黃 旭,袁 波,劉家陽

(1. 沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧省食品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110015)

固相萃取-高效液相色譜法測定嬰幼兒乳粉中維生素D3的含量

黃 旭1,2,袁 波1,劉家陽2

(1. 沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧省食品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110015)

建立一種使用高效液相色譜紫外檢測器測定嬰幼兒乳粉中維生素D3含量的方法。樣品經(jīng)高溫皂化反應(yīng)后，將皂化液通過 固相萃取柱，對目皂化液中的維生素D3進行提取，提取液經(jīng)濃縮后，再經(jīng)過正相硅膠柱凈化，氮吹復(fù)溶，通過Zorbax C18色譜柱分離，以外標法定量。維生素D3標準溶液，在曲線范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999；樣品3水平加標回收率分別為97%～102%，6次重復(fù)測定RSD小于2.0%；檢出限為1.0μg /100g，定量限為3.0μg /100g。

固相萃??；嬰幼兒乳粉；維生素D3；正相凈化

維生素D是脂溶性維生素的一類[1]，自然界中廣泛存在，其最重要的兩種形態(tài)是維生素D2(麥角鈣化醇)和維生素D3(膽鈣化醇)。而維生素D3的活性最高，嬰幼兒乳粉中所添加的維生素D均是以維生素D3的形式存在，本文所討論的維生素D也均指維生素D3。維生素D3對人體十分重要，尤其對嬰幼兒來說就更加不可或缺，如果嬰幼兒缺少維生素D3，那么容易造成嬰幼兒缺鈣、佝僂病等疾病[2]；而如果嬰幼兒維生素D3攝入過多，又會造成嬰幼兒的頭疼、心律不齊等癥狀，因此合理的維生素D3的攝取，對于嬰幼兒來說就極為重要。

現(xiàn)行有效的國家標準[3]中對維生素D3檢測規(guī)定的方法是基于皂化法，對皂化液進行液液萃取，合并分次的萃取液后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置濃縮后定容，再使用正相色譜，對濃縮液中的干擾物質(zhì)進行正相分離除雜，最終上機液進入液相色譜分析。

上述方法操作過程復(fù)雜，液液萃取容易出現(xiàn)待測物提取不完全，兩相液面出現(xiàn)乳化等現(xiàn)象；而正相色譜凈化往往需要較專業(yè)的半制備液相色譜，以上兩點均不利于大批量，多批次檢驗操作。本文討論了使用固相萃取代替液液萃取的前處理，且提取液的凈化使用正相硅膠固相萃取柱代替正相色譜的凈化方法，大大降低了檢驗的繁瑣程度，提高了檢驗效率，適用于實驗室大批量，多批次檢驗的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

美國Waters E2695高效液相色譜，包括四元梯度泵，VWD檢測器，固相萃取裝置(Agilent)，分析天平(Mettler)，Milli-Q超純水(美國Millipore公司)；旋轉(zhuǎn)混合儀(IKEA)，恒溫振蕩水浴(FOSS)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(布奇)。

維生素D3標準品(中國食品藥品檢定研究院，201208)，EXtrelut NT20 固相萃取柱(默克公司)、Waters Silica硅膠固相萃取柱，甲醇、正己烷、乙酸乙酯、乙醇、乙腈為色譜純(Fisher公司)，氫氧化鉀、BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、抗壞血酸等為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 色譜條件

Agilent Zorbax C18色譜柱(4.6mm×250mm，粒徑5μm)，流動相為甲醇，流速為1.0mL/min，進樣量100μL，檢測波長為：264nm，色譜柱溫度為常溫。

1.3 標準溶液配置

標準品儲備液：準確稱取維生素D3標準品10.0mg，用色譜純無水乙醇溶解并定容至100mL，使其濃度約為100μg/mL，轉(zhuǎn)移至100mL的棕色試劑瓶中，臨用前用紫外分光光度法校正其濃度。

標準品中間液：準確吸取維生素D3標準儲備溶液10.00mL，用甲醇稀釋并定容至100mL的棕色容量瓶中，濃度為10.0μg/mL。

標準品標準使用液：分別準確吸取維生素D3標準中間使用液0.50,1.00,2.00,5.00,10.00mL于100mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度混勻。此標準系列工作液濃度分別為0.05,0.10,0.20,0.50,1.00μg/mL。

1.4 樣品的前處理過程

1.4.1 皂化過程

1.4.1.1 不含淀粉的樣品

準確稱取均質(zhì)后的樣品10g(精確至0.01g)于250mL棕色碘量瓶中，加入約20mL水，加入1g抗壞血酸，加入50mL無水乙醇，加入5g氫氧化鉀，將上述溶液搖晃均勻，慢慢向瓶底部沖入氮氣，將瓶口蓋緊密封，放恒溫振蕩水浴中，85℃邊振蕩邊進行皂化反應(yīng)30min。反應(yīng)完全后，將溶液放置至室溫，用水將全部皂化液轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖均。

1.4.1.2 含淀粉的樣品

稱取均質(zhì)后的樣品10g(精確至0.01g) 于250mL棕色碘量瓶中，加入20mL溫水混勻，加入0.5g淀粉酶，放入60℃水浴避光恒溫振蕩30min后，然后按照1.4.1.1的步驟依次進行樣品皂化。

1.4.2 固相萃取過程

將固相萃取柱放置在固定的試管架上，將下口敞開，準確移取20.0mL皂化液至固相萃取柱上，待皂化液慢慢留下，待溶液完全被吸附，但不能流出固相萃取柱，等待10min后，使用含有0.1%BHT(質(zhì)量分數(shù))的正己烷進行洗脫，洗脫過程中，固相萃取柱下方應(yīng)鏈接注射器針頭，并將針頭下方放入150mL棕色旋蒸瓶中，分4次向固相萃取柱上添加正己烷，每次25mL，將所有洗脫液全部收集。

1.4.3 濃縮過程

將旋蒸瓶放置在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)上，水浴溫度調(diào)至40℃，進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待瓶內(nèi)液體近干時，使用少量正己烷將瓶內(nèi)液體全部轉(zhuǎn)移至10mL離心管中備用。

1.4.4 凈化過程

取硅膠固相萃取柱，使用5mL正己烷活化，抽干后，將1.4.3制得濃縮液全部轉(zhuǎn)移至固相萃取柱上，過柱抽干后，用乙酸乙酯-正己烷(5+95)溶液5mL淋洗雜質(zhì)并棄去，使用乙酸乙酯-正己烷(30+70)溶液5mL洗脫，收集全部洗脫液于離心管中，40℃水浴氮氣吹干，使用1.0mL甲醇復(fù)溶，旋渦30s。將此溶液過0.45μm濾膜上機測定，得到如下色譜圖1。

圖1 樣品處理液上機色譜圖

2 結(jié)果及討論

2.1 前處理過程

2.1.1 待測物的提取

2.1.1.1 脂肪類物質(zhì)的清除

社會團體推動型聯(lián)盟定位為學(xué)會協(xié)會等社會團體組織在產(chǎn)業(yè)層面落實國家創(chuàng)新體系的途徑和舉措，如山西、重慶、廣西、北京、內(nèi)蒙古、武漢、香港地區(qū)的BIM聯(lián)盟由各省建筑領(lǐng)域相關(guān)協(xié)會主導(dǎo)發(fā)起，推動本省聯(lián)盟成立及開展相關(guān)工作，聯(lián)盟承擔(dān)著一定政府職能。

嬰幼兒乳粉中有很多脂肪類物質(zhì)，而維生素D3作為脂溶性維生素和這些脂肪組分結(jié)合緊密，為了能將維生素D3提取出來，就需要將樣品中的脂肪類物質(zhì)除去，皂化就是在強堿性和高溫的條件下，將脂肪類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醇類和鹽，本方法采用皂化法除去脂肪。

2.1.1.2 皂化前充入氮氣、加入抗壞血酸和乙醇的作用

維生素D3容易被氧化，在皂化前應(yīng)使用氮氣排空皂化瓶中的空氣。皂化體系中加入抗氧化劑-抗壞血酸，目的是防止維生素D3在皂化過程中被溶液體系中溶解的氧氣氧化。乙醇在皂化反應(yīng)過程中的作用有兩個，第一作為皂化反應(yīng)的催化劑，作為載體可以使氫氧化鈉溶液和油脂充分結(jié)合以達到加快反應(yīng)的目的，第二增加待測物在溶液體系中的溶解性，保證了維生素D3的充分提取。

2.1.2 固相萃取過程

2.1.2.1 固相萃取的原理

EXtrelut NT20 固相萃取柱其填料為特殊處理的大孔硅藻土，具有很大的孔體積，且具有化學(xué)惰性，皂化液放入時，會被這些多孔吸附，當使用弱極性的溶液對固相萃取柱上殘留的物質(zhì)進行洗脫時，只能將極性相對較弱的物質(zhì)有選擇的洗脫下來，而水和無機鹽等雜質(zhì)保留在柱體上。皂化液上樣量為20.0mL時，使用100mL的正己烷可將目標待測物完全洗脫下來。

2.1.2.2 固相萃取過程對待測物的保護

維生素D3易于被氧化，為了保證萃取過程維生素D3的不損失，在洗脫液正己烷中加入BHT，BHT是一種良好的抗氧化劑[4]，可很好的保護維生素D3，不會在提取過程之中被氧化。

2.1.3 凈化

2.1.3.1 傳統(tǒng)的凈化方式

在現(xiàn)有的方法中，均采用正相色譜使用硅膠色譜柱進行分離，除雜后，將待測組分保留時間的流出成分收集，氮吹復(fù)溶后再通過反相色譜測定。傳統(tǒng)方法操作復(fù)雜，且需要較為專業(yè)的半制備液相色譜，不利于日常大批量多批次的前處理操作。

2.1.3.2 正相固相萃取[5]

使用具有極性的正相硅膠固相萃取柱，將含有維生素D3的弱極性溶劑正己烷上樣，當通過固相萃取柱時，待測物維生素D3保留在固相萃取柱上，此時維生素D3在體系中屬于極性稍強的物質(zhì)，使用弱極性的淋洗液進行淋洗后，對維生素D3造成干擾的組分被洗出固相萃取柱，再使用極性稍強的洗脫液進行洗脫，可將維生素D3從硅膠柱上洗脫下來，通過氮吹濃縮、復(fù)溶后，進入色譜進行分析。在選擇淋洗液和洗脫液時，分別嘗試了乙酸乙酯、乙醚、丙酮等常用試劑，從試劑友好的角度和洗脫液的濃縮過程來看，最后選定乙酸乙酯和正己烷的混合溶液作為最終洗脫液，可保證對待測組分的良好洗脫。

2.2 液相色譜條件

2.2.1 色譜條件

由于乳粉中成分復(fù)雜，為了將目標峰和干擾組分分離的更好，實驗選擇長度為250 mm的安捷倫ZORBAX C18色譜柱(4.6mm×250mm，粒徑5μm)，而標準工作液和上機液的濃度較低，因此進樣量需要較大，選擇進樣量為100μL，而二極管陣列檢測器靈敏度較低，因此選擇紫外檢測器進行測定，以甲醇為流動相的條件下，柱溫為室溫，流速為1.0mL/min，掃描波長設(shè)為264nm，進入高效液相色譜分析。

2.2.2 線性方程、方法靈敏度

2.2.2.1 方法的線性關(guān)系和檢出限

以甲醇作為稀釋液，準確移取不同體積的混合標準溶液分別配制成混合標準溶液，標準溶液濃度依次為維生素D3：0.05，0.10，0.20，0.40，1.00μg/mL。

結(jié)果表明，維生素D3在范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性方程為Y = 3.09×105X + 3.80×103線性系數(shù)為0.999。分別以信噪比S/N=3的標準溶液濃度和S/N=10的標準溶液濃度作為樣品處理上機液的檢出限濃度和定量限濃度，得到維生素D3的檢出限和定量限分別為1.0μg/100g、3.0μg/100g。

2.2.2.2 樣品平行測定結(jié)果精密度選擇實驗室檢畢樣品作為樣本測定維生素D3的含量，平行測定六次，得到結(jié)果分別為維生素D：9.50，9.29，9.32，9.63，9.17，9.30μg/100g，相對標準偏差(RSD)為1.91%。

2.2.2.3 回收率

向已知濃度的嬰幼兒乳粉樣品中在高、中、低3個濃度添加水平下進行回收試驗，平行3份。標準物質(zhì)添加量，回收率平均值見表1。

表1 已知濃度樣品三水平加標回收率

2.2.2.4 實際樣品的測試分析結(jié)果

選擇實驗室日常試驗剩余樣品，按照上述方法進行維生素D的測定，得到結(jié)果見表2。

表2 實驗室檢測樣品標示值和實際測定值

3 小節(jié)

嬰幼兒乳粉中脂溶性維生素的檢驗是一個難題，不同實驗室之間的檢測結(jié)果也往往出現(xiàn)很大偏差，究其原因就是因為國標中規(guī)定的檢驗方法可操作性差，檢測周期較長，不能滿足大批量多批次工作任務(wù)的需求。本方法的建立，簡化了操作步驟，提高了實驗效率，且經(jīng)過方法學(xué)驗證，能夠滿足日常檢驗，在實際樣品測定中，檢測結(jié)果也能在樣品的明示值范圍之內(nèi)，可以作為實驗室提檢驗嬰幼兒乳粉中維生素D3檢驗方法使用。

[1] 尉全平. 維生素D的生物學(xué)作用[J]. 河北醫(yī)藥,2013 (06):912-914.

[2] 胡冠瓊,池美珠,孫彩霞. 孕母維生素D缺乏對嬰幼兒生長發(fā)育的影響[J].中國婦幼保健,2015 (15):2350-2352.

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5413.9-2010 嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測定[S]．北京: 中國標準出版社,2010．

[4] 湯務(wù)霞,陳明濤,闕曉莉. 抗氧化劑BHT和維生素E對菜籽油的抗氧化研究[J]. 中國食品添加劑,2011 (04):59-62.

[5] 陸慧媛,姜 珊,張 烈,等. 商品化正相硅膠固相萃取柱-氣相色譜法檢測橄欖油中的蠟含量[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2016 (11):4496-4503.

(本文文獻格式：黃 旭,袁 波,劉家陽.固相萃取-高效液相色譜法測定嬰幼兒乳粉中維生素D3的含量[J].山東化工，2017，46(08)：82-84.)

Determin vitamin D3in Infant milk powder with SPE-HPLC

HuangXu1,2，YuanBo1，LiuJiayang2

(1. Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110032,China;2.Liaoning Institute For Food Control, Shenyang 110015,China)

Establish a method for detection of vitamin D3in Infant milk powder with HPLC-VWD。After saponification, pipette the saponified solution to the SPE cartridge, elute and collect the solution and evaporate the solution, and after purification by normal phase silica gel column, redissolution and inject into the HPLC to analyse, separated by Zorbax C18 column and calculate by the external standard method. The solution had good linear relationship within linear ranges, the correlation coefficients of the standard curve were 0. 999, the recoveries at three levels were from 97%～102%, and the relative standard deviations ( RSD ) were less than 2.0%; the LOD is 1.0μg /100g and the LOQ is 3.0μg /100g.

solid phase extraction； infant milk powder；vitamin D3；positive phase purification

2017-03-03

黃 旭(1982—)，遼寧沈陽人，工程師，主要從事食品檢驗和食品檢測方法開發(fā)的工作。

O657.7+2

A

1008-021X(2017)08-0082-03