秦靈靈，徐暾海，桂海水，劉銅華△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

胰島素抵抗不但是2型糖尿病發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)，同時又是多種代謝疾病發(fā)病的始發(fā)因素。近年來，以2型糖尿病、代謝綜合癥為代表的代謝性疾病發(fā)病率呈快速上升趨勢，因此針對胰島素抵抗的相關(guān)研究業(yè)已成為人們最為關(guān)注的熱點問題。臨床報道匙羹藤在對糖尿病的防治方面有明確的療效，但是在實驗研究方面多停滯在藥效的驗證層面，缺乏對其作用機制的深入研究。本研究從胰島素抵抗為切入點，從分子水平探討匙羹藤改善KKAy小鼠脂肪組織胰島素抵抗的可能機制，借以豐富匙羹藤抗糖尿病作用的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性6～7周齡，雄性KKAY小鼠18只，體質(zhì)量26g±3g;同周齡雄性C57BL/6J小鼠9只，體質(zhì)量22g±3g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所(許可證號SCXK京2009-0004)。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF實驗室，動物室內(nèi)設(shè)置12 h晝夜循環(huán)，并維持室溫23℃ ±2℃，濕度55±10%。動物采用單籠喂養(yǎng)，期間自由攝食、飲水，KK鼠料購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所。

1.2 藥物與試劑

匙羹藤提取物由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供:匙羹藤生藥飲片5kg，加水煎煮3次，料液比分別為 1∶10、1∶10、1∶8，煎煮時間分別為:1.5、1.5、1h，分別過濾合并濾液，濾液減壓濃縮至稠膏，70℃真空干燥，粉碎，過 80目篩，得匙羹藤提取物0.33kg;小鼠放免試劑盒(Merck millipore公司);血糖試紙(日本愛科來試劑公司);Trizol試劑盒(Invitrogen公司);PCR引物(生工生物工程上海有限公司);Real-time PCR擴增試劑盒(中原領(lǐng)先科技有限公司)

1.3 儀器

4℃低溫高速離心機(美國Thermo公司);Real-Time PCR儀(美國 ABI 7500);核酸紫外分光光度計(德國Biophotometer公司);血糖儀(日本愛科來公司)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及給藥 KKAy雄性小鼠18只斷尾取血，測隨機血糖值≥13.9mmol/L者入選，18只全部入選。按照血糖隨機分為模型組(DM)9只，匙羹藤提取物組(GS)9只，另取 9只雄性C57BL/6J小鼠作為空白對照組(NC)。每日GS組小鼠按照2.5g/kg灌胃給藥共8周，DM組、NC組小鼠灌胃等體積無菌水。

1.4.2 觀察指標(biāo)及檢測方法 (1)一般情況觀察:觀察小鼠毛色、神態(tài)、精神狀態(tài)、活動度等情況，隨時記錄;(2)體質(zhì)量:在給藥周期內(nèi)，各組小鼠于每周末禁食不禁水，8h后測量體質(zhì)量;(3)空腹血糖、空腹血清胰島素:在給藥周期內(nèi)，各組小鼠于每周末禁食不禁水，8h后剪尾采用血糖試紙測定血糖(7∶00～15∶00禁食);末次給藥后小鼠禁食不禁水(00∶00～08∶00)，8h 后剪尾用試紙法測定空腹血糖;摘眼球取血后靜置3h，3500r/min分離血清，采用放射免疫法測定空腹血清胰島素水平;(4)胰島素敏感指數(shù)(ISI)檢測:采用李光偉法，ISI=1/(FPG×Fins)，取自然對數(shù)正態(tài)化后進行統(tǒng)計分析;(5)實時 熒 光 PCR 法 檢 測 PPAR-γmRNA、PI3κ-p85 mRNA、CAPmRNA、GluT-4mRNA:處死各組小鼠，速取部分附睪脂肪墊，置入液氮中以備檢測用。①總RNA提取:從液氮中取出脂肪組織放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮進行快速研磨，采用Trizol一步法提取總RNA，采用核酸紫外分光光度計檢測所獲RNA濃度與純度;②引物序列:PPAR γ上游引物:5’-GCCCTTTGGTGACTTTATGG-3’，下 游 引 物:5’-CTTCACGTTCAGCAAGCCT-3’，139bp;PI3κ-p85 上游引物:5’-GGGAGACATCTCAAGGGAAG-3’，下游引物:5’-TTTCCATCACGGTGAAAGATT-3’，162bp;CAP上游引物:5’-TCTTTCAGATCCTGCCTCAG-3’，下游引物:5’-TAGCATCCTTTGCCCTTCTC-3’，110bp;GluT4 上 游引 物:5’-ACTCATTCTTGG ACGGTTCC-3’，下 游 引 物:5’-TAGCTGTGCC CAGCATAGAC-3’，188bp;參照基因 GAPDH;上游引物:5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，下游引物:5’-CAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’，154bp;③RNA的體外反轉(zhuǎn)與Real-Time PCR:經(jīng)25μL反轉(zhuǎn)錄體系，42℃孵育60min，然后70℃10min，將所得的cDNA與下列物質(zhì)加入20μL Real-Time PCR體系，94℃預(yù)變性 1min，94℃ 15s，60℃ 34s，72℃ 15s 40個循環(huán)，72℃ 10min，用相對定量 2－△△CT法分析結(jié)果;(6)統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，全部數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)

模型組小鼠在給藥過程中死亡1只，可能由于灌胃操作失敗導(dǎo)致藥液進入肺臟造成肺炎所致。在給藥期內(nèi)，NC組對照組小鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，活動自如，皮毛有光澤;DM小鼠精神萎靡，行為倦怠，反應(yīng)遲鈍，動作遲緩，皮毛干枯無光澤，隨著實驗時間的延長，這些情況逐漸加重;GS組與DM組小鼠狀態(tài)類似，但是程度較輕，隨著給藥時間的延長精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)。

2.2 匙羹藤提取物對KKAy小鼠體質(zhì)量影響

表1顯示，在給藥過程中，DM組小鼠體質(zhì)量明顯高于NC組(P＜0.01)，與DM組比較，GS組體質(zhì)量在第5周時出現(xiàn)降低(P＜0.05)，從第6周開始出現(xiàn)明顯降低(P＜0.01)并持續(xù)到實驗結(jié)束。

表1 各組KKAy小鼠體質(zhì)量水平(±s)

表1 各組KKAy小鼠體質(zhì)量水平(±s)

注:與NC比較:⊙P ＜0.01，與DM比較:#P ＜0.05，*P ＜0.01

組別 數(shù)量 2周 4周 5周 6周 8周2.24 28.10±2.67 DM 8 36.73±0.95⊙ 40.21±1.64⊙ 41.61±2.08⊙ 41.20±2.89⊙ 39.64±1.84⊙GS 9 35.99±1.62 38.80±1.73 38.39±1.54# 37.93±1.60* 36.22±1.59 NC 9 26.12±1.01 27.88±1.60 28.39±1.71 29.01±*

2.3 匙羹藤提取物對KKAy小鼠 FPG、Fins、ISI的影響

在給藥過程中，DM組小鼠FPG明顯高于NC組(P＜0.01)，與DM組比較，GS組FPG在第6周時出現(xiàn)降低(P＜0.05)，從第7周開始出現(xiàn)明顯降低(P＜0.01)并持續(xù)到實驗結(jié)束。

表2顯示，給藥8周后，與NC組比較，DM組Fins水平明顯升高(P＜0.01)，ISI明顯降低(P＜0.01)，與 DM組比較，GS組 Fins水平降低(P＜0.05)，ISI升高(P ＜0.01)。

2.4 匙羹藤提取物對KKAy小鼠 脂肪組織PPAR-γmRNA 的影響

圖1顯示，藥物干預(yù)8周后，DM組脂肪組織PPAR-γmRNA表達較NC組明顯降低(0.47±0.14 vs 1.03±0.29，P＜0.01)，GS組較 DM 組明顯升高(0.92±0.14 vs 0.47±0.14，P ＜0.01)。

表2 各組 KKAy小鼠 FPG、Fins、ISI水平(±s)

表2 各組 KKAy小鼠 FPG、Fins、ISI水平(±s)

注:與NC比較:⊙P ＜0.01，與DM比較:#P ＜0.05，*P ＜0.01

組別 數(shù)量 FPG(mmol/L)0.83±0.22 －1.61±0.27 DM 8 27.51±1.74⊙ 30.74±1.13⊙ 32.14±1.05⊙ 31.69±1.27⊙ 1.97±0.31⊙ －4.12±0.16⊙GS 9 27.24±2.03 29.59±1.46 30.94±1.32# 28.91±1.55* 1.52±0.47# －3.74±0.30 ISI NC 9 5.97±0.97 6.30±0.83 6.26±0.76 6.28±0.70 2周 4周 6周 8周Fins(ng/mL)8周*

圖1 各組 KKAy小鼠脂肪組織 PPAR-γmRNA的表達量(±s)

2.5 匙羹藤提取物對KKAy小鼠 脂肪組織PI3κ-p85 mRNA 的影響

圖2顯示，藥物干預(yù)8周后，DM組脂肪組織PI3κ-p85mRNA表達較NC組明顯降低(0.48±0.10 vs 1.08±0.27，P ＜0.01)，GS組較 DM 組明顯升高(0.68±0.07 vs 0.48±0.10，P ＜0.01)。

圖2 各組 KKAy小鼠脂肪組織 PI3κ-p85mRNA的表達量(±s)

2.6 匙羹藤提取物對KKAy小鼠 脂肪組織CAPmRNA的影響

圖3顯示，藥物干預(yù)8周后，DM組脂肪組織CAPmRNA表達較NC組明顯降低(0.37±0.10 vs 1.02±0.27，P＜0.01)，GS組較 DM 組明顯升高(0.79±0.20 vs 0.37±0.10，P ＜0.01)。

圖3 各組 KKAy小鼠脂肪組織 CAPmRNA的表達量(±s)

2.7 匙羹藤提取物對KKAy小鼠 脂肪組織GluT-4mRNA的影響

圖4顯示，藥物干預(yù)8周后，DM組脂肪組織GluT-4mRNA表達較NC組明顯降低(0.26±0.07 vs 1.05±0.33，P ＜0.01)，GS組較 DM 組明顯升高(0.63±0.09 vs 0.26±0.07，P ＜0.01)。

3 討論

圖4 各組KKAy小鼠脂肪組織GluT-4mRNA的表達量(±s)

匙羹藤主要分布于我國兩廣地區(qū)，是民間使用及臨床報道具有治療糖尿病作用的單味中藥。動物實驗也證實，其具有一定的降糖［1，2］以及降脂作用［3］。當(dāng)前的研究結(jié)果顯示，通過促進胰島素分泌及合成，借以改善糖耐量是匙羹藤降糖作用的主要機制。胰島素抵抗是在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中占有首要位置的病理因素，關(guān)于匙羹藤對于胰島素抵抗方面的研究卻很少，故本實驗以胰島素抵抗為研究切入點對其抗糖尿病的作用機制進行深入研究。

脂肪組織是胰島素作用的外周靶組織，也是糖脂代謝進行以及交叉作用的主要場所，其中分布于脂肪細胞中對糖代謝和脂肪細胞分化均具有重要調(diào)節(jié)作用的PPAR-γ是當(dāng)前研究IR的集中關(guān)注點，同時也是胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物作用的靶點。PPAR-γ具有高位調(diào)控作用，其可通過多個環(huán)節(jié)對IR具有改善作用，其中通過增加胰島素介導(dǎo)GluT-4轉(zhuǎn)運的受體后PI3κ以及Cb1-CAP信號通路中關(guān)鍵因子PI3κ-p85、CAP的轉(zhuǎn)錄水平，增加GluT-4基因表達量和葡萄糖的攝取率，改善胰島素信號通路的傳導(dǎo)，進而緩解IR是其最重要也是最直接的調(diào)控作用之一［4～7］。本實驗以 PPARγ為研究初始點，以GluT-4表達量為有效性的評價標(biāo)準(zhǔn)以及作用的終點事件，觀察脂肪組織中胰島素介導(dǎo)GluT-4轉(zhuǎn)運受體后信號通路中關(guān)鍵因子的變化，借以追蹤干預(yù)藥物作用機制的靶點路徑。

采用與人類2型糖尿病病理基礎(chǔ)相似的動物模型是進行研究的首要環(huán)節(jié)。KKAy小鼠是一種自發(fā)的2型糖尿病小鼠，具有肥胖、高血糖、血脂異常、高胰島素血癥等特征。該小鼠從8周起就開始出現(xiàn)IR，而具有IR特征的小鼠存在PI3κ信號通路傳導(dǎo)障礙和GLUT4mRNA表達量減少等特征［8］，與本實驗的研究思路相吻合，故選用此動物模型作為觀察對象。

本實驗結(jié)果顯示，匙羹藤能夠改善KKAy小鼠空腹血糖水平、空腹血清胰島素以及胰島素敏感指數(shù)，并推論其緩解胰島素抵抗與其增加脂肪組織PPARγmRNA，進而增加被其調(diào)控的 PI3κ-p85、CAP基因轉(zhuǎn)錄水平，從而上調(diào)GluT-4mRNA水平、促進葡萄糖的攝取相關(guān)。但本實驗并未觀察PI3κ-GluT4以及Cb1-CAP-GluT4這兩條信號通路中下游相關(guān)關(guān)鍵因子的變化，無法判斷最后影響葡萄轉(zhuǎn)運的是兩條通路抑或是其中的一條，故應(yīng)對其各自下游的磷酸肌醇依賴的蛋白激酶(PDK-1)、蛋白激酶B(PKB)以及磷酸化的PKB、AS160以及磷酸化的AS160、CrkⅡ蛋白、C3G蛋白、TC10等因子進行更深一步的研究。另外本實驗對于分布于脂肪細胞膜表面的GluT4蛋白表達量未做觀察，在以后的研究中將會應(yīng)用蛋白免疫印跡法對分布于細胞膜的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白做定量評判，以便為評估葡萄糖轉(zhuǎn)運率提供更為客觀、直接的實驗室指標(biāo)。

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