宋 震，王卉卉，蘇亞慶，匡少平

(1. 青島科技大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，山東 青島 266042；2. 青島科技大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，山東 青島 266042 )

老化油泥污染土壤中真菌多樣性研究

宋 震1，王卉卉1，蘇亞慶2，匡少平1

(1. 青島科技大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，山東 青島 266042；2. 青島科技大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，山東 青島 266042 )

為了篩選土壤中的石油耐受菌和降解菌，需對石油污染土壤中土著真菌多樣性開展研究。本文以勝利油田老化油泥污染土壤為研究對象，測得土壤含水率在13%～27%之間，含鹽量在0.36%～1.45%之間，pH值在8.11～8.55之間。采用重量法測得土壤中總石油烴含量，采用原子吸收分光光度法測得土壤中Cu、Zn、Cr的含量。采用高通量法測定土壤中真菌的多樣性。對比區(qū)域背景土壤和受老化油泥污染土壤的數(shù)據(jù)可以看出，老化油泥污染可以促進(jìn)區(qū)域背景土壤中優(yōu)勢菌群子囊菌門的生長發(fā)育，但是也抑制了區(qū)域背景土壤中擔(dān)子菌門的生長發(fā)育。并且老化油的污染脅迫導(dǎo)致土壤中真菌多樣性的增加。本研究成果可以為篩選受老化油泥污染土壤中的耐受菌、降解菌和研究生物修復(fù)提供依據(jù)。

老化油泥；真菌；微生物多樣性；生物修復(fù)

石油是目前世界上應(yīng)用最廣泛的能源之一，對整個工業(yè)的發(fā)展有重要意義，被譽為“黑色黃金”。隨著石油工業(yè)的發(fā)展，石油造成的環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重[1]。油泥是伴隨石油開采、儲運等過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，具有產(chǎn)生量大，難以處置及綜合利用的特點，除了少部分被用于回收原油外，每年有大量的油泥只能露天堆放，不但污染環(huán)境，同時占用了大量土地。被老化油泥污染的土壤會帶來一系列的環(huán)境問題，應(yīng)采取一定措施予以修復(fù)。主要修復(fù)方法有：物理修復(fù)，化學(xué)修復(fù)，生物修復(fù)。其中生物修復(fù)是基于微生物降解作用的一種修復(fù)技術(shù)，是修復(fù)老化油泥污染土壤的高效、安全、低成本的技術(shù)，因其費用低、無二次污染、處理效果好等特點受到廣泛關(guān)注[2]。老化油泥污染脅迫對土壤造成的污染，會引起土壤的理化性質(zhì)、重金屬含量、真菌群落結(jié)構(gòu)以及真菌多樣性發(fā)生改變，而這種土壤特性的改變將極大地制約石油烴的生物降解速率并且也會影響被老化油泥污染場地的生物修復(fù)效果，并且，用于修復(fù)土壤中石油污染的微生物制劑對土壤的理化性質(zhì)有一定的要求(溫度、pH值、酸堿性等)[3]。此外，供石油降解微生物生長發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)在工業(yè)場地的使用成本較高[4]。因此，利用土壤中的土著微生物降解土壤中的石油污染物是一個很好的選擇[5]，要想更好的修復(fù)油田開采區(qū)被石油污染的土壤，對老化油泥污染土壤中土著真菌多樣性與理化性質(zhì)的研究是必不可少的前期工作[6]。

1 實驗部分

1.1 原料與儀器

30%過氧化氫，分析純，天津博迪化工有限公司；硫酸，分析純，天津博迪化工有限公司；硫酸汞，分析純，天津博迪化工有限公司；重鉻酸鉀，分析純，天津博迪化工有限公司；葡萄糖，分析純，天津鼎盛鑫化工有限公司；鹽酸，優(yōu)級純，南京化學(xué)試劑有限公司；硝酸，優(yōu)級純，南京化學(xué)試劑有限公司；氫氟酸，優(yōu)級純，南京化學(xué)試劑有限公司；高氯酸，優(yōu)級純，南京化學(xué)試劑有限公司；硝酸鑭，分析純，天津鼎盛鑫化工有限公司；氯化銨，分析純，天津鼎盛鑫化工有限公司；銅標(biāo)準(zhǔn)使用液，G62024-90，國家鋼鐵材料測試中心；鋅標(biāo)準(zhǔn)使用液，G62025-90，國家鋼鐵材料測試中心；鉻標(biāo)準(zhǔn)使用液，G62017-90，國家鋼鐵材料測試中心。

土壤采樣器，KHT-004型，江蘇金壇市康華電子儀器制造廠；原子吸收光譜儀，GFA-7000，島津制作所；微波消解儀，Hanon TANK，上海海能股份有限公司；乙炔減壓器，TOE-213，上海山松儀器儀表有限公司；無油空氣壓縮機，AA-530，上海山松儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計，BV5100B型，上海元析儀器有限公司；分析天平，F(xiàn)A 1004N，上海精密科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，DHG-9030型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；磁力攪拌器，78-1型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；酸度計，PB-10型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩，各種規(guī)格，浙江省上虞市滬江儀器沙篩廠。

1.2 土壤樣品的采集和預(yù)處理

在勝利油田孤三區(qū)301采油站站進(jìn)行土壤樣品的采集，選取三個采樣點分別是孤三區(qū)301站老化油泥下20 cm土壤、孤三區(qū)301站老化油泥下層土壤以及作為區(qū)域背景土壤的孤三區(qū)301站土分別標(biāo)號為No.1502、No.1503、No.1504具體采樣步驟如下：

(1) 供常規(guī)分析的樣品的采集：采用KHT-004垂直土壤采樣器進(jìn)行樣品的采集，去除土壤樣品中的植物碎屑，每次采樣量在1 kg左右。采集的樣品放入干凈的塑料自封袋中，附上標(biāo)簽對樣品進(jìn)行編號并在標(biāo)簽上標(biāo)注采樣的時間、地點、周圍的地理環(huán)境等。

(2) 供真菌多樣性分析的樣品的采集：從上述采集到的供常規(guī)分析的土壤樣品中，用滅菌鐵勺分別取50 g左右作為研究真菌多樣性的土壤樣品，為了避免微生物的交叉感染，每取一個樣品即換用一個新的滅菌鐵勺，土壤樣品保存在無菌凍存管內(nèi)，附上標(biāo)簽進(jìn)行編號，并在標(biāo)簽上注明采樣的地點、時間、周圍的環(huán)境等，然后即刻放入干冰或者液氮中在-80℃超低溫環(huán)境下保存。

常規(guī)分析土壤樣品的預(yù)處理：將采集的土壤樣品放在干凈的搪瓷盤中自然風(fēng)干，然后用研缽研碎分別通過孔徑不同的樣品篩。

真菌多樣性分析土壤樣品的預(yù)處理：將凍存管中的土壤樣品保存在-80℃的超低溫度下。

1.3 土壤樣品的基本成分測定

1.3.1 土壤樣品中總石油烴(TPHs)含量及基本理化性質(zhì)的測定

土壤樣品中TPHs的測定采用重量法。首先以正己烷作為提取劑對土壤進(jìn)行超聲提取，探究不同的固液比、溫度和提取時間，探究最佳提取方式。對土壤樣品重復(fù)提取3次，將提取液合并。將提取液轉(zhuǎn)移至烘干至恒重的雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至提取液蒸干，雞心瓶前后的質(zhì)量差異即為土壤中的TPHs含量。土壤pH值采用電位法，土壤含鹽量采用氧化法，土壤含水率采用重量法。

1.3.2 土壤中重金屬含量的測定

采用微波消解法(硝酸-氫氟酸-過氧化氫體系)對土壤樣品進(jìn)行處理，重金屬元素用火焰原子吸收分光光度法進(jìn)行測定。

1.4 土壤樣品中真菌多樣性分析

土壤真菌多樣性的測定采用 Illumina PE250測序方法。主要流程有以下幾個步驟，具體如圖1所示。

圖1 微生物測序流程圖

Fig.1 The flow chart of microbial sequencing

(1)基因組DNA的提取

采用D5265-OME GA-soil DNA kit試劑盒進(jìn)行土壤微生物宏基因組DNA的提取。完成基因組DNA抽提后，利用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

(2) PCR擴增

按指定測序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。

(3) 熒光定量

參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測定量，之后的每一個樣本都按照各自的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤基本理化性質(zhì)分析

土壤基本理化性質(zhì)、TPHs以及重金屬含量如表1所示。

表1 土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù)表

從表1中的數(shù)據(jù)分析得出，老化油泥的污染對土壤的理化性質(zhì)有一定程度的影響，和區(qū)域背景土壤樣品相比，受到老化油泥污染脅迫的土壤樣品pH值升高，微生物在降解石油烴的過程中會產(chǎn)生羧酸類物質(zhì)，導(dǎo)致土壤pH值在短期內(nèi)降低[7]，土壤樣品No.1502、No.1503的pH值高于作為背景的土壤樣品No.1504，可能原因是隨著時間的推移，老化油泥中的石油組分逐漸被微生物降解，通過雨水的稀釋、與空氣中堿性物質(zhì)的中和作用。油泥的含水率較高(可達(dá)96 %)[8]，導(dǎo)致受到污染的土壤中的含水率升高。老化油泥下20cm土壤中TPHs含量升高明顯高于區(qū)域背景土壤和老化油泥下層土壤，說明老化油泥下20cm土壤中的石油污染最嚴(yán)重。被老化油泥污染的土壤樣品中的重金屬含量明顯較區(qū)域背景土壤樣品更高，這是因為石油本身和石油開采過程中使用的鉆井液中含有重金屬，當(dāng)石油滲透到土壤中時也使得土壤中重金屬的含量增多，造成土壤重金屬污染。

2.2 土壤真菌多樣性結(jié)果分析

2.2.1 OTU分析

OTU(Operational Taxonomic Units)是為了方便系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和群里遺傳學(xué)的研究，而人為給某一個分類單元設(shè)置的同一標(biāo)志[9]。要了解一個樣本的測序結(jié)果中的相關(guān)信息首先要對序列進(jìn)行分類將序列按照彼此之間的相似性分為許多的小組，一個小組就是一個OTU，本次測序是在相似度水平為97 %的條件下進(jìn)行生物信息統(tǒng)計分析。

2.2.2 多樣性指數(shù)分析

群落生態(tài)學(xué)中研究微生物多樣性，通過單樣本的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的物種豐度和多樣性。本論文測得指數(shù)有Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Coverage指數(shù)，分析結(jié)果如表2所示。

表2 所有樣本分析結(jié)果列表

No.1502為孤三區(qū)301站老化油泥下20cm土，No.1503為孤三區(qū)301站老化油泥下層土，No.1504為孤三區(qū)301站表層土壤，附近沒有油泥的散落，因此認(rèn)為No.1503可以與老化油泥直接接觸，因此受老化油泥的污染十分嚴(yán)重，No.1502受老化油泥的污染程度較輕，而No.1504因為距離老化油泥污染場地很遠(yuǎn)，可以看做是沒有受老化油泥污染的背景土壤。

由表3中的數(shù)據(jù)可以得出，土壤樣品No.1503、No.1502、No.1504的Chao指數(shù)和Ace指數(shù)依次降低，這可以表明當(dāng)土壤受老化油泥污染時，會使其所包含的OTU數(shù)即真菌菌群豐度減少。由Shannon和Simpson指數(shù)可以看出，輕微的老化油泥污染導(dǎo)致土壤中真菌多樣性增大，而嚴(yán)重的老化油泥污染引起土壤中真菌多樣性降低。三個土壤樣品的Coverage指數(shù)接近1可以看出樣本文庫的覆蓋率很高證明本次測序結(jié)果代表了土壤樣品中真菌的真實情況。

2.2.3 土壤樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)DNA測序所確定的真菌門類具體數(shù)據(jù)見表3，相對應(yīng)的多樣本柱狀圖見圖2。

表3 土壤樣本DNA測序結(jié)果(門) %

圖2 多樣本柱狀圖(真菌門類)

Fig.2 Microbial community bar-plot (phylum of fungi)

由圖2可以看出三個土壤樣品中的優(yōu)勢菌門同是子囊菌門(Ascomycota)，相對豐度排在第二位的是擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。和區(qū)域背景土壤樣品相比，這兩個菌門在老化油泥污染土壤樣品中的相對豐度有了顯著變化，參照表3進(jìn)行具體分析。受老化油泥污染的兩個土壤樣品中子囊菌門(Ascomycota)的含量增多，擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的含量減少。由此可得老化油泥的污染對真菌群落結(jié)構(gòu)的組成成分有一定的影響，而且老化油泥的污染對子囊菌門(Ascomycota)的生長發(fā)育有較明顯的促進(jìn)作用， 對擔(dān)子菌門(Basidiomycota)生長發(fā)育有一定程度的抑制作用。纖維素、木質(zhì)素等有機物是形成石油母質(zhì)的原材料之一，在子囊菌門(Ascomycota)中，許多屬種可以通過胞外酶以纖維素為碳源代謝[10]，它們首先大分子將纖維素分解成小分子纖維素，然后再將小分子纖維素轉(zhuǎn)化為作為其自身代謝碳源的葡萄糖，這可能是子囊菌門(Ascomycota)成為老化油泥污染土壤中優(yōu)勢菌門的原因[11]。因此，子囊菌門(Ascomycota)中可能含有老化油泥污染土壤修復(fù)的潛在屬種，此外，土壤受到老化油泥污染后相對豐度增加的菌門，有可能是老化油泥的耐受菌或降解菌。

3 結(jié)論

(1) 老化油泥的污染會對土壤理化性質(zhì)造成影響，同時也會影響土壤中重金屬的含量。

(2) 老化油泥污染可以促進(jìn)子囊菌門(Ascomycota)生長發(fā)育，可以抑制擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的生長發(fā)育，子囊菌門(Ascomycota)很有可能就在本研究區(qū)域內(nèi)老化油泥污染土壤生物修復(fù)中起重要作用的菌門。由多樣性指數(shù)可得，老化油泥的污染導(dǎo)致土壤中真菌多樣性增加。

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(本文文獻(xiàn)格式：宋 震，王卉卉，蘇亞慶.老化油泥污染土壤中真菌多樣性研究[J].山東化工，2017，46(10)：195-198.)

Research on Fungal Diversity of Aging Oil Sludge Contaminated Soil

SongZhen1，WangHuihui1，SuYaqing2，KuangShaoping1

(1. College of Environment and Safety Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042，China;2. College of Chemistry and Molecular Engineering, Qingdao 266042，China)

In order to screen oil resistant fungi and bioremediation, it is necessary to investigate the biodiversity of indigenous fungi in soil. In this experiment, the research object is the soil polluted by the aging oil sludge of Shengli oil field. Water content (13%～27%), salt content (0.36%～1.45%), pH (8.11～8.55), were investigated. We also use gravimetric method to measure TPHs content and flame atomic absorption spectrophotometer to detect the content of heavy metal copper, zinc and chromium. Then High Throughput sequencing analysis was used to investigate the fungal diversity, compare the data of background soil with oil sluge contaminated soil. It was found that aging oil sludge can promote the growth and development of Ascomycota, while it can inhibited the growth and development of Basidiomycota. In all, the pollution of the aging oil sludge can promote the development of fungal diversity in soil. The findings of this study can provide basis for the screening of oil resistant fungi and bioremediation.

aging oil sludge; fungi; microbial diversity; bioremediation

2017-03-30

(Foundation item):國家自然科學(xué)基金資助項目(41673112)

宋 震(1990—)，山東青島人，在讀碩士研究生，目前在青島科技大學(xué)就讀，主要從事微生物多樣性研究。

X53

A

1008-021X(2017)10-0195-04