江 陽

(1.武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072;2.武漢東湖學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430212)

甘氨酸-水楊醛席夫堿和鄰菲咯啉混合配體的銅(Ⅱ)配合物與蛋白質(zhì)相互作用的光譜學(xué)研究

江 陽1,2

(1.武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072;2.武漢東湖學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430212)

在模擬人體生理?xiàng)l件下，綜合利用熒光光譜、紫外吸收光譜、圓二色譜等方法研究了抗腫瘤藥物甘氨酸-水楊醛席夫堿和鄰菲咯啉混合配體的銅(Ⅱ)配合物與蛋白質(zhì)相互作用。熒光光譜和紫外吸收光譜的分析表明銅(Ⅱ)配合物能有效猝滅BSA的內(nèi)源熒光。猝滅過程同時(shí)表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)猝滅特征和靜態(tài)猝滅特征，猝滅機(jī)制為混合機(jī)制。圓二色譜結(jié)果表明隨著銅配物的加入，能引起B(yǎng)SA的構(gòu)象發(fā)生改變，其α-螺旋含量有所減少，肽鏈結(jié)構(gòu)有所伸展。

血清白蛋白；生物活性小分子；光譜學(xué)方法； 抗腫瘤

將具有生物活性的配體與金屬進(jìn)行配合得到金屬配合物，是新型抗腫瘤藥物的重要類型[1-8]。 甘氨酸-水楊醛席夫堿和鄰菲咯啉混合配體的銅(Ⅱ)配合物(分子結(jié)構(gòu)如圖1，分子式為(C26H26N3O5Cu)4，分子量為2094)是新合成的具有抗腫瘤活性的藥物。X-單晶衍射數(shù)據(jù)顯示這個(gè)晶體屬于單斜晶系，空間群為C2/c。晶體數(shù)據(jù)為a=24.100(13) ?,b=13.778(7)?,c=14.964(8)?,=90° ,β=106.304(8)°, λ=90,V=4769(4) A3, Z=8, Dc=1.412 mg·m3, R1=0.0760, ωR2=0.1864，可觀察到的衍射點(diǎn)為1900(I>2σ (I))。對細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示銅配合物對細(xì)胞毒性的影響為10-5M。紫外可見光譜顯示當(dāng)加入DNA后，發(fā)生減色效應(yīng)。隨著配合物濃度的增加，在CD圖中，配合物-DNA的吸收度也在逐漸增大。加入配合物后，EB-DNA體系的熒光強(qiáng)度降低。配合物使DNA的粘度增加。在配合物的循環(huán)伏安中，加入DNA，峰電流降低。在配合物與pBR322 質(zhì)粒DNA電泳實(shí)驗(yàn)中，配合物能將超螺旋切割為線形和缺刻型。

圖1 抗腫瘤藥物分子結(jié)構(gòu)

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，藥物進(jìn)入體內(nèi)后，要通過血漿的貯存與運(yùn)輸，到達(dá)受體部位，進(jìn)而發(fā)生藥理作用[9-11]?？紤]到抗腫瘤藥物的活性與重要的醫(yī)療價(jià)值，研究其與血清白蛋白的相互作用顯得非常有意義，這有助于在分子水平上認(rèn)識(shí)抗腫瘤藥物與蛋白質(zhì)的作用機(jī)理和規(guī)律，了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為生命科學(xué)研究提供有用的信息和數(shù)據(jù)，而且有助于認(rèn)識(shí)藥物作用的藥效和藥理，為藥物分子的設(shè)計(jì)、修飾與篩選提供有益的啟發(fā)與指導(dǎo)。本章將主要利用熒光光譜、紫外光譜和圓二色譜等光譜學(xué)方法，研究在近似生理?xiàng)l件下抗腫瘤藥物銅配物與血清白蛋白的相互作用，從分子水平探討其作用機(jī)理。此外，利用紫外光譜和圓二色譜考察藥物對血清白蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

帶恒溫系統(tǒng)的F-2500熒光光度計(jì)(日本日立公司)。TU-1901紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；Jasco J-810 圓二色光譜儀(日本Jasco公司)。

人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA),牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)等均為Sigma公司產(chǎn)品；NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為三次亞沸水；HSA, BSA等溶液均為pH值=7.4的PBS緩沖溶液配成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

溶液配制： 配制常溫下pH值=7.4的PBS緩沖溶液，并由相應(yīng)緩沖液配制HSA和 BSA溶液。

熒光光譜：測定該研究體系溶液在不同溫度的熒光發(fā)射譜，選定激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為2.5nm和5.0nm，以λex=280nm，繪制研究體系的熒光光譜。

吸收光譜：測定各溶液的吸收光譜及與血清白蛋白物質(zhì)的量之比為1:1的藥物溶液的吸收光譜。

圓二色譜：測定室溫下各不同體系溶液的遠(yuǎn)紫外(200～260nm)圓二色譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 銅配物與BSA相互作用的熒光光譜特征

利用BSA分子中色氨酸殘基的內(nèi)源熒光，以λex=280nm為激發(fā)波長，在340nm附近得到很強(qiáng)的熒光峰；而以同樣激發(fā)波長激發(fā)銅配物時(shí)，在340nm附近則沒有熒光峰，表明該銅配物不會(huì)產(chǎn)生與BSA相互干擾的熒光。因此確定測試條件為：激發(fā)和發(fā)射狹縫寬分別為2.5nm和5.0nm；激發(fā)波長為280nm；pH值=7.4的PBS為緩沖液。固定BSA的濃度為2.0×10-6mol·L-1，逐步增加銅配物濃度, 測定其熒光光譜，得到的熒光光譜圖如2所示。

a到k藥物與BSA的相對濃度比為

由圖2可知，隨著體系中銅配物濃度的增加，BSA的內(nèi)源熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅，熒光強(qiáng)度降低。但并未伴隨最大發(fā)射波長的紅移或藍(lán)移，表明BSA與銅配物的作用未使其發(fā)色團(tuán)的環(huán)境發(fā)生變化。

2.2 銅配物與BSA相互作用的猝滅機(jī)制

熒光猝滅過程分為動(dòng)態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅以及混合猝滅過程，其過程均遵循Stern-Volmer方程[12-13]：

F0/F=(1+KD[Q])(1+KS[Q])

(1)

式(1)中F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；[Q]為猝滅劑的濃度；KD與KS分別是動(dòng)態(tài)與靜態(tài)猝滅常數(shù)。一般情況下，猝滅過程的某一部分是可以忽略的，式(1)即簡化為典型的Stern-Volmer方程：

F0/F=1+KSV[Q]

(2)

然而在有些情況下，熒光體不僅能與猝滅劑發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅，而且能與同一猝滅劑發(fā)生靜態(tài)猝滅，即同時(shí)發(fā)生動(dòng)態(tài)和靜態(tài)的混合猝滅現(xiàn)象，這種情況下實(shí)驗(yàn)所獲得的Stern-Volmer圖不是一條直線，而是一條彎向Y軸的上升曲線[14]。對于本體系所測得的熒光光譜采用典型的Stern-Volmer方程(式2)進(jìn)行作圖，可得Stern-Volmer關(guān)系圖，如圖3所示。

圖3 銅配物與BSA作用的Stern-Volmer關(guān)系圖

從圖3中，可以看出隨著銅配物濃度的升高，其Stern-Volmer圖不是一條直線，而是一條明顯彎向Y軸的上升曲線。說明該體系的猝滅機(jī)制很有可能是混合猝滅過程。

為了進(jìn)一步探討銅配物與BSA間的熒光猝滅作用機(jī)制，設(shè)計(jì)了不同溫度(T=298，304，310K)下銅配物與BSA的作用，并利用式1對低濃度時(shí)進(jìn)行線性擬合，如圖4所示，所對應(yīng)的猝滅常數(shù)列于表1中。

圖4 不同溫度下銅配物與BSA作用的Stern-Volmer關(guān)系圖

pH值T/K10-5Ksv/(L·moL-1)RaS.D.bEa/(kJ·moL-1)2983.3300.99190.04467.43043.5650.99060.05148.6113103.8100.99180.0514

aR is the correlation coefficient;bS.D. is standard deviation.

表1數(shù)據(jù)顯示，隨著溫度的升高，BSA與銅配物作用的熒光猝滅常數(shù)呈規(guī)律性增大，表明銅配物對BSA的猝滅具有動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制的特征。

為了更進(jìn)一步研究銅配物對BSA的作用機(jī)制，在T=298K，pH值=7.4時(shí)，對BSA與銅配物的紫外吸收光譜進(jìn)行了測定，結(jié)果見圖5。

圖5為，2.0×10-6mol·L-1的銅配物的紫外吸收(曲線a)、2.0×10-6mol·L-1的BSA溶液的紫外吸收(曲線b)以及銅配物與BSA的物質(zhì)的量之比為1:1的混合物與銅配物的紫外吸收差譜(曲線c)。從圖5可以看出，b、c兩曲線在波長為250～280nm附近出現(xiàn)了較明顯的變化，表明該銅配物能與BSA基態(tài)分子發(fā)生相互作用，即形成一定的復(fù)合物，體現(xiàn)有靜態(tài)猝滅的特征。

(a) curve a is the absorption spectra of the drug; (b) curve b is the absorption spectra of BSA; (c) curve c is the absorption spectra of the BSA:drug=1:1 subtracts the drug of the same concentration

圖5 銅配物對BSA紫外吸收光譜的影響(T=298K)

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析，可以推測銅配合物對BSA的猝滅機(jī)制是比較復(fù)雜的混合猝滅機(jī)制。

2.3 銅配物與BSA相互作用的表觀結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

根據(jù)小分子與大分子配位方程，以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖，依直線斜率和截距即可求出銅配物與BSA表觀結(jié)合常數(shù)Kb及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，表2不同溫度梯度下，計(jì)算得到了銅配物與BSA相互作用的表觀常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

表2 不同溫度下銅配物與BSA作用的表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

aRis the correlation coefficient;bS.D. is standard deviation.

2.4 銅配物對BSA二級結(jié)構(gòu)的影響

為了考察銅配物對BSA二級結(jié)構(gòu)的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并測試了不同濃度銅配物與BSA作用的圓二色譜(CD譜)，結(jié)果如圖6。另外，利用相應(yīng)的軟件對CD譜進(jìn)行BSA二級結(jié)構(gòu)的計(jì)算，其計(jì)算結(jié)果見表3。

(a) BSA, 2.0×10-6M; (b) drug:BSA =0.5:1; (c) drug:BSA =1:1; (f) drug:BSA=10:1.

圖6 銅配物與BSA作用的圓二色譜

如圖6所示：隨著銅配物的加入，BSA典型的二級結(jié)構(gòu)負(fù)橢圓率峰逐漸降低，說明分子結(jié)構(gòu)在加入銅配物后發(fā)生了變化，其α-螺旋含量有所減少，并且在較高濃度比時(shí)，這種現(xiàn)象很明顯，說明此時(shí)肽鏈結(jié)構(gòu)有所伸展。

表3 BSA二級結(jié)構(gòu)在不同濃度銅配物作用下的變化結(jié)果

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(本文文獻(xiàn)格式：江 陽.甘氨酸-水楊醛席夫堿和鄰菲咯啉混合配體的銅(Ⅱ)配合物與蛋白質(zhì)相互作用的光譜學(xué)研究[J].山東化工，2017，46(06)：51-53，56.)

2016-04-14

江 陽(1983—)，遼寧鞍山人，講師,學(xué)士，主要研究方生物熱化學(xué)。

Q51-3

A

1008-021X(2017)06-0051-03