性回歸分析建立檢測模型；

最強波長模型(M2)：是指以色素?zé)晒夤庾V中的峰值波長進(jìn)行檢測，建立模型方法同M1[28]；

標(biāo)準(zhǔn)曲線法(M3)：是指波長選擇同M2，用單一色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線法建立模型[17,22-23].

1.3.1 色素檢測 將兩種色素配制不同濃度梯度的混合溶液，且保持每份溶液中葉綠素a與藻藍(lán)蛋白濃度比CChl.a∶CPC=1∶1. 保持其他實驗條件與前述相同，用M1、M2、M3 3種方法分別檢測相應(yīng)的熒光強度，同樣的濃度取3個樣本，同樣的樣本連續(xù)測3次.

1.3.2 藻類的檢測 本文用混合培養(yǎng)對數(shù)生長期的銅綠微囊藻與小球藻進(jìn)行實驗，以藻藍(lán)蛋白作為特征色素檢測銅綠微囊藻細(xì)胞濃度(cells/ml)與藻藍(lán)蛋白熒光強度的關(guān)系. 通過對單一銅綠微囊藻的個數(shù)與藻藍(lán)蛋白濃度的線性關(guān)系，建立藍(lán)藻細(xì)胞濃度的檢測模型. 藻液的培養(yǎng)條件為：300 ml培養(yǎng)瓶，藻液容積為200 ml；溫度為25±1℃；光照時間L∶D=12 h∶12 h，光照強度為3300±200 lx；每天搖晃1次，并隨機交換位置以保證每個培養(yǎng)瓶均接受到相同的光照；培養(yǎng)周期為15 d. 每天用M1、M2、M3 3種方法檢測混合藻液中藻藍(lán)蛋白的熒光強度，并計算藍(lán)藻的細(xì)胞濃度. 藍(lán)藻濃度標(biāo)準(zhǔn)值測量依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《水和廢水監(jiān)測分析方法》中的群落計數(shù)法，在顯微鏡下檢測[10].

1.3.3 結(jié)果指標(biāo)比較 在對色素標(biāo)準(zhǔn)品與活體藻類檢測中，用3個指標(biāo)對結(jié)果進(jìn)行評估：準(zhǔn)確率(或者誤差)、精密度和回收率. 準(zhǔn)確率的計算公式為：

(1)

誤差(e)= 1-準(zhǔn)確率

(2)

式中，檢測值為檢測結(jié)果；真值在色素檢測實驗中為色素配比時的標(biāo)準(zhǔn)濃度值，在活體藻類檢測中則指顯微計數(shù)法所獲得的濃度值.

標(biāo)準(zhǔn)差表征多次檢測值的可重復(fù)性，也即為檢測結(jié)果的穩(wěn)定性；其值越小，表示精密度越高. 在本文實驗中，精密度為同一濃度樣品6次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差.

回收率用來表征檢測方法的準(zhǔn)確度高低，其計算公式為：

(3)

式中，加標(biāo)量為加標(biāo)前濃度的20%且在檢測范圍內(nèi).

2 結(jié)果與討論

2.1 葉綠素a與藻藍(lán)蛋白的熒光光譜特征

激發(fā)光譜中(選取葉綠素a的發(fā)射波長為680 nm，藻藍(lán)蛋白的發(fā)射波長為648 nm)，葉綠素a的峰值出現(xiàn)在436 nm，而且從500 nm到630 nm逐漸升高，藻藍(lán)蛋白的峰值出現(xiàn)在626 nm，虛線框內(nèi)兩者具有很強的重疊耦合(圖2a)；發(fā)射光譜中(選取葉綠素a的激發(fā)波長為436 nm，藻藍(lán)蛋白的激發(fā)波長為626 nm)，葉綠素a的峰值出現(xiàn)在680 nm，藻藍(lán)蛋白的峰值出現(xiàn)在648 nm，虛線框內(nèi)兩者具有很強的重疊耦合(圖2b). 當(dāng)藍(lán)藻水華暴發(fā)時，水體中含有大量這兩種色素，彼此間的耦合則產(chǎn)生較強的熒光干擾.

當(dāng)CChl.a>500 μg/L時，葉綠素a的熒光強度與濃度不呈顯著的線性關(guān)系；當(dāng)CPC>2000 μg/L時，藻藍(lán)蛋白的熒光強度與濃度也不呈顯著的線性關(guān)系(圖2c). 從曲線形狀看兩者更接近于冪函數(shù)曲線，這與將朗伯比爾定律進(jìn)行泰勒級數(shù)分解后的結(jié)果一致：此時不滿足條件K·l·c≤0.05，則呈現(xiàn)一種冪函數(shù)關(guān)系[14]. 但此高濃度在實際水體檢測中不常見，因此本文只研究濃度在線性范圍內(nèi)的部分. 因而，葉綠素a的熒光線性濃度范圍上限為500 μg/L. 藻藍(lán)蛋白的熒光線性濃度范圍上限為2000 μg/L. 將圖2c中濃度范圍為0.03～500 μg/L的部分放大至圖2d，可知當(dāng)CChl.a>0.10 μg/L或者CPC>0.20 μg/L時，色素?zé)晒鈴姸扰c濃度呈現(xiàn)出很強的線性關(guān)系. 其中葉綠素a的相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.9944，藻藍(lán)蛋白的相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.9942. 濃度低于這個范圍時，檢測已經(jīng)無區(qū)分度. 因此，本文所研究的葉綠素a和藻藍(lán)蛋白的熒光線性濃度范圍分別為0.10～500 μg/L和0.20～2000 μg/L. 藻藍(lán)蛋白的線性濃度范圍更廣，適合在高濃度下檢測，滿足水華暴發(fā)時的測量需求；而葉綠素a的檢測限較低，靈敏度高，但是檢測范圍相比藻藍(lán)蛋白小.

圖2 葉綠素a與藻藍(lán)蛋白的熒光光譜性質(zhì)(葉綠素a與藻藍(lán)蛋白的激發(fā)光譜(a)；葉綠素a與藻藍(lán)蛋白的發(fā)射光譜(b)；葉綠素a與藻藍(lán)蛋白的熒光強度-濃度相關(guān)關(guān)系曲線(c)；葉綠素a與藻藍(lán)蛋白在低濃度下的熒光強度-濃度相關(guān)關(guān)系曲線(d))Fig.2 Excitation spectrum and emission spectrum of chlorophyll-a and phycocyanin

2.2 葉綠素a與藻藍(lán)蛋白干擾程度最小波長的篩選

按照第1節(jié)中的方法收集葉綠素a與藻藍(lán)蛋白的熒光光譜數(shù)據(jù)，在Matlab軟件(Matlab-R2012a)中運行本文提出的波長篩選方法模型，最終得出可最大程度上減弱兩種色素之間熒光干擾的波長組合：葉綠素a和藻藍(lán)蛋白的激發(fā)波長分別為440和600 nm，發(fā)射波長分別為688和640 nm.

2.3 葉綠素a與藻藍(lán)蛋白的濃度檢測

在葉綠素a與藻藍(lán)蛋白混合色素溶液的檢測中(圖3)，本文研究方法M1得到葉綠素a和藻藍(lán)蛋白的靈敏度分別為0.06 和0.1 μg/L，相比于方法M2與M3的結(jié)果具有一定提高. 3種方法的檢測上限并無明顯差異，與圖2c所顯示的一致，葉綠素a檢測上限為500 μg/L，藻藍(lán)蛋白檢測上限為2000 μg/L. M1方法中曲線線性程度最好，相關(guān)系數(shù)R2分別達(dá)到0.9948與0.9936，比M2方法和目前研究中常用的M3方法有顯著提高. 這說明本文研究方法能夠有效提高混合色素中葉綠素a與藻藍(lán)蛋白檢測的靈敏度與檢測穩(wěn)定性，提高檢測精度.

而無論是檢測葉綠素a還是藻藍(lán)蛋白，相同的色素濃度在3種方法檢測下，熒光強度呈現(xiàn)的規(guī)律均為：M1

圖3 葉綠素a(a)和藻藍(lán)蛋白(b)在3種方法檢測下的線性擬合結(jié)果 Fig.3 Linear correlation of chlorophyll-a (a) and phycocyanin (b) in fluorescence detection with the three methods

取1、10和100 μg/L 3種濃度的混合色素(保持每份溶液中CChl.a∶CPC=1∶1)，用1.3.1節(jié)中的描述方法進(jìn)行檢測(圖4). 比較M1與M2方法的結(jié)果(圖4a)，可發(fā)現(xiàn)在兩種色素的線性濃度范圍內(nèi)，M1所得到的結(jié)果優(yōu)于M2，說明不同特定波長的選擇對藻藍(lán)蛋白與葉綠素a的檢測精度產(chǎn)生影響，而不是單一色素檢測下熒光強度越強越好. M2方法劣于M1，一方面是因為選擇光譜中最強的峰值波長而未考慮兩種色素之間的耦合影響；另一方面則是因為熒光強度大，放大了因熒光不穩(wěn)定所帶來的誤差效應(yīng). 比較M2與M3方法的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)M2方法明顯優(yōu)于M3方法，說明多元校正線性模型對于提高兩種色素的檢測精確度同樣具有很大影響. 直觀從檢測結(jié)果來看，本文研究方法通過篩選熒光檢測中的激發(fā)光波長與發(fā)射光波長，能顯著提高藍(lán)藻檢測精度. 相比于目前普遍使用的M3方法，對波長進(jìn)行篩選并建立多元線性回歸模型具有顯著優(yōu)勢(One-way ANOVA,F>Fcrit，P-value<0.05).

對3種檢測方法下的結(jié)果進(jìn)行定量分析，比較準(zhǔn)確率、精密度與回收率3個指標(biāo)(皆為平均值)(圖4b)，發(fā)現(xiàn)M1方法檢測葉綠素a與藻藍(lán)蛋白的準(zhǔn)確率分別為90.4%和92.0%，相比于M2和M3方法分別高出2.0%～20.0%和4.3%～20.0%，具有明顯的優(yōu)勢；從精密度來看，M1方法的平均標(biāo)準(zhǔn)差最小，表征精密度最高，說明本研究方法的精密度與重復(fù)性更好，避開最強波長的熒光，在一定程度上可以減弱熒光不穩(wěn)定性所帶來的誤差，實現(xiàn)了兩種色素抗干擾性最強，提高了檢測結(jié)果的精密度；從回收率來看，M1方法的準(zhǔn)確性最高，更加驗證了本研究結(jié)果在檢測效果上的優(yōu)勢. 綜合上述參數(shù)的比較，本研究方法能提高混合色素檢測的準(zhǔn)確率，有效減弱兩種色素間的耦合作用，并具有較好的穩(wěn)定性.

圖4 3種方法下葉綠素a與藻藍(lán)蛋白不同混合濃度的檢測結(jié)果:3種方法與標(biāo)準(zhǔn)濃度的比較(a)；3種方法檢測指標(biāo)的比較(b)Fig.4 Detecting the concentration of chlorophyll-a and phycocyanin mixed with the three methods

2.4 藍(lán)藻與真核藻類混合濃度的檢測

藻藍(lán)蛋白作為藍(lán)藻的特征色素，其濃度與藍(lán)藻數(shù)量呈現(xiàn)高度的相關(guān)性[26]. 在BG-11培養(yǎng)基中進(jìn)行銅綠微囊藻與小球藻的混合培養(yǎng)，通過上述3種驗證方法對對數(shù)生長期內(nèi)藻藍(lán)蛋白的熒光強度與藍(lán)藻細(xì)胞濃度進(jìn)行線性回歸分析.

3種方法中，M1方法下線性回歸方程為：y=0.94x-0.29，R2=0.9994,其斜率最接近于1，且相關(guān)系數(shù)最大(圖5a). M2方法的檢測結(jié)果與M1較為接近，但依然不如M1檢測效果好，且M1與另外兩種方法的檢測結(jié)果具有顯著性差異(One-way ANOVA，F(xiàn)>Fcrit，P-value<0.05)，從圖5b可直觀看出3種方法檢測效果的差異. 以顯微計數(shù)值作為模擬值計算Nash-Sutcliffe效率系數(shù)為0.94，相比于陳緯棟等[25]的0.78以及Gregor等[29]的1.12具有較大改進(jìn)；相關(guān)系數(shù)高于楊飛等[17]的研究，檢測結(jié)果更加穩(wěn)定; 準(zhǔn)確率方面比Lee等[15]的80%～90%也有較大提高.

圖5 混合藻類在3種方法檢測下的結(jié)果(e-M1、e-M2、e-M3分別為M1、M2、M3方法的檢測誤差)Fig.5 Detecting results of Microcystis aeruginosa and Chlorella vulgaris mixing solution with the three methods

比較圖5與圖4發(fā)現(xiàn)，在實際檢測活體藻類的過程中，準(zhǔn)確率相比于色素的混合檢測略有下降. 其主要是因為對游離的藻藍(lán)蛋白的測定與細(xì)胞中原始狀態(tài)不同，不同種類藍(lán)藻、同種藍(lán)藻的不同細(xì)胞內(nèi)光合色素系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)差異以及相同細(xì)胞在不同生長環(huán)境與不同階段中的差異也會對熒光結(jié)果產(chǎn)生影響[15]. 本研究將藍(lán)藻光合系統(tǒng)中色素之間復(fù)雜的相互作用共同看作一個“黑匣子”，將其內(nèi)部的差異看作系統(tǒng)誤差來處理，活體藻類色素系統(tǒng)的光合效應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)色素相似，從而可以看出本文研究方法在提高檢測效果方面的優(yōu)勢. 盡管本文研究方法的結(jié)果與混合藻類中藍(lán)藻濃度的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果仍然呈現(xiàn)較好的相關(guān)關(guān)系，但對其內(nèi)部光合色素系統(tǒng)的研究可為進(jìn)一步提高藍(lán)藻的檢測精度提供很好的研究方向.

在混合藻類的培養(yǎng)過程中，3種方法的檢測誤差隨著時間增加呈現(xiàn)下降趨勢. 本文推測其原因為：在BG-11“富營養(yǎng)”水平下，培養(yǎng)的開始階段，兩種藻類的生長相互干擾較小，環(huán)境提供足夠的生長繁殖條件，藍(lán)藻與綠藻都呈“J”型曲線增長，且數(shù)量相當(dāng)，這與本文顯微鏡計數(shù)結(jié)果一致. 此時CChl.a∶CPC較高，葉綠素a與藻藍(lán)蛋白之間的熒光干擾較大，從而導(dǎo)致總體檢測誤差大. 此階段中，M1的誤差明顯比另外兩種方法小，本文研究方法的優(yōu)勢明顯. 到了培養(yǎng)后期，因環(huán)境中營養(yǎng)減少，藻類生長受限，但藍(lán)藻的競爭能力強[30]，使得藍(lán)藻濃度高于綠藻濃度，CChl.a∶CPC降低，葉綠素a對藻藍(lán)蛋白的熒光干擾降低，從而導(dǎo)致總體檢測誤差變小. 總體而言，M1的誤差依然最小. 活體藻類的實驗證明，本文的研究方法能夠顯著提高混合藻類中藍(lán)藻濃度的檢測精確度，本研究結(jié)果同樣適用于實際水體，且在藍(lán)藻占比越小時，本研究方法越具優(yōu)勢.

3 結(jié)論

1)使用本文所提出的二階矩陣模型進(jìn)行藍(lán)藻檢測過程中激發(fā)光波長與發(fā)射光波長的篩選，可找出藻藍(lán)蛋白受葉綠素a干擾最小的波長組合. 所篩選的“激發(fā)光-發(fā)射光”最優(yōu)抗干擾波長組合結(jié)果為：葉綠素a和藻藍(lán)蛋白的激發(fā)波長分別為440和600 nm，發(fā)射波長分別為688和640 nm.

2)對兩種色素以及活體藻液的實驗驗證結(jié)果表明：使用本研究的波長篩選方法，結(jié)合多元線性回歸分析，能夠克服目前藍(lán)藻檢測研究中存在的波長選擇問題，抑制兩種色素之間的耦合干擾，提高檢測的精準(zhǔn)度，實現(xiàn)藍(lán)藻生物量的抗熒光干擾原位檢測.

3)本文研究方法在混合藻液中藍(lán)藻占比越小時，抑制干擾提高檢測精度的優(yōu)勢越明顯.

4)本研究為混合色素?zé)晒鈾z測提供了一種篩選抗干擾激發(fā)光波長與發(fā)射光波長的科學(xué)方法，為藻藍(lán)蛋白熒光檢測傳感器的研制提供了理論基礎(chǔ)，并具有業(yè)務(wù)化的潛力.

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Anti-interferancein-situdetection of cyanobacteria based on matrix model

LEI Chenglong1,2, JIANG Yuelu2, ZHOU Jin2, LAO Yongmin2, HE Yonghong2& CAI Zhonghua2**

(1:SchoolofLifeScience,TsinghuaUniversity,Beijing100084,P.R.China)(2:GraduateSchoolatShenzhen,TsinghuaUniversity,Shenzhen518055,P.R.China)

Phycocyanin and chlorophyll-a are characterizations of cyanobacterial biomass. These two pigments are detectedinsituwith fluorescence spectrum method or fluorescence intensity. However, due to the fluorescence interference between phycocyanin and chlorophyll-a, the accuracy ofin-situdetection of cyanobacteria is relatively low, which limited the application of this method. In this study, we developed a novel method of fluorescence analysis based on a two-order matrix model and a multivariate calibration linear model for the correlation between the fluorescence intensity and pigment concentration, which was verified by experiment. The established method decoupled the two mixed pigments as well as quantitatively analyzed the wavelength selection of excitation and emission and largely eliminated the fluorescence interference between phycocyanin and chlorophyll-a, and therefore, significantly improved the accuracy ofin-situdetection of cyanobacteria. More importantly, our study can provide theoretical basis for the cyanobacteria detection sensor in how to select wavelengths.

Phycocyanin; chlorophyll-a; fluorescence detection; decoupling; anti-interference

； E-mail: caizh@sz.tsinghua.edu.cn.

DOI 10.18307/2017.0525

廣東省海洋與漁業(yè)廳科技攻關(guān)與研發(fā)項目(A201503D07)和深圳市科技創(chuàng)新委計劃項目(JCYJ20160608165926763，JCYJ20151117173236192，CXZZ20150529165045063)聯(lián)合資助. 2017-04-08收稿; 2017-05-17收修改稿. 類成龍(1992～)，男，碩士研究生； E-mail: chenglongl@139.com.