陳穎慧

（永城職業(yè)學(xué)院食品化工系，河南永城476600）

紫甘藍(lán)提取物對(duì)食源性致病菌的抑菌作用

陳穎慧

（永城職業(yè)學(xué)院食品化工系，河南永城476600）

以7種食源性致病菌作為供試菌株，利用牛津杯法評(píng)估紫甘藍(lán)提取物的抑菌效果，測(cè)定紫甘藍(lán)提取物的最低抑制濃度（MIC），并分析其熱穩(wěn)定性，最后利用透視電鏡試驗(yàn)揭示紫甘藍(lán)提取物的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明：紫甘藍(lán)提取物對(duì)7種食源性致病菌具有較好的抑菌效果，其中對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌效果最好（MIC=0.2%），對(duì)蠟樣芽孢桿菌和阪崎克羅諾桿菌的抑菌效果較差（MIC=0.4%）。紫甘藍(lán)提取產(chǎn)物在60℃以下的殺菌效果較好，90℃，20 min下紫甘藍(lán)提取物抑菌作用全部失活。紫甘藍(lán)提取物是通過(guò)較低的pH值和破壞菌株的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜通透性發(fā)揮抑菌作用。

紫甘藍(lán)提取物；抑菌作用；最低抑制濃度；熱穩(wěn)定性；透射電鏡

紫甘藍(lán)又名紅甘藍(lán)、紫洋白菜或紫包菜，屬于十字花科，富含多種維生素及礦物元素，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[1-2]。此外，紫甘藍(lán)中含有花青素、多酚和黃酮等多種活性物質(zhì)，具有抗氧化和抑制病原微生物的作用。張會(huì)香等分析了紫甘藍(lán)色素對(duì)大腸肝菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑菌作用，并評(píng)估了其抗氧化活性[3]。楊曉玲等則在揭示紫甘藍(lán)色素抑菌能力的基礎(chǔ)上，研究了紫甘藍(lán)色素的熱穩(wěn)定性[4]。然而，紫甘藍(lán)中的活性物質(zhì)并非只有紫甘藍(lán)色素一種，因此有必要對(duì)紫甘藍(lán)提取物做進(jìn)一步的系統(tǒng)研究，并分析其抑菌的機(jī)理。本研究以常見(jiàn)的食源性致病菌為供試菌株，確定紫甘藍(lán)提取物對(duì)這些食源性致病菌的抑菌作用及最低抑制濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），分析其熱穩(wěn)定性，并利用對(duì)照試驗(yàn)和透射電鏡試驗(yàn)揭示紫甘藍(lán)提取的抑菌機(jī)理，從而為紫甘藍(lán)的綜合利用提供新思路。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料、菌株與試劑

紫甘藍(lán)：新鮮無(wú)損壞變質(zhì)，購(gòu)于沃爾瑪超市。

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門(mén)氏菌（Salmonella）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）、阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）和單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

溶菌肉湯培養(yǎng)基（lysogeny broth，LB）、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（Tryptose Soya Agar，TSA）：北京雷根生物技術(shù)有限公司；鹽酸、磷酸緩沖液、戊二醛、乙醇和丙酮：西隴化工股份有限公司；餓酸固定液、醋酸鈾和檸檬酸鉛：天津市大陸化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

牛津杯：上海橋星貿(mào)易有限公司；TGL-24MC臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；AS.3Y分析天平：中科先創(chuàng)科技（深圳）有限公司；PHS-300型臺(tái)式酸度計(jì)：江蘇盛奧華環(huán)?？萍加邢薰?；日立H-7650透視電鏡：上海鑄金分析儀器有限公司。

2 方法

2.1 紫甘藍(lán)提取物的制備

利用向延菊等[5]報(bào)道的方式對(duì)紫甘藍(lán)提取物進(jìn)行制備，得到的紫甘藍(lán)提取物溶液在40℃的真空干燥箱中干燥，從而得到紫甘藍(lán)提取物干粉。

2.2 菌懸液的制備

從凍存管中取100 μL菌液在TSA培養(yǎng)基中三區(qū)劃線，供試菌株的純化。挑取單菌落，在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，20 h。取2 mL上述培養(yǎng)液，在8 500 r/min下離心10 min，小心除去上清液，并用生理鹽水進(jìn)行洗滌，最后將得到的菌泥溶于1 mL生理鹽水中，制成細(xì)胞懸液，并調(diào)整濃度達(dá)到7.0 logCFU/mL[6]。

2.3 紫甘藍(lán)提取物抑菌效果的測(cè)定

利用牛津杯法評(píng)估紫甘藍(lán)提取物的抑菌效果，首先配制TSA培養(yǎng)基，涂布供試菌株，在無(wú)菌環(huán)境下將3只牛津杯（內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm）均勻的垂直放置在TSA培養(yǎng)基中，配制3%的紫甘藍(lán)提取物溶液加到牛津杯中，之后在37℃條件下培養(yǎng)24 h，最后計(jì)算抑菌圈大小[7]，相同pH值下的鹽酸和無(wú)菌蒸餾水處理組為對(duì)照組。

2.4 紫甘藍(lán)提取物MIC值計(jì)算及熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

調(diào)整紫甘藍(lán)提取物的濃度為：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，取7.0 logCFU/mL的菌液進(jìn)行MIC的測(cè)定，具體步驟參考趙敏等[8]的報(bào)道。將MIC的紫甘藍(lán)提取在 60、70、80、90 ℃和 100 ℃下分別處理 10、20、30 min，計(jì)算紫甘藍(lán)提取物在不同溫度處理后的抑菌率。

2.5 透射電鏡試驗(yàn)

為了了解紫甘藍(lán)對(duì)食源性致病菌的抑制作用，分別對(duì)用LB肉湯培養(yǎng)和含有0.5%紫甘藍(lán)提取物的生理鹽水對(duì)金黃色葡萄球菌和空腸彎曲桿菌進(jìn)行處理，培養(yǎng)1 h后利用透視電鏡觀察供試菌株細(xì)胞變化，整個(gè)過(guò)程包括取材、固定、脫水、浸透、包埋、修塊、切片、正染色和透視電鏡觀察[9]。

3 結(jié)果與分析

3.1 紫甘藍(lán)提取物抑菌效果的評(píng)估

利用牛津杯法評(píng)估紫甘藍(lán)提取物對(duì)供試食源性致病菌的抑菌效果，結(jié)果如表1所示。

表1 紫甘藍(lán)提取物抑制效果評(píng)估Table 1 The inhibition effect assessment of purple cabbage extract

由表1可知，0.3%紫甘藍(lán)提取物對(duì)7種食源性致病菌都具有較好的抑菌作用，其中對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌效果最好，抑菌圈的直徑大于14.0 mm，對(duì)蠟樣芽孢桿菌和阪崎克羅諾桿菌的抑菌效果較差，抑菌圈為10.0 mm～12.0 mm。為了分析紫甘藍(lán)提取物抑菌效果和pH值的關(guān)系，以相同pH值的HCl為對(duì)照組，HCl（pH=3.02）對(duì)7種食源性致病菌有一定的抑菌效果，但是遠(yuǎn)低于紫甘藍(lán)提取物，這表明紫甘藍(lán)提取物對(duì)供試菌株的抑菌作用與其pH值有一定的關(guān)系，但是并不能完全解釋其抑菌機(jī)理。

3.2 紫甘藍(lán)提取物對(duì)食源性致病菌的MIC

紫甘藍(lán)提取物對(duì)食源性致病菌的MIC結(jié)果如表2所示。

由表2可知，紫甘藍(lán)提取物對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的MIC為0.2%，對(duì)金黃色葡萄球菌、空腸彎曲桿菌和單增李斯特氏菌的MIC為0.3%，對(duì)蠟樣芽孢桿菌和阪崎克羅諾桿菌的MIC為0.4%，上述結(jié)果和3.1中對(duì)紫甘藍(lán)提取物抑菌效果評(píng)估的結(jié)果趨勢(shì)一致。

表2 紫甘藍(lán)提取物對(duì)供試菌種的MICTable 2 The MIC of purple cabbage extract to tested strains

3.3 紫甘藍(lán)提取物熱穩(wěn)定分析

對(duì)紫甘藍(lán)提取物進(jìn)行不同溫度的熱處理，并計(jì)算其抑菌率，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，紫甘藍(lán)提取物的抑菌效果隨著處理溫度的提高而降低，當(dāng)80℃處理30 min時(shí)，紫甘藍(lán)提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、空腸彎曲桿菌、阪崎克羅諾桿菌和單增李斯特氏菌的抑菌率為0，當(dāng)紫甘藍(lán)提取物在90℃下處理30 min或100℃下處理10 min時(shí)，紫甘藍(lán)提取物對(duì)所用供試菌株失去抑菌作用。紫甘藍(lán)提取物熱穩(wěn)定分析結(jié)果表明紫甘藍(lán)提取物在大于80℃的高溫處理下會(huì)導(dǎo)致失活。

3.4 透視電鏡分析

表3 溫度對(duì)紫甘藍(lán)提取物抑菌效果的影響Table 3 The influence of temperature on bacteriostatic effect of purple cabbage extract

圖1 透視電鏡分析結(jié)果Fig.1 The results of the analysis of SEM

0.5%紫甘藍(lán)提取物處理后的金黃色葡萄球菌和空腸彎曲桿菌的透視電鏡分析結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，經(jīng)過(guò)0.5%紫甘藍(lán)提取物的處理，金黃色葡萄球菌和阪崎克羅諾桿菌的細(xì)胞壁被破壞，菌體形態(tài)發(fā)生了改變，細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞液外泄，這說(shuō)明紫甘藍(lán)提取物通過(guò)破壞供試菌株的細(xì)胞壁，使其細(xì)胞液排出而發(fā)揮其抑菌效果。

4 結(jié)論與討論

紫甘藍(lán)提取物對(duì)7種食源性致病菌具有較好的抑菌作用，但是紫甘藍(lán)提取物對(duì)熱的穩(wěn)定性較差，當(dāng)溫度大于90℃時(shí)，20 min的處理就會(huì)導(dǎo)致抑菌作用消失，這可能是因?yàn)樵诟邷叵伦细仕{(lán)提取物中的活性物質(zhì)，包括有機(jī)酸、多酚、花青素和黃酮類(lèi)化合物會(huì)揮發(fā)或失活，這啟示我們?cè)谔崛∽细仕{(lán)提取物和發(fā)揮其抑菌作用的過(guò)程中要避免高溫處理。同時(shí)，相同pH值鹽酸對(duì)食源性致病菌也具有一定的抑菌作用，這說(shuō)明紫甘藍(lán)提取物的抑菌作用與其較低的pH值有關(guān)。

同時(shí)，在相同的pH值作用下，紫甘藍(lán)提取物的抑菌效果優(yōu)于HCl，這說(shuō)明紫甘藍(lán)提取物的抑菌效果還另有原因。透視電鏡分析表明供試菌株的細(xì)胞形態(tài)被破壞、細(xì)胞液外泄，這些結(jié)果和已有的研究結(jié)果相似[6，9]，這說(shuō)明紫甘藍(lán)提取物中有機(jī)酸和多酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)揮了抑菌作用。有機(jī)酸作為小分子可以透過(guò)菌體的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而改變細(xì)胞內(nèi)的pH值，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，其次多酚類(lèi)物質(zhì)可以改變細(xì)胞膜的通透性，從細(xì)胞液排除，從而導(dǎo)致菌體的死亡[10-11]。

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[3]張會(huì)香,楊世軍,梁閃坐.紫甘藍(lán)色素的抑菌性和抗氧化性研究[J].食品工業(yè),2010(4)：64-66

[4]楊曉玲,郭彥東.紫甘藍(lán)色素的穩(wěn)定性及抑菌性[J].食品科學(xué),2010,31(23)：32-35

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Bacteriostatic Effect of Purple Cabbage Extract to Foodborne Pathogenic Bacteria

CHEN Ying-hui
（Department of Food and Chemical Engineering，Yongcheng Vocational College，Yongcheng 476600，Henan，China）

Seven foodborne pathogenic bacteria were chosen as the tested strains.The oxford cup method was used to evaluate the antibacterial activity of the purple cabbage extract.The minimum inhibitory concentration（MIC）of of purple cabbage extract to tested strains were calculated.The thermal stability of purple cabbage extract was analyzed.Finally，bacteriostatic mechanism of purple cabbage extract was revealed using perspective electron microscopy（SEM）.The results showed that purple cabbage extract had a good bacteriostatic effect to 7 foodborne pathogenic bacteria.The bacteriostatic effects of purple cabbage extract to Escherichia coli and Salmonella were best（MIC=0.2%），meanwhile,the bacteriostatic effects of purple cabbage extract to Bacillus cereus and Cronobacter sakazakii were worst（MIC=0.4%）.The bacteriostatic effect of purple cabbage extract was favourable under less than 60℃，which was inactivated thoroughly with the treatment of 90℃，20 min.Purple cabbage extract played a bacteriostatic role through lower pH and damaging cell morphology and cell membrane permeability.

purple cabbage extract；bacteriostatic effect；minimum inhibitory concentration；thermal stability；perspective electron microscopy

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.008

2017-03-19

陳穎慧（1981—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程。