禮 穎，秦立鑫

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

羊鏈球菌病滅活疫苗生產(chǎn)工藝研究

禮 穎，秦立鑫

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

目前羊鏈球菌病作為羊場(chǎng)發(fā)病的一種新型病引起廣泛關(guān)注，因此該病疫苗的制備受到生物制品企業(yè)的重視。文章對(duì)羊鏈球菌病滅活疫苗的生產(chǎn)工藝進(jìn)行研究。

羊鏈球菌病；生產(chǎn)工藝；滅活疫苗

羊鏈球菌病是嚴(yán)重危害山羊、綿羊的疫病，是由溶血性鏈球菌引起的一種急性熱性傳染病。此病主要通過(guò)消化道和吸呼道傳染，鏈球菌最易侵害的是綿羊，山羊也很容易感染，多在羊只體況比較弱的冬春季節(jié)呈現(xiàn)地方性流行[1-7]。目前羊鏈球菌病作為羊場(chǎng)發(fā)病的一種新型病引起廣泛關(guān)注，因此該病疫苗的制備受到生物制品企業(yè)的重視，本文對(duì)羊鏈球菌病滅活疫苗的生產(chǎn)工藝進(jìn)行研究。

1 試驗(yàn)材料與動(dòng)物

生產(chǎn)用種子制造和檢驗(yàn)本品用的菌種為羊鏈球菌C55001和C55002菌株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)?！霸?系”或“St.0.6”菌株，分別暫由新疆生物藥品廠和四川生物藥品廠鑒定、保管和供應(yīng)。培養(yǎng)基包括緩沖肉湯瓊脂、緩沖肉湯、40%葡萄糖溶液、酪胨瓊脂斜面（G.A）、硫乙醇酸鹽酪胨湯（T.G）葡萄糖蛋白胨（G.P）。試驗(yàn)動(dòng)物為大耳白家兔、綿羊，由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

2 菌種制備

2.1 基礎(chǔ)種子

羊鏈球菌C55001和C55002菌株凍干菌種用滅菌2～5 mL pH 7.6緩沖肉湯分別進(jìn)行溶解，接種未經(jīng)免疫的綿羊，3～5 d采取發(fā)病而死的綿羊心血，制備基礎(chǔ)菌種，-15℃保存1年。

2.2 生產(chǎn)用種子制備

一級(jí)種子繁殖及鑒定：取低溫保存的2～3株死羊血菌種，分別接種于血液瓊脂大管斜面上，37℃培養(yǎng)16～20 h，取樣接種血液瓊脂斜面和厭氣肉干湯，純粹檢驗(yàn)合格后，作為一級(jí)種子。在2～8℃保存，每周移植1次，使用期≤1個(gè)月。在培養(yǎng)基上繼代，不超過(guò)4代。

二級(jí)種子繁殖：用緩沖肉湯分別洗下各株一級(jí)種子，混合接種于緩沖肉湯中，37℃培養(yǎng)16～20 h，經(jīng)純檢合格后，置2～8℃保存≤4 d。

2.3 制苗用菌液制備

2.3.1 菌液培養(yǎng)

將緩沖肉湯置37℃預(yù)熱24 h后，按培養(yǎng)基量的0.2%加入葡萄糖（制成50%溶液），也可同時(shí)按總量的1%～2%加入血清或血紅素，并按總量的5%接入二級(jí)種子液，37℃培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)期間搖瓶3次。

2.3.2 純粹檢驗(yàn)

從大瓶菌液中取樣，接種于血液瓊脂斜面、馬丁肉湯和厭氣肉干湯，37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行檢查，并經(jīng)鏡檢純粹后方可配苗。

2.3.3 活菌計(jì)數(shù)

用含10%綿羊脫纖血（或血清）瓊脂平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.3.4 滅活

按菌液總量的0.3%加入甲醛溶液，充分振蕩后，置37℃滅活16～24 h，期間搖瓶2～3次。

2.3.5 滅活檢驗(yàn)

將菌液接種于血液瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)48 h，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

2.3.6 無(wú)菌檢驗(yàn)

將待測(cè)樣品接種TG小瓶（50 mL·瓶-1），接種量為1.0 mL·瓶-1，置37℃培養(yǎng)，3 d后吸取培養(yǎng)物，分別接種GA斜面、TG小管各2支和GP小管1支，接種量為0.2 mL·支-1，一支GA斜面和TG小管置37℃培養(yǎng)，一支GA斜面、TG小管和GP小管置25℃培養(yǎng)，均培養(yǎng)5 d，每日觀察結(jié)果并記錄。

2.4 配苗

檢驗(yàn)合格后，按菌液5份加滅菌氫氧化鋁膠1份進(jìn)行配苗。經(jīng)充分振蕩后于冷暗處保存，制備成6個(gè)批次產(chǎn)品。

2.5 安全檢驗(yàn)

用體重1.5～2.0 kg家兔2只，各皮下注射疫苗3.0 mL，觀察10 d。

2.6 效力檢驗(yàn)

用1～3歲健康易感綿羊4只，各皮下注射疫苗5.0 mL，21日后連同條件相同的對(duì)照羊3只，各靜脈注射致死量羊鏈球菌強(qiáng)毒，觀察21～30日，對(duì)照羊全部死亡，免疫羊至少保護(hù)3只；或?qū)φ昭蛩劳?只，免疫羊全保護(hù)為合格。

3 試驗(yàn)結(jié)果

各批次培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)菌數(shù)對(duì)比見(jiàn)表1，滅活檢驗(yàn)情況見(jiàn)表2，無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，安檢情況見(jiàn)表4，效力檢驗(yàn)情況見(jiàn)表5。

表1 各批次培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)菌數(shù)對(duì)比表

表2 滅活檢驗(yàn)情況

通過(guò)表1各批次培養(yǎng)時(shí)間與菌數(shù)情況，可知18～26 h期間菌數(shù)為逐漸遞增，到達(dá)28 h時(shí)，開(kāi)始有大量菌體死亡，進(jìn)入衰亡期。由表2與表3可見(jiàn)，各批次相應(yīng)的滅活檢驗(yàn)及無(wú)菌檢驗(yàn)均達(dá)到要求，為安全檢驗(yàn)與效力檢驗(yàn)做好保障。由表4可知，各批次安全檢驗(yàn)均達(dá)到要求。由表5可知，201501、201502、201505、201506效力均未達(dá)到要求，為不合格，201503與201504效力達(dá)到要求。

表3 無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果

表4 安檢情況

表5 效力檢驗(yàn)情況

4 結(jié) 論

201505批培養(yǎng)時(shí)間為26h，培養(yǎng)菌數(shù)28億個(gè)·mL-1，效力檢測(cè)中未能達(dá)標(biāo)；201503批培養(yǎng)時(shí)間為22h，培養(yǎng)菌數(shù)18億個(gè)·mL-1，但其效力檢測(cè)結(jié)果達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)線；201504批培養(yǎng)時(shí)間為24h，培養(yǎng)菌數(shù)為22億個(gè)·mL-1，其效力檢測(cè)結(jié)果良好。說(shuō)明在培養(yǎng)時(shí)間范圍之內(nèi)，菌數(shù)達(dá)到約20億個(gè)·mL-1免疫效果最好。

[1] 王保仙.羊鏈球菌病的診斷與預(yù)防措施[J].當(dāng)代畜牧,2015（3）:56-57.

[2] 才木德,娜爾力瑪.羊鏈球菌病的診斷[J].畜牧與飼料科學(xué),2001,22（3）:42.

[3] 單細(xì)法,馮利華.羊鏈球菌病的診斷與防治[J].當(dāng)代畜牧,2015（35）:83-84.

[4] 趙萬(wàn)軍,胡鵬,蒲新竹,等.綿羊鏈球菌病的診斷與防治[J].甘肅畜牧獸醫(yī),2015,45（6）:50.

[5] 韓濤,陳世軍,沈辰峰,等.羊鏈球菌病的診治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2015（20）:238-239.

[6] 李軍成,路彩霞,馮國(guó)庭.羊鏈球菌的綜合防治[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2009,45（3）:69-70.

[7] 欒海濤.羊鏈球菌病的診斷與防治措施[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn),2013（5）:101.

Study on the Production Technology of Inactivated Vaccine Against Sheep Streptococcus Disease

LI Ying,QIN Lixin
（Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

At present,the sheep streptococcal disease as a new disease caused widespread concern,so the dis?ease vaccine was prepared by biological products enterprises.This paper researched on the production process of sheep streptococcal disease inactivated vaccine.

sheep streptococcus disease;production process;inactivated vaccine

S826；S852.61+1

A

1001-0084（2017）08-0043-04

2017-06-22

禮穎（1974-），女，遼寧遼中人，獸醫(yī)師，主要從事疫苗生產(chǎn)的研究與應(yīng)用。