黃麗密 王凱 梁雅琴 余震 翁華春 錢燕

●論 著

魚油脂肪乳劑對脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肝臟的保護作用研究

黃麗密 王凱 梁雅琴 余震 翁華春 錢燕

目的 探討魚油脂肪乳劑對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷（ALI）大鼠肝臟的保護作用及作用機制。 方法 將60只幼年雄性SD大鼠分為Blank組、LPS組和Omega組，每組20只。穿刺大鼠尾靜脈，Blank組和LPS組注射0.9%氯化鈉溶液，Omega組注射10%Omegaven，連續(xù)7d。第8天向Blank組大鼠氣管內(nèi)噴灑0.9%氯化鈉溶液，Omega組和LPS組大鼠噴灑LPS。8h后麻醉大鼠，開腹經(jīng)髂總靜脈抽取血液，并切取肝組織和肺組織，觀察各組大鼠肝組織和肺組織的病理改變，檢測血清中ALT、AST和前列腺素E2（PGE2）濃度。結(jié)果 Blank組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞未見變性；肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出及炎癥細胞浸潤。Omega組和LPS組肝組織表現(xiàn)為輕度非特異性炎癥改變，肺組織可見明顯炎癥細胞浸潤和出血。LPS組ALT和AST明顯高于Blank組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。Omega組與Blank組、LPS組ALT和AST比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。LPS組PGE2濃度明顯高于Omega組和Blank組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；但Omega組和Blank組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 魚油脂肪乳劑能夠減輕LPS引起的肝損傷，其可能是通過調(diào)節(jié)花生四烯酸的代謝對ALI大鼠發(fā)揮保護作用。

魚油 急性肺損傷 肝功能 花生四烯酸

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種臨床常見的危重病癥，也是現(xiàn)代危重醫(yī)學(xué)的一大難題。目前認(rèn)為ALI是全身炎癥反應(yīng)綜合征在肺部的表現(xiàn)，是機體過度的炎癥反應(yīng)[1]。營養(yǎng)治療在危重病患者的治療中舉足輕重。臨床常用的以大豆油為基礎(chǔ)的脂肪乳劑富含大量ω-6多不飽和脂肪酸，在創(chuàng)傷、感染等嚴(yán)重應(yīng)激狀態(tài)下可影響粒細胞活性，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化增加，器官功能損害加重，其中嚴(yán)重并發(fā)癥是腸外營養(yǎng)相關(guān)性肝損害[2-3]。這使得臨床使用以大豆油為基礎(chǔ)的脂肪乳劑處于進退兩難的境地。Liu等[4]研究顯示增加ω-3/ω-6多不飽和脂肪酸的比例，能減少炎性物質(zhì)產(chǎn)生，以競爭花生四烯酸（arachidonic acid，AA）至二十烷類物質(zhì)的合成途徑。尤文（Omegaven）是以進口魚油為原料的ω-3脂肪乳劑，其主要成分為二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），機體自身只能極少量合成。EPA和DHA可增加細胞膜磷脂ω-3多不飽和脂肪酸成分，從而調(diào)節(jié)機體內(nèi)一系列細胞因子的水平。本文旨在研究魚油脂肪乳劑對大鼠ALI模型肝組織的保護作用和作用機制，從而體現(xiàn)魚油脂肪乳劑在ALI的應(yīng)用價值，以及為ALI的臨床營養(yǎng)治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級幼年雄性SD大鼠60只，日齡21d，體質(zhì)量160～180g，由上海斯萊克動物有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2003-0003。溫州醫(yī)科大學(xué)清潔級實驗室內(nèi)飼養(yǎng)，晝夜照明12/12h，相對濕度70%，飼養(yǎng)溫度25℃。

1.2 主要試劑和儀器 10%Omegaven：中國華瑞制藥有限公司，100ml∶10g∶1.2g；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，E.coliO111∶B4）：美國Sigma-Aldrich公司，10mg；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）試劑盒：上海西唐科技有限公司。日本Olympus CX21FS1型普通光學(xué)顯微鏡，瑞典LKB-V2088型超薄切片機和日本Olympus AU7100全自動生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 動物分組和ALI模型制備 60只幼年雄性SD大鼠隨機分為Blank組、LPS組和Omega組3組，每組20只。將大鼠尾靜脈穿刺成功后并固定，Blank組和LPS組大鼠注射0.9%氯化鈉溶液，Omega組注射10% Omegaven，劑量為30ml/（kg·d），連續(xù)7d。第8天向Blank組大鼠氣管內(nèi)噴灑0.9%氯化鈉溶液，Omega組和LPS組噴灑LPS，劑量為0.5mg/kg。

1.3.2 標(biāo)本制備 在氣管內(nèi)噴灑0.9%氯化鈉溶液或LPS 8h后，用10%水合氯醛3.5～4.0ml/kg經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，切開下腹部，經(jīng)髂總靜脈抽取血液3～5ml，2 000r/min離心15min，吸取血清置EP管待行ELISA法及血生化檢測。抽取血液后進一步切開上腹部取出肝組織。再打開胸腔取出肺組織。把肝組織及肺組織置于4%甲醛溶液中保存，待行常規(guī)HE染色。

1.3.3 模型觀察及標(biāo)本檢測

1.3.3.1 一般情況 每天記錄大鼠存活數(shù)，并觀察大鼠精神、活動狀態(tài)。

1.3.3.2 肝、肺組織病理檢查 4%甲醛溶液固定的肝組織、肺組織，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度為4μm，常規(guī)HE染色。光鏡下觀察肝臟結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)改變及肺組織肺泡、血管周圍的炎癥細胞浸潤情況。

1.3.3.3 血生化檢測 全自動生化分析儀檢測ALT和AST。

1.3.3.4 血清中PGE2濃度檢測 按照試劑盒說明書，采用ELISA法檢測血清中PGE2濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，方差齊者兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊者采用Tamhane′s T2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物一般情況 第1～7天靜脈營養(yǎng)期間，Blank組和Omega組各死亡2只。Omega組和LPS組氣管內(nèi)噴灑LPS后，大鼠均出現(xiàn)呼吸急促，精神較差，蜷縮成團，毛發(fā)豎起、蓬亂，少數(shù)伴有頭部顫動，拒食。2h左右各組出現(xiàn)死亡大鼠，其中Blank組和Omega組各死亡2只，LPS組死亡3只。存活大鼠狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，活動可，攝食，飲水，毛發(fā)光亮整齊。

2.2 肝、肺組織病理檢查 Blank組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞未見變性，間質(zhì)未見明顯的炎癥細胞浸潤。Omega組和LPS組光鏡下表現(xiàn)為輕度非特異性炎癥改變，肝小葉結(jié)構(gòu)存在，肝細胞彌漫混濁腫脹,部分氣球樣變，肝細胞輕度水樣變性，少量淋巴細胞浸潤，部分肝竇擴張、瘀血，中央靜脈內(nèi)瘀血，偶可見到點灶狀肝細胞壞死，見圖1（插頁）。Blank組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出及炎癥細胞浸；Omega組和LPS組均有明顯的炎癥反應(yīng)，光鏡下見大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡隔增厚，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)炎性細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有滲出液，甚至有透明膜形成，見圖2（插頁）。

2.3 3組大鼠ALT和AST比較 3組大鼠ALT和AST比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。LPS組ALT和AST明顯高于Blank組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。Omega組與Blank組、LPS組ALT和AST比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 3組大鼠ALT和AST比較（U/L）

2.4 3組大鼠血清PGE2濃度比較 Omega組、LPS組、Blank組PGE2濃度分別為（24.61±4.67）、（139.24±23.43）和（15.52±4.65）pg/ml，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。LPS組PGE2濃度明顯高于Omega組和Blank組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；但Omega組與Blank組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

ALI是由多種肺內(nèi)外致病因子引起的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭。其主要病理特點是肺上皮細胞和內(nèi)皮細胞屏障廣泛性受損，肺毛細血管通透性增強，從而致使中性粒細胞涌入肺組織，導(dǎo)致肺內(nèi)促炎與抗炎因子失衡。ALI不僅僅是單純意義上的肺部疾病，也是全身系統(tǒng)炎性疾病的肺部表現(xiàn)。DiMinno等[5]研究認(rèn)為在炎癥反應(yīng)中伴有大量自由基產(chǎn)生，肝損傷的病理過程多為自由基參與下的炎癥反應(yīng)，過多的活性氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞脂肪酸鏈和細胞膜的完整性，損傷肝臟的各種細胞，引起血漿ALT的增高。杜燁瑋等[6]曾報道給衰老大鼠靜脈注射LPS 2h后發(fā)生ALI，6h后血中TBil含量及ALT活性明顯升高，提示ALI可在一定程度上誘導(dǎo)肝功能受損。本實驗ALI模型從臨床表現(xiàn)及肝、肺組織病理變化情況證實是成功的，同時說明ALI模型存在肝臟的損害。Omega組和LPS組肺組織光鏡下可見肺灶性出血，肺泡壁增厚，肺泡和肺間質(zhì)水腫，大量炎性細胞浸潤，提示有急性炎癥反應(yīng)。Omega組和LPS組肝組織在光鏡下可見非特異性炎癥改變。Omega組和LPS組ALT和AST均升高，提示肝功能受損。

ω-3多不飽和脂肪酸具有強有力的抗炎作用，可以抑制免疫抑制物PGE2的產(chǎn)生[7]。PGE2是AA經(jīng)環(huán)加氧酶（COX-2）代謝后的產(chǎn)物。LPS可以誘導(dǎo)PGE2的產(chǎn)生[8]。PGE2在由COX-2表達誘導(dǎo)的急性和慢性炎癥中發(fā)揮重要作用[9]。各種致病因素造成肝臟損害時，Kupffer細胞被激活產(chǎn)生大量的細胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6，這些因子可誘導(dǎo)COX-2表達及前列腺素合成參與肝臟的炎性損傷。LPS可以誘導(dǎo)肝細胞多種炎癥相關(guān)因子的表達[10]。ω-3多不飽和脂肪酸在COX-2和脂氧合酶的作用下產(chǎn)生前列腺素3和白三烯B5，對中性粒細胞的趨化、聚集和釋放溶菌酶等的作用顯著降低；其代謝產(chǎn)物為EPA和DHA，具有抑制炎癥反應(yīng)，下調(diào)過度的炎癥反應(yīng)，改善免疫功能等作用；EPA和DHA能抑制細菌LPS誘導(dǎo)NF-κB的活化和COX-2的表達[11]。EPA不僅能降低外源性刺激因素LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，還可以減少內(nèi)源性刺激因素PGE2誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。AA和EPA是類花生酸類物質(zhì)和前列腺素類的前體物質(zhì)，AA是促炎物質(zhì)[11]，EPA具有明顯的抗炎作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，Omega組PGE2濃度明顯低于LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而Omega組與Blank組PGE2濃度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明10%Omegaven能調(diào)節(jié)AA的代謝，降低ALI大鼠產(chǎn)生PGE2，減輕炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫作用。LPS組ALT和AST明顯高于Blank組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；而Omega組與Blank組ALT和AST比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。提示魚油脂肪乳劑能減輕LPS引起的肝功能損害，同時提示魚油脂肪乳劑不具有像治療肝損傷的藥物一樣的作用，不能完全抵消LPS導(dǎo)致的肝功能損害。

綜上所述，魚油脂肪乳劑可能是通過競爭性地抑制促炎性類花生酸類物質(zhì)的產(chǎn)生，減少前列腺素的產(chǎn)生，降低肝臟的炎癥反應(yīng)程度，從而減輕肝臟的損害。魚油脂肪乳劑適用于ALI患者，可作為危重癥患者的選擇，而其在危重病中的保護作用機制仍需進一步的研究。

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Hepatoprotective effect of fish oil-based lipid emulsion on rats w ith lipopolysaccharide-induced acute lung injury and itsmechanism

HUANG Limi，WANG Kai，LIANG Yaqin，et al.Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325015,China

Fish oil Acute lung injury Liver function Arachidonic acid

intratracheal adm inistration of normal saline,while those in Omegaven and LPS groups were given LPS.All the animals were sacrificed 8h later,b lood sam p les were taken for ALT,AST and PGE2measurementand liver and lung tissues were collected for pathologicalexam inations. Results HE staining showed that the structure ofhepatic lobules and alveoliwas intact,there were no degeneration in hepatic cells,no exudation and inflammatory cellinfiltration in alveoliofb lank g roup,while in Omegaven and LPS groups the liver tissue showed m ild non-specific inflammation and the lung tissue p resented w ith significant inflammation cell infiltration and hemorrhage.Serum ALT and AST levels in LPS g roup were higher than those in b lank g roup(both P＜0.05). Compared w ith LPS g roup and b lank g roup,ALT and AST in Omegaven g roup were not significantly changed(all P＞0.05). Compared w ith b lank and Omegaven g roups,PGE2levels in LPS g roup increased significantly(both P＜0.05),while there was no significant difference in PGE2level between Omegaven group and b lank group (P＞0.05). Conclusion Fish oil-based lip id emulsion(Omegaven)can alleviate liver injury induced by LPS,which may be related to the regulation of arachidonic acid metabolism.

2017-02-13）

（本文編輯：陳麗）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.16.2017-154

溫州市科技局計劃項目（2015Y0047）

325015 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科（黃麗密、王凱、梁雅琴、翁華春、錢燕）；同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院胃腸外科（余震）

錢燕，E-mail:q ian y an11@126.com

【 Abstract】 Objective To investigate the hepatop rotec tive effect and mechanism of fish oil-based lipid emulsion (Omegaven)on rats w ith lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury.Methods Sixty juvenile Sp rague Daw ley rats were divided into b lank g roup,LPS g roup and Omegaven group w ith 20 in each.Normalsaline was injected through caudalvein for 7d in b lank and LPS g roups,while 10%Omegaven was injected in Omegaven g roup.On the 8th day,rats in b lank g roup