馬秀偉 趙家艷 朱麗娜 封志純

陸軍總醫(yī)院附屬八一兒童醫(yī)院（北京 100700）

第二代測序技術(shù)診斷球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良1例報告

馬秀偉 趙家艷 朱麗娜 封志純

陸軍總醫(yī)院附屬八一兒童醫(yī)院（北京 100700）

目的探討球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（Krabbe?。┑呐R床、影像學(xué)和GALC基因突變特征。方法回顧分析1例經(jīng)基因檢測確診的Krabbe病患兒的臨床和影像學(xué)資料，并應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲和第二代測序技術(shù)檢測相關(guān)基因，采用Sanger測序驗證突變位點，并對其父母樣本進行突變位點的序列分析。結(jié)果患兒男，3歲5個月，為晚發(fā)嬰兒型，主要臨床表現(xiàn)為精神運動發(fā)育倒退、抽搐。頭顱MRI顯示雙側(cè)腦室后角旁白質(zhì)、胼胝體壓部、內(nèi)囊后肢對稱性長T1長T2信號。二代測序結(jié)果顯示患兒GALC基因第15外顯子1個雜合突變c.1832T＞C和第9外顯子1個雜合突變c.979T＞G，分別引起氨基酸變化p.L611S和p.F327V，為復(fù)合雜合突變。Sanger測序結(jié)果顯示2個突變分別來源于母親和父親，c.1832T＞C已有報道，c.979T＞G為首次報道。結(jié)論通過二代測序技術(shù)可以準(zhǔn)確檢測出Krabbe病的GALC基因突變，可協(xié)助臨床診斷與鑒別。

球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良； Krabbe??； 影像學(xué)； GALC基因； 突變

球形細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（globoid cell leukodystrophy，GLD）又稱 Krabbe 病，是一種罕見的常染色體隱性遺傳的溶酶體貯積病，是由于β-半乳糖腦苷酯酶（galactocerebrosidase, GALC）基因缺陷導(dǎo)致溶酶體內(nèi)GALC缺乏，引起神經(jīng)系統(tǒng)半乳糖腦苷脂沉積，繼發(fā)產(chǎn)生鞘氨醇半乳糖苷毒性作用，造成中樞和周圍神經(jīng)廣泛的髓鞘脫失、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及大量多核巨噬細(xì)胞（球形細(xì)胞）浸潤，引起一系列的臨床表現(xiàn)[1]。Krabbe病在歐美國家的發(fā)病率約1/100 000[1]，我國多為個例報道，缺乏相關(guān)流行病學(xué)資料[2-4]。Krabbe病臨床表現(xiàn)和影像學(xué)上有一定特征，但有時仍難以與其他遺傳性腦白質(zhì)病鑒別[3]，需要酶學(xué)、基因?qū)W檢測確診。第二代測序技術(shù)具有高通量、高性價比的特點，更適于遺傳性腦白質(zhì)病的診斷與鑒別?，F(xiàn)報告1例八一兒童醫(yī)院經(jīng)二代測序確診的Krabbe病患兒的臨床表現(xiàn)、頭顱磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）及GALC基因突變分析結(jié)果。

1 臨床資料

患兒，男，3歲5個月。因“精神運動發(fā)育倒退伴間斷抽搐半年”就診?；純浩鸩‰[匿，進展性病程，開始行走緩慢、走路不穩(wěn)、易摔跤，進展至不能獨走、獨站，持物手抖。視力和聽力下降，語言少，語速慢，執(zhí)行指令、理解及表達(dá)力均變差。抽搐4次，表現(xiàn)為意識喪失，雙眼上翻，四肢強直抖動，每次持續(xù)約2分鐘。出生史、家族史無特殊。查體：四肢肌力Ⅳ級，肌張力高，腱反射對稱活躍，雙側(cè)Babinski征陽性。血尿糞常規(guī)、血生化、同型半胱氨酸、血氨、乳酸、血氨基酸脂酰肉堿譜及尿有機酸分析、皮質(zhì)醇、甲狀腺功能未見異常。腦脊液常規(guī)、生化未見異常。腹部、腎上腺、心臟超聲均未見異常。頭顱MRI顯示雙側(cè)腦室后角旁白質(zhì)、內(nèi)囊后肢、胼胝體壓部對稱性彌漫長T1、長T2信號（圖1）。視頻腦電圖示：背景節(jié)律慢化，醒-睡各期雙側(cè)頂、枕、中后顳區(qū)可見稍多2～4 Hz中、高波幅慢波活動。視覺誘發(fā)電位示雙側(cè)P100潛伏期延長，波形分化欠佳。聽覺誘發(fā)電位示雙耳聽通路外周段及腦干段傳導(dǎo)延遲。初步診斷為遺傳性腦白質(zhì)?。↘rabbe病？腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良？），癲癇。

圖1 患兒頭顱MRI表現(xiàn)

經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，征得患兒監(jiān)護人知情同意后，抽取患兒及其父母外周血，應(yīng)用北京Tiangen公司的TIANamp Blood血液基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA。采用第二代高通量測序方法，取3 μg DNA經(jīng)美國Covaris公司Covaris S2超聲儀將其隨機打斷，純化后的DNA使用末端修復(fù)反應(yīng)緩沖液和末端修復(fù)酶混合物進行末端補平，在其3’端加入A形成特有的懸垂結(jié)構(gòu)，通過接頭連接形成標(biāo)準(zhǔn)的Solexa測序文庫，取1 μL制備好的文庫樣本，用Nanodrop 2000對文庫樣本進行定量。文庫經(jīng)PCR擴增后，取3 μg DNA，應(yīng)用北京邁基諾基因科技研發(fā)的腦白質(zhì)病相關(guān)基因檢測試劑盒進行雜交，洗脫的雜交文庫質(zhì)控合格后經(jīng)Illumina HiSeq 2000上機測序。按照本實驗常規(guī)的Sanger法對點突變患兒樣本進行測序驗證，并對其父母樣本進行該位點的序列分析。外顯子序列由http://www.ncbi.nlm.nih.gov獲得，根據(jù)軟件Primer3.0設(shè)計引物。發(fā)現(xiàn)的新突變在人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）及千人基因組數(shù)據(jù)庫（1000Genomes）查看是否已有報道，并在100名正常人中進一步驗證。

第二代高通量測序結(jié)果顯示，患兒在chr 14-88406259的位置GALC基因（NM＿001201401）第15外顯子上發(fā)現(xiàn)1個雜合突變位點c.1832T＞C，引起該基因第611位氨基酸由亮氨酸變?yōu)榻z氨酸（p.L611S）（圖2）。chr14-88429841的位置GALC基因（NM＿001201401）第9外顯子上發(fā)現(xiàn)1個雜合突變位點c.979T＞G，引起該基因327位氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)槔i氨酸（p.F327V）（圖3）。Sanger測序結(jié)果與二代高通量測序結(jié)果一致，患兒Krabbe病診斷明確。對患兒父母該位點進行序列分析，結(jié)果顯示兩個突變分別來源于母親和父親（圖4，圖5）。c.1832T＞C突變已有報道[1]，c.979T＞G突變在100例正常人未檢出該突變，為首次報道。

圖2 患兒GALC基因外顯子15 c.1832T＞C突變位點第二代測序分析

圖3 患兒GALC基因外顯子9 c.979T＞C突變位點第二代測序分析

2 討論

圖4 外顯子15 c.1832T＞C突變點Sanger測序

圖5 外顯子9 c.1832T＞G突變點Sanger測序

Krabbe病根據(jù)發(fā)病年齡的不同可分為4型：嬰兒型（＜6個月發(fā)?。?、晚發(fā)嬰兒型（6個月～3歲發(fā)病）、青少年型（～8歲發(fā)病）及成年型（＞8歲發(fā)?。5]。其中嬰兒型約占85%～95%，臨床表現(xiàn)為易激惹、哭鬧不安、肌張力增高、快速進展的精神運動倒退，常在2～3歲內(nèi)因感染、球麻痹死亡[5，6]。晚發(fā)嬰兒型和青少年型約占總發(fā)病率的10%，主要表現(xiàn)為進行性偏癱或者四肢癱、視力障礙等，病情進展相對慢，后出現(xiàn)癲癇發(fā)作、癡呆，多于診斷后2～7年內(nèi)死亡，但具有明顯的臨床表型異質(zhì)性[5,7]。成人型發(fā)病率最低，以緩慢進展的錐體束損害為主要表現(xiàn)，呈現(xiàn)慢性進展的無力和活動困難[8-10]。本例患兒就診時3歲5個月，約2歲多出現(xiàn)癥狀，主要表現(xiàn)為精神運動發(fā)育倒退和抽搐，伴隨視聽障礙，頭顱MRI檢查已經(jīng)出現(xiàn)明顯白質(zhì)病變，為晚發(fā)嬰兒型。

Krabbe病頭顱CT早期可在雙側(cè)丘腦、尾狀核、放射冠和小腦齒狀核發(fā)現(xiàn)對稱性高密度，隨著病變進展，可見彌漫性腦白質(zhì)萎縮。頭顱MRI表現(xiàn)為深部白質(zhì)、小腦白質(zhì)及小腦核團非特異性長T1、長T2信號，早期可見小腦白質(zhì)、內(nèi)囊后肢及小腦核團異常長T2信號，后逐漸出現(xiàn)大腦深部白質(zhì)長T2信號，常見于頂葉，并可擴展至胼胝體壓部或內(nèi)囊后肢，后期可出現(xiàn)丘腦、腦干受累[11]。彌散張量成像（diffusion tension imaging，DTI）對白質(zhì)和灰質(zhì)的區(qū)別以及白質(zhì)纖維走行有很好的成像效果，可更好的顯示出脫髓鞘變化，有助于早期發(fā)現(xiàn)病變[12]。研究報道，中腦受累可反映Krabbe病腦損傷的程度[13]。本例患兒頭顱MRI顯示雙側(cè)頂枕葉腦室后角旁深部白質(zhì)、胼胝體壓部及內(nèi)囊后肢對稱彌漫長T1、長T2信號，為Krabbe病的頭顱MRI表現(xiàn)，但從臨床表現(xiàn)和頭顱MRI上與腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（兒童腦型）不易鑒別，雖初步進行腎上腺皮質(zhì)功能及腎上腺超聲檢查未見異常，但確診依賴于酶學(xué)、基因?qū)W檢測。白細(xì)胞或培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞GALC活性測定是重要診斷依據(jù)，當(dāng)酶活性低于正常值的5%即可確診，但酶活性高低不能作為臨床分型及病情預(yù)后的指標(biāo)。用干血濾紙片進行酶活性測定已經(jīng)在國外的一些國家廣泛應(yīng)用于疾病診斷及新生兒篩查[14，15]。正常人群中GLAC活性變化范圍很大，與基因多態(tài)性有關(guān)[10]?；?qū)W檢查不但可以診斷還能協(xié)助檢測出攜帶者及遺傳咨詢。本例患兒因經(jīng)濟問題未行酶學(xué)檢測，因其從臨床上與腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良不易鑒別，故更適于選擇快速高通量的腦白質(zhì)病相關(guān)基因二代測序。

GALC基因位于14q31，長度57 kb，包含17個外顯子，編碼669個氨基酸。目前本病基因型與臨床表型確切關(guān)系尚不清楚，而且不同種族突變類型亦不同[16]。我院較早報道2例中國患者，1例為嬰兒型，1例為成年型，發(fā)現(xiàn)4個新發(fā)突變，其中3個為新報道突變[17]。國內(nèi)還報道3例Krabbe患兒GALC基因檢測發(fā)現(xiàn)5個突變，其中2個為已知突變p.S68F、p.R531H，3個新錯義突變p.D46Y、p.P154H、p.G59S[3]。本例患兒GALC基因為復(fù)合雜合突變，經(jīng)過家系驗證分別來源于父母，符合常染色體隱性遺傳規(guī)律，結(jié)合臨床表現(xiàn)及頭顱影像學(xué)檢查，Krabbe病診斷明確。c.1832T＞C突變已有報道[1]，c.979T＞G突變在人類基因突變數(shù)據(jù)庫、基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫和100例正常人中均未發(fā)現(xiàn)，為首次報道。表明中國Krabbe病患者GALC基因突變有自身特點，本研究新突變的發(fā)現(xiàn)拓展了中國人群Krabbe病的基因突變譜。

目前Krabbe病在臨床上尚無特異治療方法，以支持對癥治療為主。有研究表明在癥狀出現(xiàn)前可通過造血干細(xì)胞移植治療改善預(yù)后，改變疾病自然病程[18]?；蛑委?、酶替代治療在動物實驗中已取得較大進展，將有希望用于臨床[19，20]。對于高度懷疑本病的患兒需盡早行GALC活性或GALC基因檢測明確診斷。第二代高通量測序技術(shù)可縮短檢測時間，降低測序費用，尤其對于臨床上鑒別診斷困難的遺傳性腦白質(zhì)病具有很大優(yōu)勢。對于先證者家庭應(yīng)做好遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷避免患病兒出生。干血濾紙片篩查GALC活性方法在部分國家已經(jīng)應(yīng)用于新生兒篩查，可更早發(fā)現(xiàn)患兒，以達(dá)到早期診治的目的[21]。

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Application of next generation sequencing technology for genetic diagnosis of a case with globoid cell leukodystrophy

MA Xiuwei, ZHAO Jiayan, ZHU Lina, FENG Zhichun (Department of Neurology and Development, Bayi Children’s Hospital Af fi liated to PLA Army General Hospital, Beijing 100700, China)

ObjectiveTo explore the clinical, radiological features and gene mutation of GALC gene in one child with globoid cell leukodystrophy (Krabbe disease).MethodsThe clinical and radiological data of a patient diagnosed with Krabbe disease through next-generation sequencing were retrospectively analyzed. Sanger sequencing was used to confrm the results.ResultsThe patient was late infantile form with main manifestations of progressive psychomotor regression and convulsion. Brain MRI showed symmetric long T1 and long T2 signal changes in the white matter next to lateral ventricle angle, posterior limb of internal capsule, and the ministry of corpus callosum. The patient was found to have compound heterozygous mutations of c.1832T＞C in exon 15 and c.979T＞G in exon 9, which resulted in amino acid changes of p.L611S and p.F327V, respectively. Sanger sequencing results showed that the two heterozygous mutations were correspondingly inherited from his mother and father.ConclusionsNext-generation sequencing technology is a useful tool for the detection of GALC gene mutation, which is valuable for defnite diagnosis and differential diagnosis of Krabbe disease in clinical practice.

globoid cell leukodystrophy; Krabbe disease; imageology; GALC gene; mutation

2017-03-10)

(本文編輯：蔡虹蔚)

封志純 電子信箱: zhjfengzc@126.com

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.08.016