周鳴，余蕾，李琴山，王碧，楊國珍

（1.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院，貴州 貴陽550025；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院貴州省產(chǎn)前診斷中心，貴州 貴陽550002）

MIF基因沉默對肝癌細胞系增殖凋亡及ERK/RSK2信號通路的影響

周鳴1，余蕾2，李琴山2，王碧2，楊國珍1

（1.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院，貴州 貴陽550025；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院貴州省產(chǎn)前診斷中心，貴州 貴陽550002）

目的 探討RNA干擾介導的巨噬細胞移動抑制因子（MIF）基因沉默對肝癌細胞系SMMC-7721與HepG2凋亡的影響及可能的作用機制。方法 將MIF-siRNA干擾序列轉染SMMC-7721與HepG2細胞，以Con-siRNA序列轉染的細胞作為對照。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）及Western blot檢測MIF沉默效果，CCK-8法測定細胞增殖情況，流式細胞術檢測細胞凋亡率。采用Western blot檢測MIF沉默后凋亡相關基因BCL-2、BAX、P53的蛋白水平及細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、P90核糖體s6激酶2（RSK2）、糖原合成激酶3β（GSK3β）、Bad蛋白水平及其磷酸化水平。結果 沉默組細胞中MIF mRNA及蛋白表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），沉默組低于對照組；兩組細胞增殖能力比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MIF沉默組細胞增殖能力低于對照組；兩組凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MIF沉默組細胞凋亡率高于對照組；兩組細胞BAX、P53、BCL-2蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MIF沉默組細胞BAX、P53的蛋白表達水平高于對照組，而BCL-2蛋白水平低于對照組；沉默組與對照組細胞中ERK、RSK2及Bad蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而沉默組與對照組細胞中GSK3β、p-GSK3β、p-ERK、p-RSK2及p-Bad蛋白水平比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 MIF基因沉默抑制SMMC-7721與HepG2細胞的增殖能力并促進細胞凋亡可能是通過調節(jié)ERK/RSK2信號通路實現(xiàn)的。

巨噬細胞移動抑制因子；基因沉默；肝癌細胞系；凋亡；細胞外信號調節(jié)激酶

原發(fā)性肝癌以肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）為主，發(fā)病率近年來逐漸增高，在所有惡性腫瘤中居世界第6位，國內第3位[1]。巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一種功能多樣的細胞因子，研究表明[2-4]，其在多種腫瘤組織細胞中高表達，并參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移。近年來研究發(fā)現(xiàn)[5-7]，MIF在多數(shù)肝癌患者血清及肝癌組織中呈高表達并促進肝癌細胞增殖，但目前國內外關于MIF與肝癌細胞凋亡之間關系的研究較少。因此，本課題擬利用siRNA介導的 MIF基因沉默來研究其對肝癌細胞系SMMC-7721與HepG2凋亡的影響并探討可能的分子信號通路，為選擇MIF作為肝細胞癌治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

MIF-siRNA和Con-siRNA序列由吉凱基因公司合成（MIF-siRNA序列：正向5'-GGGUCUACAUC AACUUCAACUAUUAdTdT-3'，反向3'-dTdTCCCAG AUGUAGUUGAUAAU-5'；Con-siRNA序列：正向5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'，反向3'-dTdT AAGAGGCUUGCACAGUGCA-5'），配制終濃度為20μmol。LipofectamineTM2000、DMEG高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（北京鼎國昌盛生物公司），Trizol試劑（大連寶生物公司），兔抗人MIF、BCL-2、BAX、P53、與GAPDH一抗、羊抗兔二抗（英國Abcam公司），ERK、p-ERK、RSK2、p-RSK2、GSK-3β、p-GSK-3β、Bad與p-Bad一抗（美國Santacruze公司），蛋白Marker、PVDF膜、脫脂奶粉、TBST、ECL發(fā)光試劑盒等（北京康為世紀生物公司），CCK-8試劑盒（上海谷研生物公司），SMMC-7721與HepG2細胞系（中國科學院上海生化與細胞所）傳代后用于本實驗。蛋白膜成像掃描儀（美國BioRad公司）。

1.2 MIF-siRNA轉染細胞

當六孔板中SMMC-7721與HepG2細胞生長至60%左右，每孔用5μl MIF-siRNA和Con-siRNA稀釋液進行轉染（siRNA工作濃度為50 nmol），方法參照LipofectamineTM2000說明書。

1.3 qRT-PCR及Western blot檢測MIF沉默效果

轉染 48 h后，收集 MIF沉默組和對照組SMMC-7721與HepG2細胞，Trizol法提取總RNA并測定濃度。以人GAPDH為內參，按照試劑盒說明書配制反應體系，采用Fast 7500 Real Time System進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測，每個樣品設3個復孔。反應條件為95℃30 s，95℃3 s，60℃30 s，共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用比較CT法（ΔΔCT），相對表達量（RQ）=2-ΔΔCT，取3次平均值作圖。Western blot方法見1.6。引物序列如下：GAPDH-正向：5'-GGAGCCAAAAGGGTCATCATCT C-3'，GAPDH-反向：5'-GAGGGGCCATCCACAGTC TTCT-3'；MIF-正向：5'-CTATTACGACATGAACG CG-3'，MIF-反向：5'-CAACTCCACCTTCGCCTAA-3'。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖

轉染SMMC-7721與HepG2 24 h后，收集細胞并接種于96孔板中，每孔100μl培養(yǎng)液，約2 500個細胞，每組設3個復孔。于接種第1天至第5天采用 CKK-8法檢測 MIF沉默對 SMMC-7721及HepG2細胞增殖的影響。每孔加入100μl新鮮培養(yǎng)基和10μl CCK-8溶液，于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，測定細胞在A450 nm處的吸收值，連測5 d，實驗重復3次。繪制細胞生長曲線。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率

MIF-siRNA轉染SMMC-7721與HepG2 48 h后，胰蛋白酶消化處理并離心收集沉默組和對照組細胞各5×105個于1.5 ml EP管中，每管加入500μl結合緩沖液懸浮細胞，加入5μl Annexin V-FITC及10μl PI混勻并室溫避光放置約20 min，然后采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測蛋白水平

轉染 48 h后，收集沉默組和對照組SMMC-7721與HepG2細胞，提取總蛋白并測定濃度。取100μg總蛋白，加入5×Loading Buffer，沸水浴處理10 min，再冰浴5 min，-20℃保存?zhèn)溆?。?jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜與封閉后用MIF、BCL-2、BAX、P53、ERK、p-ERK、RSK2、p-RSK2、GSK-3β、p-GSK-3β、Bad、p-Bad與GAPDH一抗及二抗雜交，加上發(fā)光混合液后采用蛋白膜成像掃描儀檢測結果。蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MIF沉默效果

MIF siRNA轉染細胞48 h后提取細胞總RNA與蛋白分別進行qRT-PCR與Western blot檢測。結果顯示，與對照組SMMC-7721及HepG2細胞相比，沉默組2種細胞中MIF mRNA與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.011和5.274，P=0.007和0.006），沉默組2種細胞中蛋白水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.875和14.423，P=0.000和0.000），沉默組表達降低。表明MIF siRNA的沉默效果較好。見圖1。

2.2 細胞增殖結果

圖1 MIF siRNA沉默效果

圖2 細胞增殖能力

采用CCK-8法檢測MIF沉默對2種細胞增殖能力的影響。結果顯示，與對照組相比，MIF沉默第3天至第5天，沉默組SMMC-7721及HepG2細胞的增殖能力差異有統(tǒng)計學意義（t=5.155、3.362和4.492，P=0.007、0.028和 0.011；t=3.319、3.552和4.042，P=0.029、0.024和0.016）。沉默組均下降。表明MIF基因沉默抑制了SMMC-7721與HepG2細胞的增殖能力。見圖2。

2.3 細胞凋亡情況

采用流式細胞術檢測 MIF siRNA轉染SMMC-7721與HepG2細胞48 h后細胞凋亡率。結果顯示，兩組SMMC-7721與HepG2細胞的早期凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.670和2.941，P= 0.021和0.042），MIF沉默組SMMC-7721與HepG2細胞的早期凋亡率增加，而2種細胞晚期凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.552和11.803，P=0.003和0.000）。表明MIF被沉默后，促進了細胞凋亡，尤其是促進了晚期細胞凋亡。見圖3。

2.4 凋亡相關基因的蛋白水平

Western blot檢測結果顯示，兩組細胞BAX、 P53、BCL-2蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MIF沉默組細胞BAX、P53的蛋白表達水平高于對照組，而BCL-2蛋白水平低于對照組。表明MIF被沉默后，促凋亡基因表達增加，抗凋亡基因表達減少。見表1、2，圖4。

2.5 ERK通路蛋白激酶及磷酸化水平

Western blot檢測結果顯示，沉默組與對照組SMMC-7721和HepG2細胞中ERK、RSK2與Bad總蛋白水平比較，均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。沉默組SMMC-7721與HepG2細胞中GSK-3β蛋白水平與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。沉默組高于對照組。沉默組SMMC-7721與HepG2細胞中p-ERK、p-RSK2、p-Bad和p-GSK-3β蛋白水平與對照組相比，均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），沉默組下調。表明MIF基因沉默影響了ERK信號通路中相關蛋白的活性。見圖5，表3、4。

圖3 細胞凋亡情況

表1 兩組SMMC-7721細胞中相關蛋白相對表達量比較 （n=3，±s）

表1 兩組SMMC-7721細胞中相關蛋白相對表達量比較 （n=3，±s）

組別P53對照組 0.73±0.04 0.61±0.08 0.22±0.02 0.15±0.03沉默組 0.12±0.01 0.16±0.03 0.45±0.06 0.47±0.05 t值 25.625 9.122 6.299 9.505 P值 0.000 0.001 0.003 0.001MIFBCL-2BAX

表2 兩組HepG2細胞中相關蛋白相對表達量比較 （n=3，±s）

表2 兩組HepG2細胞中相關蛋白相對表達量比較 （n=3，±s）

組別P53對照組 0.46±0.05 0.27±0.04 0.26±0.06 0.27±0.02沉默組 0.18±0.02 0.14±0.03 0.53±0.03 0.57±0.07 t值 9.801 4.503 6.971 7.775 P值 0.001 0.011 0.002 0.001MIFBCL-2BAX

圖4 兩組細胞凋亡相關基因的蛋白水平

圖5 兩組細胞ERK通路蛋白激酶及磷酸化水平

表3 兩組SMMC-7721細胞中相關蛋白相對表達量比較 （n=3，±s）

表3 兩組SMMC-7721細胞中相關蛋白相對表達量比較 （n=3，±s）

組別p-Bad對照組 1.07±0.04 0.55±0.05 1.05±0.04 0.43±0.03 1.02±0.05 1.06±0.07沉默組 1.10±0.03 0.26±0.02 1.03±0.03 0.22±0.03 1.01±0.05 0.34±0.03 t值P值ERKp-ERKRSK2p-RSK2Badp-GSK-3β 0.26±0.02 0.36±0.05 0.46±0.04 0.22±0.04 8.429 4.445 0.001 0.011 GSK-3β1.147 0.315 10.066 0.001 0.772 0.510 8.573 0.001 0.923 0.872 16.869 0.000

表4 兩組HepG2細胞中相關蛋白相對表達量比較 （n=3，±s）

表4 兩組HepG2細胞中相關蛋白相對表達量比較 （n=3，±s）

組別p-Bad對照組 0.91±0.03 0.32±0.03 1.03±0.02 0.72±0.06 0.85±0.03 0.91±0.03沉默組 0.94±0.06 0.12±0.02 0.99±0.05 0.37±0.07 0.83±0.04 0.35±0.05 t值P值ERK p-ERK RSK2p-RSK2Bad GSK-3β 0.786 0.476 10.142 0.001 1.043 0.356 6.976 0.002 0.606 0.577 18.559 0.000 p-GSK-3β 0.32±0.04 0.25±0.04 1.12±0.05 0.13±0.02 24.042 5.091 0.000 0.007

3 討論

HCC作為人類最常見的一種惡性腫瘤，已成為僅次于胃癌和肺癌的第3大殺手[8]。腫瘤的發(fā)展依賴于降低腫瘤細胞凋亡的發(fā)生，因此，促進腫瘤細胞凋亡是一種抑制腫瘤發(fā)展的潛在策略。MIF廣泛存在于各種組織，最初被認為是一種炎癥介質，具有抑制巨噬細胞移動和黏附、參與機體炎癥反應和調控細胞增殖分化等作用[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，MIF與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，且MIF在肝癌患者血清、肝癌組織及肝癌細胞系中呈現(xiàn)高表達[13-14]，其可能參與了肝癌的發(fā)生和發(fā)展。但目前關于MIF與肝癌細胞凋亡之間的研究較少。因此，本課題擬利用siRNA介導的 MIF基因沉默來研究其對肝癌細胞系SMMC-7721與HepG2凋亡的影響并探討可能的分子作用機制。

本研究首先將MIF-siRNA轉染肝癌細胞系SMMC-7721與HepG2，48 h后采用qRT-PCR及 Western blot技術檢測MIF基因沉默效果，結果顯示，與對照組相比，沉默組SMMC-7721與HepG2細胞中MIF mRNA及蛋白水平降低，表明MIF基因沉默效果良好。CCK-8實驗結果表明MIF沉默明顯抑制了2種肝癌細胞的增殖，與HUANG等[15]研究結果一致。流式細胞術檢測結果顯示，MIF基因沉默增加了肝癌細胞的凋亡率，且更促進了細胞不可挽回的晚期凋亡，該結果表明，MIF基因表達水平與肝癌細胞凋亡之間存在密切關系。然后采用Western blot方法檢測了幾種常見的凋亡相關基因的蛋白水平，結果顯示，MIF基因沉默可明顯下調抗凋亡蛋白Bcl-2水平并上調促凋亡蛋白P53與Bax水平。P53基因與細胞基因組完整性、修復DNA損傷、促進癌細胞凋亡等關系密切，其可以通過激活BAX并下調BCL-2的表達來共同發(fā)揮作用，但P53促進腫瘤細胞凋亡的作用可被MIF抑制[16-17]，該結果從分子水平上表明MIF基因沉默對肝癌細胞凋亡的促進作用。

ERK通路是絲裂原活化蛋白激酶信號通路重要組成部分，在調控細胞增殖、存活與凋亡方面發(fā)揮重要作用[18]。為進一步探討MIF基因沉默促進肝癌細胞凋亡的分子作用機制，檢測了細胞中ERK通路中相關基因的蛋白水平。Western blot結果顯示，與對照組相比，沉默組細胞中ERK、RSK和Bad的蛋白水平并未發(fā)生明顯變化，而p-ERK、p-RSK2、p-Bad和p-GSK-3β的蛋白水平下調，GSK-3β蛋白水平上調。蛋白激酶的磷酸化水平直接影響了該激酶自身的活性及其下游新號分子的活化進而調控信號傳導過程。RSK2是ERK下游的一級效應蛋白，活化后可通過調節(jié)與增殖凋亡相關蛋白GSK-3β、Bad等一些下游靶蛋白影響細胞增殖、凋亡等。本研究表明，MIF基因沉默后，細胞中p-ERK水平下降，減少的p-ERK直接導致下游RSK2磷酸化水平的降低，同樣，p-RSK2水平下降影響了直接下游蛋白GSK-3β的磷酸化，p-GSK-3β下調可抑制細胞的增殖與存活。Bad也是RSK2的底物蛋白之一，MIF沉默下調了p-Bad水平，進而促進了細胞的凋亡。

綜上所述，siRNA介導的MIF基因沉默抑制肝癌細胞系SMMC-7721與HepG2的增殖能力并促進細胞凋亡可能是通過調節(jié)ERK/RSK2信號通路發(fā)揮作用。該研究為選擇MIF作為肝癌的治療靶點提供一定的依據(jù)，但癌癥的發(fā)生過程涉及多種因素的參與，仍需進一步深入地研究。

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（張蕾 編輯）

Effect of silencingMIFgene by RNAi on proliferation,apoptosis and ERK/RSK2 signal pathway in hepatic carcinoma cell line

Ming Zhou1,Lei Yu2,Qin-shan Li2,Bi Wang2,Guo-zhen Yang1
(1.School of Medical Laboratory Sciences,Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550025, China;2.Guizhou Provincial Prenatal Diagnosis Center,the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550002,China)

Objective To investigate the effect of silencingMIFgene by RNA interference on apoptosis of hepatic carcinoma cell lines SMMC-7721 and HepG2 and the potential mechanism.Methods The MIF-siRNA interference sequence was transfected into SMMC-7721 and HepG2 cells,Con-siRNA transfected cells were used as the control group.The silencing effect ofMIFgene was detected by qRT-PCR and Western blot.The ability of cell proliferation was evaluated by CCK-8 method.The cell apoptosis rate was detected by flow cytometry.The protein levels of Bcl-2,Bax,p53,extracellular signal-regulated kinase (ERK),p-ERK,p90 ribosomal s6 kinase 2(RSK2), p-RSK2,glycogen synthase kinase 3β(GSK3β),p-GSK3β,Bad and p-Bad were tested by Western blot.Results The expression levels of MIF gene in the cells of the silent groups were significantly lower than that in the controlgroup(P＜0.05).The ability of cell proliferation in theMIFsilent groups was obviously lower than that in the control group (P＜0.05).The cell apoptosis rates in theMIFsilent groups were significantly higher than that in the control group(P＜0.05).Bax and p53 protein levels in the cells of theMIFsilent groups were higher than those of the control group,while the Bcl-2 protein level was lower than that of the control group (P＜0.05).Meanwhile,the protein levels of ERK,RSK2 and Bad were not significantly different between the twoMIFsilent groups and the control group(P＞0.05).However,the protein levels of GSK3β,p-GSK3β,p-ERK,p-RSK2 and p-Bad were significantly different between the two silent groups and the control group (P＜0.05).Conclusions Silence ofMIF gene inhibits the proliferation and promotes the apoptosis of both SMMC-7721 and HepG2 cells maybe via regulation of the ERK/RSK2 signaling pathway.

MIF;gene silencing;hepatic carcinoma cell line;apoptosis;ERK

R735.7

A

2017-01-16

楊國珍，E-mail:myyl2004@163.com ·22·

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.19.005

1005-8982（2017）19-0022-06