魏洪平1 吳 敏2

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬義烏醫(yī)院1.兒科，2.藥劑科（浙江義烏 322000）

舌下免疫治療對塵螨過敏哮喘患兒Th17/Treg平衡的影響

魏洪平1 吳 敏2

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬義烏醫(yī)院1.兒科，2.藥劑科（浙江義烏 322000）

目的觀察舌下免疫治療（SLIT）對塵螨過敏哮喘患兒Th17/Treg平衡的影響。方法124例塵螨過敏哮喘患兒隨機分為觀察組62例和對照組62例，兩組患兒均根據(jù)病情調(diào)整吸入性糖皮質(zhì)激素治療方案，觀察組加用粉塵螨滴劑舌下含服，治療1年。比較兩組治療前后Th17和Treg細胞比例以及血清IL-10和IL-17水平差異。結(jié)果在治療半年和1年后，觀察組（中途退出8例，最終54例）Th17細胞比例和血清IL-17水平均低于對照組，Treg細胞比例和血清IL-10水平均高于對照組，觀察組兒童哮喘控制測試（C-ACT）評分均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療前、治療半年和1年后三個時間點之間比較，對照組及觀察組的Th17和Treg細胞比例、血清IL-10和IL-17水平以及C-ACT評分的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）。對照組及觀察組的Th17細胞比例和血清IL-17水平隨時間出現(xiàn)下降趨勢，各時間點間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；對照組及觀察組的Treg細胞比例和血清IL-10水平隨時間出現(xiàn)升高趨勢，除了對照組在治療前、治療半年后間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義以外，其余時間點間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。觀察組和對照組C-ACT評分隨時間出現(xiàn)升高趨勢，各時間點間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；結(jié)論粉塵螨滴劑可減輕塵螨過敏哮喘患兒氣道炎癥及糾正Th17/Treg免疫失衡。

粉塵螨滴劑； 過敏性哮喘； 免疫治療； Th17細胞； T淋巴細胞

哮喘是常見的兒童慢性呼吸系統(tǒng)疾病，因長期反復(fù)發(fā)作極大影響兒童身心健康。兒童哮喘與致敏密切相關(guān)，大量流行病學(xué)調(diào)查顯示，兒童期對屋塵螨的暴露和敏感性與日后哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近三年來，本課題組對756例喘息患兒采用免疫印跡法檢測血清中過敏原特異性IgE抗體，發(fā)現(xiàn)132例塵螨陽性，占17.5%；塵螨完全回避不切實際，大約 50%患兒藥物治療難以有效控制癥狀。舌下免疫治療（sublingual immunotherapy，SLIT）同皮下免疫治療相比，具有無痛、安全等優(yōu)點，適合兒童及家庭用藥，目前國外已廣泛應(yīng)用于過敏性疾病的治療。本研究檢測塵螨過敏哮喘患兒使用SLIT塵螨滴劑舌下含服治療對患兒Th17平衡及血清白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-17（IL-17）水平影響，并觀察治療效果，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2014年10月至2016年10月期間在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬義烏醫(yī)院兒科確診的塵螨過敏性哮喘患兒為研究對象，納入標(biāo)準：①年齡3～12歲；②符合兒童哮喘診斷標(biāo)準，且屬于輕中度過敏性哮喘[1]；③經(jīng)免疫印跡法檢測血清特異性IgE（special IgE，sIgE），血清塵螨sIgE濃度≥0.71 IU/mL。研究對象排除標(biāo)準：①有心、肝、腎、肺等嚴重慢性疾病；②嚴重免疫性疾??；③重度持續(xù)性哮喘、哮喘病情不穩(wěn)定或急性發(fā)作期者；④未完成1年療程。

本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，并獲得監(jiān)護人和患兒的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 分組及治療 根據(jù)就診順序，按隨機數(shù)字表法將入組患兒隨機分為觀察組和對照組。兩組患兒根據(jù)兒童哮喘診斷及防治指南[1]結(jié)合病情調(diào)整吸入糖皮質(zhì)激素治療方案。觀察組在此基礎(chǔ)上予粉塵螨滴劑（國藥準字S20060012，浙江我武生物科技有限公司）舌下含服治療，第1、2、3周分別使用滴劑1號（1 μg/ mL）、2號（10 μg/mL）、3號（100 μg/mL），每周第1～7天，每天按1、2、3、4、5、6、7滴依次遞增服用；從第4周開始使用滴劑4號（333 μg/mL）每次3滴，一日一次，在治療期間需接受隨訪和復(fù)診，直至療程結(jié)束。兩組均治療1年，患兒治療前、治療后半年及治療滿1年后分別檢測外周血Th17和Treg細胞比例、血清IL-10和IL-17水平。

1.2.2 哮喘藥物治療強度評估 根據(jù)兒童哮喘診斷及防治指南診斷標(biāo)準制定的哮喘患兒長期治療分級方案：患兒≥6歲者，分為1～5級，分別賦值1～5分；＜6歲者，分為1～4級，分別賦值1～4分。

1.2.3 療效判斷標(biāo)準 采用兒童哮喘控制測試（C-ACT）量表[2]，首先向患兒及家長解釋問卷內(nèi)容及填寫注意事項和方法，由患兒和家長共同完成量表。C-ACT共有7道問題，前4題由患兒在醫(yī)師和家長的指導(dǎo)下完成，采用4級評分法（0～3分），后3題由家長完成，分6個等級（0～5分）進行評估。最后將所有問題分數(shù)相加得出該患兒的總分，分值越高表示哮喘控制越好。

1.2.4 外周血Th17和Treg檢測 取外周靜脈血2 mL，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。Th 17表面染色采用熒光標(biāo)記的表面抗體抗人CD4-PreCP-Cy5.5（BD Pharmingen），4℃避光孵育30 min，洗滌后，用破膜固定液破膜固定，4℃避光孵育20min，細胞內(nèi)染色采用IL-17-FITC（Biolegend）；Treg細胞表面染色采用熒光標(biāo)記的表面抗體抗人CD4-PreCP-Cy5.5（BD Pharmingen）和抗人CD25-PE染CD4和CD25分子，用Cytofix/Cytoperm（ebiosience）緩沖液試劑4℃避光孵育30min，破膜固定，用Foxp3-FITC（ebiosience）4℃避光孵育60min進行Foxp3染色，所有樣本采用流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 血清IL-10、IL-17檢測 抽取外周靜脈血，送化驗室分離血清，采用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清IL-10、IL-17水平，試劑盒購自R＆D公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

共入組124例，其中8例觀察組患兒服用粉塵螨滴劑出現(xiàn)嗜睡、頭暈，家屬擔(dān)心影響患兒學(xué)習(xí)，中途退出。最終觀察組54例，對照組62例，兩組患兒性別、年齡、病情嚴重程度、病程及藥物治療強度組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

2.2 兩組患兒治療前后Th17和Treg細胞比例比較

在治療半年和1年后，觀察組Th17細胞比例均低于對照組，Treg細胞比例均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。治療前、治療半年后和治療1年后三個時間點之間比較，對照組及觀察組的Th17細胞和Treg細胞比例的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）；對照組及觀察組的Th17細胞比例均隨時間出現(xiàn)下降趨勢，各時間點兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；對照組及觀察組的Treg細胞比例均隨時間出現(xiàn)升高趨勢，除了對照組的Treg細胞比例在治療前、治療半年后之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義以外，其余各時間點間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組一般資料比較

表2 兩組患兒治療前后Th17和Treg細胞比較(±s)

表2 兩組患兒治療前后Th17和Treg細胞比較(±s)

組別例數(shù)治療前 治療半年 治療1年 治療前 治療半年 治療1年Th17/% F值 P Treg/% F值 P對照組62 3.42±1.632.95±1.58 2.42±1.32 6.357 0.000 2.24±0.76 2.56±0.79 2.87±0.87 4.814 0.000觀察組54 3.36±1.492.52±1.14 1.53±0.91 9.597 0.000 2.28±0.79 3.27±1.16 3.95±1.32 8.432 0.000 t值 0.129 2.126 4.472 0.137 2.741 4.176 P 0.996 0.039 ＜0.001 0.863 0.009 ＜0.001

2.3 兩組治療前后血清IL-10、IL-17水平比較

治療半年和1年后，觀察組血清IL-10水平均高于對照組，血清IL-17水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。治療前、治療半年和治療1年后三個時間點比較，對照組及觀察組血清IL-10和IL-17水平的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；對照組及觀察組的血清IL-17水平隨時間出現(xiàn)下降趨勢，各時間點兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組及觀察組的血清IL-10水平均隨時間出現(xiàn)升高趨勢，除了對照組血清IL-10水平在治療前、治療半年后之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義以外，其余各時間點兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組治療前后血清IL-10、IL-17水平比較(±s)

表3 兩組治療前后血清IL-10、IL-17水平比較(±s)

IL-10/pg·mL-1組別例數(shù)治療前 治療半年 治療1年 治療前 治療半年 治療1年F值 P IL-17/pg·mL-1F值 P對照組62 35.89±12.63 39.37±13.53 50.32±10.97 5.893 0.000 84.52±27.35 67.69±25.38 46.32±12.43 5.767 0.000觀察組54 36.08±11.49 47.94±18.53 65.68±28.13 5.945 0.000 86.97±27.89 41.68±16.33 19.46±7.96 16.767 0.000 t值 0.149 2.341 2.654 0.150 4.257 6.798 P 0.798 0.042 0.011 0.699 ＜0.001 ＜0.001

2.4 兩組治療前后C-ACT評分比較

治療半年和1年后，觀察組C-ACT評分均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療前、治療半年和1年三個時間點比較，對照組及觀察組的C-ACT評分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；兩組的C-ACT評分隨時間出現(xiàn)升高趨勢，各時間點兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組治療前后C-ACT評分比較(±s)

表4 兩組治療前后C-ACT評分比較(±s)

組別 例數(shù) 治療前 治療半年 治療1年 F值 P對照組 62 17.52±1.99 19.26±1.71 20.13±1.49 36.229 0.000觀察組 54 17.64±1.72 20.11±1.57 24.19±1.37 241.321 0.000 t值 0.380 2.783 15.174 P 0.705 0.006 0.000

2.5 不良反應(yīng)

SLIT塵螨滴劑治療過程中，觀察組7例（11.3%）出現(xiàn)不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為皮疹、流涕、嗜睡、頭暈及輕度腹瀉等。

3 討論

塵螨是過敏性疾病最為主要的室內(nèi)過敏原[3]，因其在日常環(huán)境中廣泛存在，難以避免。特異性免疫治療是目前唯一針對過敏性疾病的對因治療方法，SLIT是特異性免疫治療的一種，具有便捷、安全、有效的特點。SLIT塵螨滴劑已廣泛用于過敏性鼻炎及過敏性哮喘等的治療[4]，2013年世界變態(tài)反應(yīng)組織（WAO）將舌下含服免疫治療可作為初始、早期的呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療策略[5]。目前脫敏治療的免疫機制并不十分清楚，通常認為通過持續(xù)給予高劑量的變應(yīng)原治療，使外周T細胞的特異性無反應(yīng)性，T細胞增殖和T細胞的細胞因子活性受到抑制。

支氣管哮喘的本質(zhì)是慢性氣道炎癥，而T淋巴細胞在其中發(fā)揮重要作用。過去長期認為Th2細胞應(yīng)答增強所導(dǎo)致的Th1/Th2平衡失調(diào)是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵因素。近年來，Th17細胞和Treg細胞在哮喘中的作用日益受到重視[6]。Th17細胞主要分泌IL-17A、IL-17F、和IL-22等炎性因子，因高分泌IL-17而得名[7]。相關(guān)研究證實中、重度過敏性哮喘患者外周血中Th17細胞百分率及血漿中IL-17水平高于輕度哮喘患者及健康對照者[8]。Treg細胞主要分泌IL-10和TGF-β，可通過細胞間或者非細胞間相互作用發(fā)揮免疫抑制作用。相關(guān)研究表明，哮喘兒童體內(nèi)Th17水平明顯高于正常兒童，而Treg水平明顯低于正常兒童，患兒體內(nèi)Treg細胞水平不足以抑制Th17提呈抗原后導(dǎo)致的過度免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致哮喘的發(fā)作[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，通過SLIT治療，塵螨過敏哮喘患兒Th17細胞百分率在半年后顯著降低，Treg細胞百分率在半年后顯著升高，提示SLIT治療可拮抗過敏性哮喘所致的Th17細胞增殖及Treg細胞抑制，從而起到糾正Th17/Treg免疫失衡的作用。

IL-17家族共有A、B、C、D、E、F 6個成員，IL-17A和IL-17F參與了哮喘發(fā)作，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)哮喘患兒血清IL-17水平較正常兒童明顯升高，且與哮喘嚴重程度呈正相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SLIT治療，患兒血清IL-17水平顯著降低，提示SLIT治療可使患兒哮喘嚴重程度減輕，與C-ACT評分結(jié)果基本一致。IL-17參與哮喘患兒的氣道炎癥反應(yīng)，促進支氣管上皮細胞和平滑肌細胞的活化，氣道上皮細胞表達細胞間黏附分子-1，使中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞更易黏附于支氣管上皮細胞；IL-17 還可與多種細胞因子產(chǎn)生協(xié)同作用，加強炎癥反應(yīng)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘發(fā)生和加重時機體產(chǎn)生大量IL-17，促進肺部嗜酸性粒細胞聚集，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)，同時加速氣道重塑[12]。本研究通過給予SLIT治療，降低患兒血清IL-17水平，可能減輕氣道重塑，改善預(yù)后。IL-10在哮喘的發(fā)病機制中，具有廣泛抑制促炎細胞因子的作用，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過SLIT治療，血清IL-10水平顯著升高，可抑制患兒體內(nèi)炎癥反應(yīng)。提示SLIT治療可部分糾正哮喘患兒因IL-17、IL-10異常導(dǎo)致的免疫功能紊亂。

總之，SLIT塵螨滴劑治療塵螨過敏哮喘患兒可顯著減輕氣道炎癥，糾正Th17/Treg免疫失衡，并形成免疫耐受,有效改善患兒C-ACT評分，療效確切，且較少發(fā)生嚴重不良反應(yīng)，但機制仍不十分清楚，仍需大量基礎(chǔ)研究。

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Effect of sublingual immunotherapy on the balance of Th17/Treg for children with mite, allergic asthma

WEI Hongping1, WU Min2（ 1.Department of Pediatrics; 2.Department of Pharmacy, Yiwu Hospital Affiliated Wenzhou Medical University, Yiwu 322000, Zhejiang, China）

ObjectiveTo explore the effect of sublingual immunotherapy (S-LIT) on the balance of Th17/Treg in children with mite allergic asthma.MethodsAll 124 cases with mite allergic asthma were randomly divided into two groups, the control group (62 cases) was treated with ladder type inhalation, and the treatment group (62 cases) was administered of dust mite drops on the basis of conventional treatment. The peripheral frequency of Th17 cell and Treg cell of all the subjects (before and after treatment) were detected by fow cytometry, the serum cytokine IL-10、IL-17 levels wer analyzed by ELISA.ResultsAfter 1 year treatment, the Th17 cells in treatment group (1.50 %±0.87 %) was signifcantly lower than that before treatment (3.39 % ± 1.58 %), and less than that of the control group after 1 year of treatment (2.42 %±1.32 %) (P ＜0.01)；after 1 year treatment, the proportion of Treg cells in treatment group (4.05 %±1.36 %) was signifcantly higher than that before treatment (2.33 ± 0.81%), and more than that of the control group after 1 year of treatment (2.87 %± 0.87 %) (P ＜0.01). After 1 year treatment, the serum IL-10 levels in treatment group (64.76±27.79 pg/mL) was signifcantly higher than that before treatment (36.32 ± 11.53 pg/mL), and more than that of the control group after 1 years of treatment (50.32 ± 10.97 pg/mL) (P ＜0.01)；after 1 year treatment, the serum IL-17 levels in treatment group (20.45±8.35 pg/mL) was signifcantly lower than that before treatment (86.48 ± 28.19 pg/mL), and signifcantly less than that of the control group after 1 year of treatment (46.32 ± 12.43 pg/mL) (P ＜0.01). After 1 year treatment, the Childhood Asthma Control Test (C-ACT）score in the treatment group (24.35 ± 8.47) was signifcantly higher than the control group (20.13 ± 6.86) (P ＜0.05).ConclusionsSLIT can decrease airway infammation and correct the imbalance of Th17/Treg in children with mite, allergic asthma.

dermatophagoidies farinea drops; allergic asthma; immunotherapy; Th17 cells; T lymphocytes

2016-12-18）

（本文編輯：梁 華）

魏洪平 電子信箱：andy_780w@163.com

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.08.002