吳軍華 阮培森 宋啟發(fā)

PICU產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌耐藥率及其與抗菌藥物使用頻度相關性分析

吳軍華 阮培森 宋啟發(fā)

目的 了解兒科重癥監(jiān)護病房（PICU）產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）大腸埃希菌的耐藥率、耐藥基因及耐藥率與抗菌藥物使用頻度（DDDs）的相關性，為臨床兒童重癥感染的診治提供依據(jù)。方法 采用VITEK-2全自動微生物鑒定儀對102株大腸埃希菌進行鑒定，采用表型確證試驗進行ESBLs檢測，采用微量肉湯稀釋法檢測70株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對氨芐西林等24種抗菌藥物的藥物敏感性，采用PCR檢測耐藥基因。結果 102株大腸埃希菌中，70株產(chǎn)ESBLs，檢出率為68.6%。70株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對氨芐西林和頭孢唑啉的耐藥率高達95.0%以上，對氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢吡肟、頭孢曲松、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、四環(huán)素和甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑也存在較高的耐藥率（≥50%），檢出1株耐亞胺培南大腸埃希菌。耐藥基因檢出率：intl1為97.1%，ampC為92.9%，tem為62.9%，CTX-M1為25.7%，CTX-M 3為37.1%，acc、DHA1、oxa、shv、NDM、fox、per均未檢出。攜帶2、3和4種耐藥基因的菌株分別占25.7%（18/70）、25.7%（18/70）和12.9%（9/70）。產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對氨芐西林/舒巴坦和頭孢他啶的耐藥率與DDDs值呈正相關（r=0.998和0.999，均P＜0.05）。結論 PICU產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢出率高，耐藥模式復雜；多數(shù)菌株包含多個耐藥基因，部分藥物的DDDs值與大腸埃希菌耐藥率呈高度正相關；合理規(guī)范使用抗菌藥物，加強耐藥的監(jiān)控具有重要意義。

大腸埃希菌 耐藥基因 藥物使用頻度

大腸埃希菌是引起兒童重癥感染的產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）病原菌中最常見的菌種之一。近年來，隨著廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑及激素在臨床上的廣泛應用，兒童重癥感染分離的大腸埃希菌耐藥菌株以及多重耐藥菌株日益增多。由于各個地區(qū)的用藥情況不同，產(chǎn)ESBLs細菌的耐藥情況也有地區(qū)差異性，加強對耐藥菌耐藥性的檢測十分迫切[1]。為了解寧波市婦女兒童醫(yī)院兒科重癥監(jiān)護病房（PICU）產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥情況、合理使用抗菌藥物和評價療效提供依據(jù)，筆者對寧波市婦女兒童醫(yī)院PICU重癥感染患兒產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥率、耐藥基因及耐藥率與抗菌藥物使用頻度（defined daily doses，DDDs）的相關性進行了研究，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料和方法

1.1 菌株來源 收集2012年7月至2015年6月寧波市婦女兒童醫(yī)院PICU重癥患兒標本中分離得到的大腸埃希菌共102株，分別來源于痰液63株，占61.8%；鼻拭子10株，占9.8%；膿液7株，占6.9%；咽拭子和羊水各6株，各占5.9%；分泌物標本4株，占3.9%；血液和其他各3株，各占2.9%。

1.2 儀器和試劑 MH瓊脂、藥敏紙片（英國OXOID公司），Premix TaqTM、DL2000 DNA Marker和10X loading Buffer（大連寶生物公司），引物（美國Invitrogen公司），VITEK-2全自動微生物鑒定儀（法國生物梅里埃公司），藥敏平板GN4F（美國賽默飛公司），Vizion-自動微生物藥敏分析系統(tǒng)（美國先得公司），LB培養(yǎng)基（美國碧迪公司），OMEGABacterialDNAKit試劑盒（美國OMEGA公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及ESBLs表型確證 分離大腸埃希菌株，采用VITEK-2全自動微生物鑒定儀進行鑒定。采用美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI）推薦的表型確證試驗（紙片擴散法）：頭孢噻肟與頭孢噻肟/克拉維酸和頭孢他啶與頭孢他啶/克拉維酸，兩個組合中任何一組加克拉維酸者比不加克拉維酸者抑菌圈直徑≥5mm為ESBLs陽性。標準質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.2 藥敏試驗 參照2014年CLSI推薦的藥敏試驗方法[2]，采用微量肉湯稀釋法檢測產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對氨芐西林等24種抗菌藥物的藥物敏感性。

1.3.3 細菌DNA的提取 將產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌接種在MH瓊脂平板，36℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h，挑取3～4個菌落，接種環(huán)接種到5ml LB培養(yǎng)基，37℃震蕩過夜，OMEGA Bacterial DNA Kit試劑盒提取DNA。

1.3.4 PCR檢測耐藥基因 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌相關基因引物序列及循環(huán)參數(shù)參考文獻[3-4]。25μl PCR反應體系中2×T Premix Taq液12.5μl，上下游引物各10pmol，模板1μl，ddH2O補充。反應條件：95℃預變性3min，95℃變性30s，退火30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)，循環(huán)結束后72℃延伸10min。引物長度及各引物退火溫度見表1。PCR擴增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)預期條帶判斷結果。

表1 產(chǎn)E SBL s大腸埃希菌相關基因引物序列及產(chǎn)物長度

1.3.5 抗菌藥物DDDs獲取 通過醫(yī)院信息系統(tǒng)藥庫管理程序，提取PICU 2012年7月至2015年6月住院藥房抗菌藥物消耗數(shù)據(jù)，包括藥品名稱、劑型、規(guī)格、銷售數(shù)量等，獲取某一時期某藥DDDs。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。抗菌藥物DDDs與細菌耐藥率相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢出率 102株大腸埃希菌中，70株產(chǎn)ESBLs，檢出率為68.6%。

2.2 藥敏測定結果 70株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對24種抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥，其中對氨芐西林和頭孢唑啉的耐藥率較高達95.0%以上；對氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢吡肟、頭孢曲松、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、四環(huán)素和甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑也存在較高的耐藥率（≥50%）；對替卡西林/克拉維酸、頭孢他啶、左氧氟沙星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、米洛環(huán)素和亞胺培南的耐藥率分別為48.6%、45.7%、45.7%、44.3%、42.9%、20.0%、17.1%和1.4%；此外，對阿米卡星、多尼培南、厄他培南、美羅培南、替加環(huán)素和呋喃妥因的敏感率為100.0%，見表2。

2.3 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥基因分析 對70株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌擴增了12種耐藥基因，結果顯示5種耐藥基因有不同程度檢出，intl1檢出率為97.1%，ampC檢出率為92.9%，tem檢出率為62.9%，CTX-M1檢出率為25.7%，CTX-M3檢出率為37.1%，acc、DHA1、oxa、shv、NDM、fox、per均未檢出，見表3。攜帶2、3和4種耐藥基因的菌株分別占25.7%（18/70）、25.7%（18/70）和12.9%（9/70）。

2.4 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對抗菌藥物耐藥率與DDDs值的關系 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對氨芐西林/舒巴坦和頭孢他啶的耐藥率與DDDs值呈正相關（r=0.998和0.999，均P＜0.05），而對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松和氨曲南的耐藥率與DDDs值無相關性（均P＞0.05），見表4。

表2 70株產(chǎn)E SBL s大腸埃希菌對抗菌藥物的耐藥性分布[株（%）]

表3 70株產(chǎn)E SBL s大腸埃希菌耐藥基因分布

表4 產(chǎn)E SBL s大腸埃希菌對抗菌藥物耐藥率與DDD s值的關系

3 討論

大腸埃希菌是人類腸道中兼性厭氧正常菌群的優(yōu)勢菌種，隨著機體免疫力降低，大腸埃希菌可通過內源性途徑致感染機會增加，尤其兒童免疫功能低下，屏障功能差，當機體抵抗力降低，該菌侵入腸道外組織或器官時，可作為條件致病菌引起腸道外感染，如引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等感染[5]。大腸埃希菌也是兒童重癥感染最常見的致病菌，本研究收集重癥感染患兒各類標本培養(yǎng)陽性的大腸埃希菌，對其耐藥分布和機制進行研究，期望為臨床大腸埃希菌致兒童重癥感染抗菌藥物合理使用和療效評價提供依據(jù)，同時，了解PICU大腸埃希菌感染的現(xiàn)況，旨在加強醫(yī)院感染的控制和預防。

近年來大腸埃希菌在藥物篩選、誘導的雙重作用下耐藥性不斷增加，已呈現(xiàn)高水平、多重耐藥的發(fā)展趨勢。ESBLs首次在德國發(fā)現(xiàn)，是絲氨酸蛋白酶衍生物，是存在于細菌染色體外的蛋白質，主要由質粒介導產(chǎn)生，在廣譜酶結構基礎上經(jīng)個別氨基酸突變后衍生而來[6]。本研究結果顯示102株大腸埃希菌 ESBLs檢出率達68.6%，高于2014年CHINET中國細菌耐藥性檢測55.8%[7]的報道；同時也高于其他國家的檢出率，如印度（27%）、韓國（9.2%）、黎巴嫩（13.3%）和土耳其（17%）[2-3]。PICU收治的多為危重癥患兒，其自身免疫系統(tǒng)尚不完善，抵抗力較差，常采取氣管插管等侵入性治療，同時結合兒童的自身生理特點，早期抗感染治療時往往選用相對安全的β-內酰胺類抗菌藥物，這些因素都造成了兒童感染大腸埃希菌的產(chǎn)ESBLs率較高。

本研究顯示70株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對24種抗菌藥物均存在不同程度的耐藥，其中對氨芐西林和頭孢唑啉的耐藥率較高達95%以上，與Ahmad等[8]及Tan等[9]的研究一致；對頭孢菌素類、喹諾酮類的耐藥率較高（＞50%）；而對磺胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類及氯霉素類耐藥率相對較低（17.1%～48.6%），與Yayan等[10]報道一致。國內外均有多次報道發(fā)現(xiàn)對碳青霉烯耐藥的大腸埃希菌[11-12]，本次研究檢出1株耐亞胺培南大腸埃希菌，應引起高度重視。

本研究顯示intl1檢出率為97.1%，ampC檢出率為92.9%，tem檢出率為 62.9%，CTX-M1檢出率為25.7%，CTX-M3檢出率為37.1%，高于Tan等[9]的研究；acc、DHA1、oxa、shv、NDM、fox、per均未檢出。攜帶2種、3種和4種耐藥基因的菌株分別占25.7%、25.7%和12.9%，雖低于Rezai等[13]的研究結果，但耐藥基因與耐藥性有關，兩種以上耐藥基因的高檢出率也證實本地區(qū)細菌耐藥情況嚴重，多重耐藥模式復雜。

趙靜等[14]研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌耐藥率與亞胺培南/西司他丁、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦的DDDs值呈正相關，這說明減少相關藥物的臨床用量可能對控制大腸埃希菌的耐藥性有實際臨床意義。本研究顯示產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對氨芐西林/舒巴坦和頭孢他啶的耐藥率與DDDs值呈正相關，表明本地區(qū)PICU大腸埃希菌耐藥性與部分抗菌藥物臨床用量密切相關，提示應加強抗菌藥物臨床應用監(jiān)管，控制抗菌藥物用量，減少大腸埃希菌耐藥性的產(chǎn)生。

大腸埃希菌是兒童重癥感染的主要致病菌之一，并有較高的產(chǎn)ESBLs率。既往資料[15]顯示大腸埃希菌在寧波市婦女兒童醫(yī)院PICU感染菌中排名第4，革蘭陰性桿菌中排名第3，因此，明確其耐藥分布和機制，對大腸埃希菌致兒童重癥感染抗菌藥物的合理使用和療效評價、延緩細菌耐藥性的產(chǎn)生、控制耐藥菌株的播散和防止醫(yī)院感染均具有十分重要的意義。

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Antimicrobial resistance of extended spectrum β-lactamase Escherichia coli and its correlation w ith defined daily doses of antibiotics in pediatric ICU

WU Junhua,RUAN Peisen,SONG Qifa.Department of Pediatrics,Ningbo Women and Children's Hospital,Ningbo 315012,China

Escherichia coli Resistance genes Defined daily doses

2016-08-03）（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.16.2016-1215

寧波市自然科學基金(2012A610235)；寧波市自然科學基金(2013A610246)

315012 寧波市婦女兒童醫(yī)院兒科（吳軍華）；浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院（阮培森）；寧波市疾病預防控制中心微生物檢驗所（宋啟發(fā)）

吳軍華，E-mail:w u data@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the antim icrobial resistance of Escherichia coli p roducing extended spectrum β-lac tamases(ESBLs)and its correlation w ith defined daily doses(DDDs)of antibiotics in ped iatric ICU (PICU). Methods Total 102 c linical strains of Escherichia coliwere identified w ith VITEK-2,the ESBLs were detected w ith doub le disk synergy test.The suscep tibility of 70 Escherichia coli p roducing ESBLs to am picillin and other antim ic robial agents was detected by broth d ilution method and d rug resistance genes were detected by polymerase chain reaction(PCR). Results In 102 Escherichia colistrains,ESBLs were detected in 70 cases(68.6%),in which the rates of resistance to am picillin and cefazolin were＞95.0%,the rates of resistance to am p icillin/sulbactam,aztreonam,cefep ime,ceftriaxone,com pound sulfamethoxazole, piperacillinsulbactam,tetracyc lines and trimethop rim/sulfamethoxazole were all above 50.0%,the resistance to im ipenem was detected in one strain.The antim ic robial resistance gene intl1 was detected in 97.1%strains,am pC in 92.9%,tem in 62.9%, CTX-M1 in 25.7%,CTX-M 3 in 37.1%,acc,DHA1,oxa,shv,NDM,fox,per genes were not detected.Results showed that 25.7%(18/70),25.7%(18/70)and 12.9%(9/70)strains carried 2,3 and 4 strains resistant genes,respec tively.The changes of d rug resistance of Escherichia coli were significantly correlated w ith d rug DDDs of amp icillin/sulbactam and ceftazid ime (r=0.998 and 0.999,both P＜0.05). Conclusion The detection rate of Escherichia colip roducing ESBLs is high in PICU,and the DDDs of some antibiotics are positively correlated with d rug resistance,ind icating that rational use of antibacterial d rugsand strengthening resistance monitoring are im portant in PICU.