沈 珉1,2,3 柳 林4 劉 陽5 盧洪文4 逄力男4 褚 迅1,3

1.上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院（上海 200092）；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（上海 200438）；3.上海人類基因組研究中心（上海 201203）；4.濰坊市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（山東濰坊 261041）；5.開灤總醫(yī)院內(nèi)分泌科（河北唐山 063000）

GNAS基因新生突變致假性甲狀旁腺功能減退癥Ia型1例

沈 珉1,2,3 柳 林4 劉 陽5 盧洪文4 逄力男4 褚 迅1,3

1.上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院（上海 200092）；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（上海 200438）；3.上海人類基因組研究中心（上海 201203）；4.濰坊市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（山東濰坊 261041）；5.開灤總醫(yī)院內(nèi)分泌科（河北唐山 063000）

目的鑒定導(dǎo)致假性甲狀旁腺功能減退癥（PHP）Ia型發(fā)病的GNAS基因突變。方法回顧分析1例PHP-Ia型患兒的臨床資料。利用Sanger測序方法對患兒及其父母GNAS基因的13外顯子進(jìn)行檢測。疑似致病突變在478例健康對照者中進(jìn)行篩查，排除非致病性變異。利用深度測序方法對患兒及其父母外周靜脈血的DNA進(jìn)行測序，分析確定致病突變的起源。結(jié)果女性患兒，實驗室檢查結(jié)果示低血鈣、高血磷及高甲狀旁腺素（PTH）；體格檢查有Albright遺傳性骨營養(yǎng)不良（AHO）畸形。臨床表現(xiàn)符合PHP-Ia型特征。GNAS基因突變篩查發(fā)現(xiàn)1個尚未見報道的，位于6號外顯子的錯義突變（c.479G＞C，p. R160P）。父母及健康對照均者未發(fā)現(xiàn)該突變。針對突變所在的GNAS基因6號外顯子在患兒及其父母外周靜脈血的DNA中進(jìn)行深度測序，每個樣本均獲得8 000條左右的序列。患兒父母的所有序列中均篩查到該突變。患兒序列中，3 984條攜帶G等位基因，4 019條攜帶C等位基因，兩者的數(shù)目大致相同。深度測序的結(jié)果提示，該突變是來源于母系生殖細(xì)胞的新發(fā)突變。結(jié)論 發(fā)現(xiàn)一個導(dǎo)致PHP-Ia型發(fā)生的GNAS基因新突變（c.479G＞C，p.R160P），推測該突變起源于母親生殖細(xì)胞。

假性甲狀旁腺功能減退癥Ia型； GNAS基因； 新生突變

假性甲狀旁腺功能減退癥（pseudohypoparathyroidism，PHP）是一種終末器官（主要為腎近端小管和骨細(xì)胞）對甲狀旁腺素（PTH）發(fā)生抵抗而致的一系列綜合征[1]。其臨床表現(xiàn)為低血鈣、高血磷、血清PTH代償性增加[2]。PHP通常分為PHP-I型和PHP-II型。I型進(jìn)一步分為PHP-Ia、PHP-Ib、PHP-Ic三種亞型。其中Ia型患者有Albright遺傳性骨營養(yǎng)不良（AHO）特殊體征，表現(xiàn)為身材矮小、短指、異位骨化、智力發(fā)育遲緩等。除對PTH抵抗外，還對甲狀腺素（TSH）、促性腺素和生長素釋放激素（GHRH）等多種激素抵抗。

PHP-Ia是由GNAS基因突變導(dǎo)致。GNAS基因位于染色體20q13.32，由13個外顯子組成。是一個復(fù)雜的印跡表達(dá)基因，編碼多種基因產(chǎn)物。刺激性G蛋白α亞基（GSα）是其編碼的最主要產(chǎn)物。除此之外，通過不同的啟動子和可變剪切方式，還編碼多種轉(zhuǎn)錄本和蛋白。如父源表達(dá)的Xlas蛋白、A/B轉(zhuǎn)錄本、AS轉(zhuǎn)錄本，母源表達(dá)的NESP55蛋白等[3]。

GSα蛋白是一個廣泛存在的異源三聚體蛋白，參與PTH與靶細(xì)胞受體結(jié)合并生成腺苷酸環(huán)化酶（AC）的過程，AC繼而促成cAMP生成，進(jìn)一步激活蛋白激酶A（PKA），引起細(xì)胞內(nèi)一系列分子的級聯(lián)反應(yīng)，從而使PTH的生理效應(yīng)得以表達(dá)[4]。PHP-Ia型由母源GNAS基因突變引起GSα功能性失活導(dǎo)致。而攜帶父源的GNAS基因突變的患者僅表現(xiàn)為AHO體征，不具備PTH等激素抵抗，通常稱為假假性甲狀旁腺功能減退（PPHP）。

濰坊市人民醫(yī)院于2003年收治了1例PHP-Ia型患者[5]，診斷為假性甲狀旁腺功能減退癥合并原發(fā)性甲狀腺功能減退，并隨訪治療至今。本研究對該患兒及其父母的GNAS基因進(jìn)行外顯子測序，鑒定導(dǎo)致該患兒發(fā)病的GNAS基因突變，并收集詳細(xì)的病史及實驗室檢查信息，分析基因突變的起源。

1 臨床資料

患兒，女，漢族，2001年出生。2002年于北京協(xié)和醫(yī)院診斷為PHP，血鈣濃度7.6mg/dL，血磷8.25mg/ dL，PTH 736pg/mL。2003年12月轉(zhuǎn)至濰坊市人民醫(yī)院繼續(xù)跟蹤治療。2003年甲狀腺功能檢查結(jié)果：FT3 1.37pmol/L，F(xiàn)T4 7.6pmol/L；TSH 3.502 mIU/L，甲狀腺過氧化物酶抗體陰性，甲狀腺球蛋白抗體陰性（患兒至檢查前日一直服用左甲狀腺素片）。2012年（11周歲）體格檢查結(jié)果：身高120 cm，體質(zhì)量37 kg，圓臉、短頸、盾狀胸、指短畸形（雙手十指明顯短于同齡兒）、下肢呈“X”形、步履蹣跚，雙側(cè)Trousseau征陽性，胸廓、脊柱、心肺腹未見明顯異常。實驗室檢查：血鈣1.70mmol/L，血磷2.85mmol/L，PTH 486pg/mL。治療期間應(yīng)用優(yōu)甲樂（50μg，qd），骨化三醇（0.25μg，bid），鈣爾奇D（0.6g，qd）。未出現(xiàn)癲癇樣發(fā)作。

2013年甲狀腺功能檢查結(jié)果：FT3 5.26pmol/L，F(xiàn)T4 21.63pmol/L，TSH 1.621 mIU/L，甲狀腺過氧化物酶抗體陰性，甲狀腺球蛋白抗體陰性（一直服用左甲狀腺素片）。性激素檢查結(jié)果：卵泡刺激素（FSH）15.6mIU/mL，黃體生成素（LH）7.1mIU/mL，雌二醇（E2）88.1pg/mL，睪酮（T）0.13ng/mL，泌乳素（PRL）71.65mIU/L。頸部CT顯示雙側(cè)甲狀腺發(fā)育不良，左側(cè)甲狀旁腺未顯像，右側(cè)甲狀旁腺大致正常；頭顱CT檢查未見明顯異常；腰椎骨密度檢查骨量正常；子宮雙附件彩超示幼稚子宮。體格檢查示，第二性征無發(fā)育?；純褐橇εc同齡兒童無明顯區(qū)別，至今未出現(xiàn)月經(jīng)初潮。

患兒父母非近親結(jié)婚，雙方家系現(xiàn)存三代19人，除患兒外家族中未有其他成員患病。2013年，經(jīng)濰坊市人民醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，在知情同意原則下，采集患兒及父母親、祖母、外祖母的外周靜脈血。同時收集478例無血緣關(guān)系的健康人血樣用作正常對照。

所有血樣均使用EDTA抗凝處理。取1 mL靜脈血使用FlexGene DNA ki（t德國Qiagen）提取外周血DNA，使用Nanodrop（美國ThermoFisher）定量并稀釋至10 ng/μL。對GNAS基因1～13號外顯子設(shè)計引物（表1），由上海生工合成。PCR擴增采用HotStar plus PCR KIT（德國Qiagen），擴增體系為：基因組DNA10ng，Mg2+1.5 mmol，dNTP0.3 mmol，引物0.4μmol，酶0.25 U，反應(yīng)緩沖液1μL，無菌水補足至10μL。擴增條件為95℃預(yù)變性5min，95℃變性40s，63℃～57℃復(fù)性40s（復(fù)性溫度由63℃開始，前12個循環(huán)每循環(huán)下降0.5℃，第13～42個循環(huán)保持57℃），72℃延伸1min，共42個循環(huán)，72℃終延伸5min，4℃待機。取2μL PCR產(chǎn)物純化，用3730XL測序儀（美國ABI）完成測序。測序數(shù)據(jù)使用Seqman軟件讀取。

對先證者及其父母的測序結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)先證者的6號外顯子存在一錯義突變（c.479G＞C，p.R160P），該突變在其父母的染色體上不存在（圖1）。針對這個突變在478例健康對照者中，進(jìn)行Sanger測序檢測，未發(fā)現(xiàn)攜帶者。c.479G＞C（p. R160P）導(dǎo)致GSα蛋白第160位精氨酸變化為脯氨酸，可能致使GSα蛋白活性缺失，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

患兒具有PHP-Ia型的典型特征，因此攜帶的突變應(yīng)該是母源的。突變產(chǎn)生可能有三個原因：其一，母親部分體細(xì)胞攜帶有突變，產(chǎn)生攜帶有突變的卵子；其二，卵子在形成過程中產(chǎn)生突變。以上兩種情況患兒為雜合突變攜帶者。其三，受精卵形成后胚胎細(xì)胞發(fā)生突變，導(dǎo)致患者部分體細(xì)胞攜帶突變的等位基因。因為Sanger測序無法判斷患者體內(nèi)突變等位基因的比例，因此，進(jìn)一步用二代測序的技術(shù)針對該突變對患兒與其母親的血液DNA進(jìn)行深度測序。

表1 GNAS基因外顯子擴增引物

圖1 患兒及父母GNAS基因測序結(jié)果

針對c.479G＞C(p. R160P)突變位點所在序列，設(shè)計PCR引物（F：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTG TATAAGAGACAGcagggtttgaatgacagtgttg3’；R：5’-GT CTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGtat gtgctgatgggttgggt-3’），引物包括通用序列和片段特異性序列，由上海生工合成。PCR反應(yīng)采用KAPA公司的Robust Hotstart Ready Mix PCR Kit，使用兩輪PCR反應(yīng)的方法對目的片段進(jìn)行擴增。PCR產(chǎn)物再次使用AMPure XP 試劑盒純化。純化后的擴增子使用MiSeq進(jìn)行測序，按標(biāo)準(zhǔn)流程操作。

每個樣本測得約8 000條序列?；純焊改阜謩e測到8 005、7 998條序列，均未見第479位堿基C突變?；純汗矞y到8 003條序列，其中3984條攜帶G等位基因，4 019條攜帶C等位基因?；純喝旧w中堿基G和C所占比例大體相同（等位基因G：49.8%；等位基因C：50.2%）。由此可以推斷，患兒該堿基為新生突變，產(chǎn)生于母體的卵子?；純旱哪赣H不是突變嵌合體。

2 討論

PHP由Albright于1942年首次描述[6]。在日本人群中平均每百萬人發(fā)病數(shù)為3.64例[7]。此病的臨床表現(xiàn)為PTH生理效應(yīng)通路阻斷所致的低血鈣、高血磷、手足搐搦等癥狀，常伴有多發(fā)性內(nèi)分泌缺陷和先天性骨骼發(fā)育異常。癥狀類似甲狀旁腺功能減退，但血清PTH正常甚至代償性升高[1,2]。PHP最常見的是Ia型，患者除了PTH和TSH抵抗外，還具有多種激素抵抗以及AHO體征。PHP-Ib型則只具有PTH和TSH抵抗，無其他激素抵抗，不具備AHO體征。Ic型與Ia型類似，但體外檢測紅細(xì)胞GSα蛋白活性正常。II型則與Ib型類似，無多激素抵抗，無AHO體型，但施以外源性PTH后，其尿cAMP排出正常，cAMP生成無障礙[3]。

PHP-Ia型由GSα蛋白活性改變所致。GSα是一個廣泛存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，通過生成cAMP來調(diào)節(jié)眾多激素及內(nèi)源性分子的活性。GSα蛋白由GNAS基因編碼，GNAS基因有多個轉(zhuǎn)錄本，各轉(zhuǎn)錄本在大多數(shù)組織中為雙等位基因表達(dá)。但是在特定的某些組織里，父系來源的等位基因的表達(dá)被抑制，這些組織包括近端腎小管、甲狀腺、生殖腺、腦垂體[8]。由于在這些組織中母源性GNAS基因表達(dá)占主導(dǎo)地位，因此來源于母親的基因突變才會導(dǎo)致PTH和其他激素抵抗的突變。而源自父親的失活性突變通常不造成嚴(yán)重的PTH和其他激素抵抗，但是會導(dǎo)致AHO的單獨發(fā)生，例如假假性甲狀旁腺功能減退癥（PPHP）[9]。AHO體征的發(fā)生被認(rèn)為是由編碼GSα蛋白基因的單體型不足造成[10]。

據(jù)統(tǒng)計，目前發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致PHP-Ia/PPHP發(fā)生的突變遍布GNAS基因所有13個外顯子[10]。類型包括單堿基突變、微小缺失及插入等各種可能改變mRNA穩(wěn)定性和GSα活性的突變。但目前并沒有證據(jù)顯示，GNAS基因突變的種類和位置與PHP-Ia各種表型之間有明確的對應(yīng)關(guān)系[10]。在PHP-Ia型患者中，GNAS基因存在一些熱點突變。其中7號外顯子存在一個4堿基的缺失（c.565-568delGACT）導(dǎo)致GNAS基因發(fā)生移碼突變，攜帶該突變的患者在所有的患者中占17.4%[10]。而3號外顯子區(qū)域鮮有致病突變發(fā)生，至今只有1例報道，且此突變導(dǎo)致患者GSα細(xì)胞活性下降70%，而其他突變通常會導(dǎo)致50%的下降[11]。

本例患兒呈現(xiàn)低血鈣、高血磷、血清PTH升高，同時伴有典型AHO體征，是典型的PHP-Ia型臨床表現(xiàn)。患兒母親是健康個體，沒有PHP相關(guān)癥狀，并且相關(guān)臨床指標(biāo)也正常。患兒經(jīng)鑒定其GNAS基因6號外顯子攜帶雜合子突變c.479G＞C(p. R160P)，該突變導(dǎo)致GSα蛋白第160位精氨酸變化為脯氨酸。Aldred等[12]曾于2001年報道了一例AHO體征者攜帶家族性錯義突變c.478C＞T（p.R160C），導(dǎo)致GSα蛋白第160位精氨酸變化為半胱氨酸，與本研究所鑒定的突變位于同一密碼子，影響了同一個位置的氨基酸。由此推測，本研究發(fā)現(xiàn)的突變比先前報道的突變對GSα蛋白活性影響更為嚴(yán)重，可能致使GSα蛋白活性缺失，從而降低了PTH的生理效應(yīng)，導(dǎo)致了患者疾病的發(fā)生。

根據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)，該突變?yōu)槟冈葱浴Ｍㄟ^深度測序，在母體血液DNA中沒有發(fā)現(xiàn)GNAS基因第479位堿基的C等位基因，基本可以排除突變是來自于母體的體細(xì)胞突變?；純喝旧w中等位基因G和C所占比例大體相同，可以推斷患兒的突變來自于卵子的基因突變?；純耗赣H體細(xì)胞中不存在這種突變，那么再次生育PHP-Ia后代的風(fēng)險較低。

綜上所述，本研究鑒定了一個導(dǎo)致PHP-Ia型發(fā)生的GNAS基因外顯子新突變，該突變導(dǎo)致GSα蛋白第160位精氨酸變化為脯氨酸（c.479G＞C，p. R160P）。通過深度測序推斷該突變起源于母親生殖細(xì)胞。

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A de novo mutation in GNAS cause severe pseudohypoparathyroidism type Ⅰa

SHEN Min1,2,3, LIU Lin4, LIU Yang5, LU Hongwen4, PANG Linan4, CHU Xun1,3(1.Shanghai Institute of Pediatric Research, Shanghai 200092, China; 2.School of Life Science Fudan University, Shanghai 200438, China; 3.Chinese National Human Genome Center at Shanghai, Shanghai 201203, China; 4.Department of Endocrinology, Weifang People's Hospital, Weifang 261041, Shandong, China; 5.Department of Endocrinology, Kailuan General Hospital, Tangshan 063000, Hebei, China)

ObjectiveTo identify the GNAS gene mutation resulting in pseudohypoparathyroidism type Ia (PHP-Ia) in one patient.MethodsThe clinical data of a patient with pseudohypoparathyroidism type Ia was retrospectively analyzed. All the 13 exons of GNAS were sequenced using Sanger method for the patient and the parents. The distribution of suspected causal mutation was screened in 478 healthy controls. To clarify the origin of the mutation, we performed targeted high-depth sequencing of GNAS exon harboring the mutation for the patient and the parents.ResultsThe clinical data of the patient with the laboratory results of hypocalcaemia, hyperphosphataemia, elevated serum PTH, together with the features of AHO, conformed to the characterization of PHP-Ia. The sequencing of GNAS exons identified a missense mutation (c.479G＞C, p.R160P) located at exon 6 in the patient, which was absent in DNA of the parents. The mutation was not reported previously and was not found in the 478 healthy controls. We obtained about 8000-fold coverage from high-depth sequencing of DNA from peripheral blood of the patient and the parents. The disease-associated allele C identifed in the patient was not observed in the parents. The number of reads with G allele (3984 reads) was roughly equal to that of C allele (4019 reads) from the targeted reanalysis of DNA of the patient. The results from high-depth sequencing indicated a de novo mutation in maternal germ cells.ConclusionsWe identifed a new GNAS gene mutation (c.479G＞C, p.R160P) caused PHP-Ia in a patient. Our results suggested the mutation was a maternal germline de novo mutation.

pseudohypoparathyroidism type Ia; GNAS gene; de novo mutation

2017-02-07）

（本文編輯：梁 華）

國家自然科學(xué)基金項目（No. 31471190；No. 31671317）

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10.3969/j.issn.1000-3606.2017.08.010