金兒 孟文 馮興 葉健 江洪 王利民

GPRC5A基因在肺腺癌中的表達及臨床意義

金兒 孟文 馮興 葉健 江洪 王利民

目的 了解G蛋白偶聯(lián)受體C型家族5A（GPRC5A）基因在肺腺癌組織及癌旁正常組織中的表達，并探討其臨床意義。方法 分別采用Real-time PCR和Western b lot法檢測25例肺腺癌組織及癌旁正常組織GPRC5AmRNA和蛋白表達水平。應(yīng)用免疫組化法檢測93例肺腺癌組織及癌旁正常組織GPRC5A蛋白的表達情況，并分析GPRC5A蛋白的表達與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 25例肺腺癌組織中GPRC5A mRNA和蛋白表達水平均明顯低于癌旁正常組織（均P＜0.05）。93例肺腺癌中GPRC5A蛋白低表達率為55.9%，均表達在胞質(zhì)和胞膜中。GPRC5A蛋白的表達與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（均P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小均無關(guān)（均P＞0.05）。Kap lan-Meier生存曲線顯示，GPRC5A高表達的患者3年生存率為73.7%，高于低表達患者的39.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 結(jié)論 GPRC5A在肺腺癌組織中低表達，其低表達與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，可作為估計生存率的獨立指標。

肺腺癌 G蛋白偶聯(lián)受體C型家族5A 預(yù)后

近二十年來，肺癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)均有較大 幅度的增長，是威脅人類健康和生命最主要的惡性腫瘤之一，其致死率高居各種惡性腫瘤之首，其中非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌總數(shù)的85%[1]。肺癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素參與的多步驟、多階段過程，它與環(huán)境因素、遺傳因素緊密相關(guān)。目前對肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制尚不清楚。G蛋白偶聯(lián)受體C型家族5A（GPRC5A）基因位于12p13-p12.3，1998年首次在人頭頸鱗狀細胞癌的細胞系UMSCC-22B中被發(fā)現(xiàn)[2]。近年來發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Tao等[3]研究發(fā)現(xiàn)小鼠GPRC5A基因敲除導(dǎo)致肺癌的發(fā)生，故GPRC5A基因被認為是一種新的抑癌基因。目前有關(guān)肺癌GPRC5A基因的研究主要局限于細胞和動物中，而在人肺癌組織中較少。本研究擬檢測GPRC5A基因在肺腺癌組織及其對應(yīng)癌旁正常組織中的表達水平，探討其表達與肺腺癌臨床特征的關(guān)系，并分析其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2009年1月至2012年5月在本院手術(shù)切除的肺腺癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織標本93例，其中男44例，女49例；年齡43～74（60.08±8.34）歲。留取25例新鮮肺腺癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織（距腫瘤邊緣5cm以上的組織）。所有患者均為首次發(fā)現(xiàn)并確診肺腺癌，排除有其他臟器轉(zhuǎn)移或其他腫瘤史、術(shù)前接受過放化療和其他生物治療的患者，術(shù)后均存活1個月以上。所有患者不伴有慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺間質(zhì)纖維化及其他感染性疾病。

1.2 Real-time PCR法檢測肺腺癌組織及癌旁正常組織GPRC5A mRNA表達 將25例新鮮肺腺癌手術(shù)標本組織及癌旁正常組織剪成小塊，在液氮中磨成粉末，稱取100mg組織加入1ml Trizol（美國Invitrogen公司），根據(jù)說明抽提總RNA。用NanoDrop 2000（美國Thermo公司）測定RNA濃度，RNA純度為1.8～2.0時，采用TOYOBO ReverTra Ace qPCR RTMaster Mix試劑盒（日本TOYOBO公司）逆轉(zhuǎn)錄cDNA。Real-time PCR采用Applied Biosystems power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（美國Life Technologies公司），根據(jù)說明在ABI 7500 PCR儀中操作完成。反應(yīng)條件：95℃10min，95℃15s，64℃1min，共40個循環(huán)。其中GPRC5A上游引物：5′-GCCTCACCTTCGCCTTCATC-3′，下游引物：5′-CAACTCGTTTCGATTTCTGACAA-3′；GAPDH上游引物：5′-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCAT-3′，下游引物：5′-CAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參照。

1.3 Western blot法檢測肺腺癌組織及癌旁正常組織GPRC5A蛋白表達 稱取25例肺腺癌組織及癌旁正常組織各約500mg，加入蛋白裂解液，用電動玻璃勻漿機混勻，低溫離心，取上清液。采用Western blot法檢測GPRC5A蛋白表達，GPRC5A多克隆抗體（兔抗人）購自中國Proteintech公司；GAPDH抗體（兔抗人）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）為進口分裝液體，購自北京中杉金橋生物公司（原產(chǎn)進口為凍干粉劑，原產(chǎn)地：美國）。蛋白表達的半定量檢測采用Quantity One GS-800軟件對電泳圖進行圖像分析，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集，進行灰度值測定。以GPRC5A與GAPDH灰度值的比值表示GPRC5A蛋白的相對表達量。每個組織蛋白重復(fù)實驗3次，取其平均值作統(tǒng)計分析。

1.4 免疫組化法檢測93例肺腺癌組織及癌旁正常組織GPRC5A蛋白的表達情況 一抗為GPRC5A多克隆抗體（兔抗人），購自中國Proteintech公司；二抗為二步法抗兔通用型免疫組化檢測試劑盒（ChemMateTMEn－Vision+HRP/DAB Rb&Mo），購自美國GeneTech公司。按免疫組化二步法試劑盒說明書中步驟行免疫組化染色，Olympus顯微鏡（×200）下觀察。GPRC5A免疫結(jié)果的判定標準如下：光鏡下計數(shù)400個腫瘤細胞，以免疫染色的強度（陰性：0分，弱陽性：1分，中度陽性：2分，強陽性：3分）和免疫染色的陽性細胞數(shù)（無：0分，＞0%～25%：1分，＞25%～50%：2分，＞50%～75%：3分，＞76%：4分）為標準，兩項評分相乘得到的分數(shù)作為每例標本的最終分數(shù)，＜6分為低表達，≥6分為高表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier生存分析法比較不同GPRC5A蛋白表達患者的預(yù)后。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 25例肺腺癌組織及癌旁正常組織GPRC5A mRNA和蛋白表達水平 肺腺癌組織GPRC5A mRNA表達水平為0.24±0.18，明顯低于癌旁正常組織的0.60±0.42，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。肺腺癌組織GPRC5A蛋白的表達水平為0.66±0.76，明顯低于癌旁正常組織的1.59±1.23，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 GPRC5A蛋白的表達與臨床病理特征的關(guān)系 免疫組化檢測了 93例肺腺癌組織及癌旁正常組織GPRC5A蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GPRC5A在肺腺癌組織及癌旁正常組織中均定位于胞質(zhì)和胞膜，沒有核表達。肺腺癌組織中GPRC5A存在染色陰性、弱陽性、中度陽性和強陽性，而癌旁正常組織均為強陽性，見圖2（插頁）。93例肺腺癌患者中有52例（55.9%）出現(xiàn)GPRC5A蛋白低表達，93例肺腺癌組織均未發(fā)現(xiàn)免疫染色的強度和陽性細胞數(shù)乘積高于癌旁正常組織。GPRC5A蛋白的表達與腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（均P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小均無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

圖1 25例肺腺癌組織及癌旁正常組織G P R C5A m RN A和蛋白表達水平 [a：R eal-t i me P C R法檢測肺腺癌組織及癌旁正常組織G P R C5Am RN A相對表達量；b：W e st e r n b l o t法檢測肺腺癌組織及癌旁正常組織G P R C5A蛋白表達電泳圖（T指肺腺癌組織，N指癌旁正常組織，標注的1、2、3分別指代表性的3例病例標本）]

表1 G P R C5A蛋白的表達與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 GPRC5A表達與肺腺癌患者生存率的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線顯示，GPRC5A高表達的患者3年生存率為 73.7%，高于低表達患者的39.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

圖3 G P R C5A表達與肺癌患者生存率的關(guān)系

3 討論

GPRC5A基因位于12p13-p12.3,是近年來新發(fā)現(xiàn)的全反式維甲酸誘導(dǎo)的基因[4]，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡。GPRC5A是G蛋白偶聯(lián)受體，由胞外區(qū)、7個跨膜糖蛋白和胞內(nèi)區(qū)組成，至今配體還不明確，故又稱之為孤兒受體。

GPRC5A基因在不同腫瘤中功能不同。在乳腺癌和卵巢癌中的GPRC5A基因是癌基因，乳腺癌中GPRC5A基因表達增高，并促進乳腺癌細胞株的增殖[5-6]，提示GPRC5A基因的表達促進了腫瘤細胞增殖。而在肺癌中GPRC5A基因是特異性的抑癌基因，GPRC5A基因與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。Tao等[3]研究發(fā)現(xiàn)GPRC5A純合子敲除的小鼠在1～2年內(nèi)有76%出現(xiàn)肺腺瘤，17%患肺腺癌；而在雜合子和野生型小鼠中，只有11%和10%的小鼠出現(xiàn)肺腺瘤，無一例發(fā)生癌變。Fujimoto等[7]發(fā)現(xiàn)GPRC5A純合子敲除的小鼠暴露在含4-甲基亞硝基吡啶基丁酮的煙霧中，可致肺腺瘤和腺癌時間大大提前，而且致癌的發(fā)生率高達80%，遠高于對照組的17%。另外，Wu等[8]研究證明暴露于流血嗜血桿菌所致的慢性炎癥可提高GPRC5A（-/-）小鼠腺癌的發(fā)生率，加速肺癌形成；長期慢性感染可以導(dǎo)致GPRC5A基因低表達，并與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。GPRC5A在胎兒和成人肺組織中高表達[9]。人肺癌組織的GPRC5A的表達明顯低于周圍正常組織[2，10]。

本研究揭示了GPRC5A基因在腺癌的表達以及與臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性。首先，筆者采用Real-time PCR法和Western blot法檢測了25例肺腺癌組織及癌旁正常組織的GPRC5A mRNA和蛋白表達，發(fā)現(xiàn)癌組織中GPRC5A mRNA和蛋白表達均明顯低于癌旁正常組織。然后，筆者采用免疫組化法分析了GPRC5A蛋白在93例肺腺癌組織的表達情況，分析其與肺腺癌臨床特征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPRC5A蛋白在肺腺癌中低表達，在癌旁肺組織中高表達，與以往文獻[10-11]報道一致。與肺腺癌相反，有研究報道乳腺癌、卵巢癌以及胃癌中GPRC5A高表達[6，12-13]，明確為癌基因。GPRC5A基因在不同腫瘤中表達不同，對腫瘤增殖、凋亡的作用也完全不一致，原因尚不明確，可能與腫瘤類型、腫瘤微環(huán)境的差異以及調(diào)控機制的復(fù)雜多樣有關(guān)，也說明GPRC5A存在復(fù)雜的調(diào)控機制。此外，GPRC5A表達與腫瘤分化顯著相關(guān)，GPRC5A表達越低，NSCLC分化越差。GPRC5A是維甲酸誘導(dǎo)基因，研究發(fā)現(xiàn)在5′近端的GPRC5A基因上游有維甲酸受體的結(jié)合位點[2-3，14]，而維甲酸與細胞分化直接相關(guān)，由此，GPRC5A基因可能是維甲酸誘導(dǎo)腫瘤細胞分化作用的重要基因。肺腺癌中GPRC5A低表達與腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，因此，筆者認為GPRC5A低表達與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，檢測其表達水平可作為判定惡性生物學(xué)行為的參考指標。應(yīng)用 Kaplan-Meier分析GPRC5A在肺腺癌患者預(yù)后的意義結(jié)果顯示，GPRC5A表達水平低的患者生存時間較短。

綜上所述，GPRC5A在肺腺癌組織中的表達相對于癌旁正常組織顯著下調(diào)，而且GPRC5A低表達與腫瘤分化、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。本研究結(jié)果表明，GPRC5A低表達提示NSCLC患者預(yù)后較差，可作為一個NSCLC預(yù)后的重要分子標志。該結(jié)果對于評估腺癌的臨床預(yù)后具有一定重要的價值，同時為今后選擇腺癌靶向治療提供了理論基礎(chǔ)。

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Expression of GPRC5A in lung adenocarcinoma and its clinical significance

JIN Er,MENG Wen,FENG Xing,et al.Department of Respiratory Medicine,Nanjing Medical University Affiliated Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China

Lung adenocarcinoma GPRC5A Prognosis

2016-06-08）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.16.2016-864

310006杭州市衛(wèi)生科技計劃（重點）項目（2016Z02）；杭州市社會發(fā)展自主項目（20160533B10）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2014K Y B189）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院、南京醫(yī)科大學(xué)附屬杭州醫(yī)院呼吸內(nèi)科（金兒、葉健、王利民），心胸外科（孟文、馮興、江洪）

王利民，E-mail：lemonw lm@163.com

【 Abstract】 Objective To detect the exp ression of G p rotein-coup led recep tor c lass C g roup 5 member A(GPRC5A)in human lung adenocarcinoma and to investigate its c linicalsignificance.Methods The exp ression ofGPRC5Am RNA and p rotein were detected by Real-time PCR and Western b lot in 25 cases of lung adenocarcinoma tissues and ad jacentnon-tumor tissues, respec tively.Immunohistochem istry was used to detect the exp ression of GPRC5A in 93 cases of lung adenocarcinoma and ad jacent normal tissues.The c linical significance of GPRC5A exp ression in lung adenocarcinoma was analyzed. Results The exp ression ofGPRC5AmRNA and p rotein in lung adenocarcinoma tissues were significantly lower than those in ad jacentnormal tissues(both P＜0.05).Immunohistochem istry showed that the low exp ression rate of GPRC5A was 55.9%in 93 cases of lung adenocarcinoma.The low exp ression of GPRC5A was correlated w ith the degree of histologic d ifferentiation,c linical stage,and lym ph node metastasis(all P＜0.05),while not correlated w ith gender,age and tumor size(all P＞0.05).Kap lan-Meier survival curve showed that the 3-year survival rate ofpatients w ith overexp ressed GPRC5A was 73.7%,which was higher than thatof low exp ression patients (39.4%,P＜0.01). Conclusion The exp ression of GPRC5A is downregulated in lung adenocarcinoma. Downreguation ofGPRC5A exp ression is significantly associated w ith the deg ree ofhistologic d ifferentiation,c linicalstage,lymph nodemetastasis and p rognosis ofpatients w ith lung adenocarcinoma.