李淑群陳謙廖維甲翁俊莫慶榮李菁玲喻亞群

新型線粒體靶向鉑類配合物Mor-platin抑制肝癌細胞HepG2增殖和抑制細胞球侵襲的研究*

李淑群①陳謙①廖維甲①翁俊①莫慶榮①李菁玲②喻亞群①

目的：探討新型線粒體靶向性鉑類配合物Mor-platin對人肝癌細胞HepG2的細胞增殖和細胞球侵襲的影響。方法：運用細胞毒性實驗CCK-8法，比較新型線粒體靶向性鉑類配合物Mor-platin和經(jīng)典鉑類抗癌藥順鉑（cisplatin）對人肝癌細胞HepG2的細胞增殖抑制作用；利用激光共聚焦顯微鏡觀察Mor-platin是否靶向于線粒體；利用透射電子顯微鏡觀察Mor-platin對細胞線粒體形態(tài)的影響；流式細胞儀檢測Mor-platin作用細胞后細胞凋亡的改變；建立三維腫瘤細胞球模型，探討Mor-platin對細胞球侵襲的影響。結果：Mor-platin能夠抑制HepG2細胞增殖，半數(shù)抑制濃度（IC50）少于cisplatin；Mor-platin能夠靶向到線粒體；加Mor-platin后，細胞線粒體膜結構不完整，嵴不清晰或消失以及線粒體中有大片空白區(qū)域；Mor-platin引起的細胞凋亡具有劑量依賴性；三維腫瘤細胞球模型顯示，Mor-platin處理的細胞球面積小于對照組。結論：新型線粒體靶向性鉑配合物Mor-platin能夠靶向于細胞的線粒體，引起線粒體形態(tài)變化，抑制細胞增殖，最終導致細胞凋亡，Mor-platin還能抑制三維腫瘤細胞球侵襲，比cisplatin具有更好的抗癌效果。上述研究結果提示Mor-platin具有成為新抗腫瘤藥物的潛質。

順鉑 線粒體 抗腫瘤藥物 人肝癌細胞 細胞增殖 細胞凋亡 細胞球侵襲

1965年美國生物物理學家Rosenberg及其團隊意外發(fā)現(xiàn)“惰性的鉑電極”能夠促使細菌生長，由此展開對順鉑抗癌特性的研究。順鉑可與細胞核DNA結合，抑制DNA復制［1］，并損害細胞膜結構，具有較強的廣譜抗癌性，對卵巢癌、睪丸癌、肺癌、鼻咽癌、頭頸癌等均有較好的療效［2-5］。合成數(shù)千種鉑配合物，其中得到廣泛應用的為卡鉑、奈達鉑和奧沙利鉑，雖然這些鉑類配合物的抗腫瘤效果較強，但是由于均具有相似的結構，容易產生交叉耐藥性，進而限制了其在臨床上的使用。

亞細胞器靶向性特別是線粒體靶向性的鉑類配合物是近年來抗腫瘤藥物的研究熱點，因為線粒體是細胞中除細胞核之外唯一具有遺傳物質DNA的亞細胞器，加上腫瘤細胞和正常細胞的線粒體在結構和功能上有很大不同，腫瘤細胞更易受到線粒體功能影響［6-9］，所以線粒體可以作為鉑類抗腫瘤藥物的治療靶點。本研究新合成的鉑類化合物Mor-plat?in［10］，由于具有磷光、親脂性和離域陽離子等特性，因此能夠追蹤該藥物在細胞內的線粒體靶向性［11］。本研究已對Mor-platin在人肺癌細胞（H1975）中的生物學效應進行了研究，本研究選擇人肝癌細胞HepG2細胞，主要研究Mor-platin對HepG2細胞增殖的影響以及在細胞內的線粒體靶向性，建立三維腫瘤細胞球模型研究細胞侵襲效應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株人肝癌細胞系HepG2購自于中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑細胞培養(yǎng)基DMEM購自于美國Hyclone公司；胎牛血清FBS購自于美國Gibco公司；0.25%胰酶細胞消化液購自于美國Sigma公司；順鉑購自于上海佰世凱化學科技有限公司；Cell Counting Kit-8購自于日本Dojindo公司；線粒體綠色熒光探針（MTG）購自于上海碧云天生物技術有限公司；細胞裂解液RIPA溶液、Trump's固定液、鋨酸、樹脂包埋劑以及其他電鏡相關的試劑均購自于上海生工生物有限公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自于上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器細胞培養(yǎng)箱購自于美國Thermo公司；多功能酶標儀購自于美國Bio Tek公司；掃描型激光共聚焦顯微鏡和倒置熒光顯微鏡均購自于日本Olympus公司；流式細胞儀購自于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞毒性實驗取對數(shù)增長期的HepG2細胞，用0.25%胰酶細胞消化液消化細胞1 min，DMEM培養(yǎng)基終止消化，以每孔10 000/100 μL的細胞濃度接種于96孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）孵育過夜。棄掉原培養(yǎng)基，加入含有不同濃度梯度的Mor-platin和cisplatin的新鮮培養(yǎng)基，以1%二甲基亞砜溶劑作為對照組，同時設立不加細胞的空白對照組，每個濃度有6個復孔。藥物處理24 h后，棄掉培養(yǎng)基，換含有10%CCK-8的新鮮培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，采用多功能酶標儀檢測波長在490 nm處的吸光度值。用Origin 8.0軟件作圖，計算IC50值。

1.2.2 線粒體染色取對數(shù)增長期的HepG2細胞以100 000/1.5 mL細胞濃度接種于35 mm confocal培養(yǎng)皿中，于細胞培養(yǎng)箱中孵育，待細胞長到70%～80%細胞豐度時，加入2.5 μg/mL Mor-platin處理細胞2 h，然后與50 nM線粒體綠色熒光探針MTG共同孵育30 min，在掃描型激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體染色情況以及和藥物Mor-platin的共定位現(xiàn)象。

1.2.3 透射電子顯微鏡（TEM）HepG2細胞以1 500 000/10 mL細胞濃度接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，于細胞培養(yǎng)箱中孵育過夜，加入5 μg/mL Mor-pla?tin處理細胞24 h。24 h后，收集細胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗一遍細胞，離心，取細胞沉淀，Trump's固定液在4℃中固定細胞過夜，0.1 M PBS洗一遍細胞，鋨酸固定1 h，50%、70%、90%、100%乙醇和丙酮脫水，樹脂包埋，切片（70 nm）置于銅網(wǎng)上，檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色，染色后的樣品在透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.4 細胞凋亡實驗Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒被用來檢測Mor-platin導致的細胞凋亡。選取對數(shù)增長期的HepG2細胞，以50 000/0.5 mL的細胞濃度接種于24孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育過夜，加入不同濃度梯度的Mor-platin（0～40 μg/mL），每個濃度重復3次。藥物處理細胞24 h后，將上清液吸出至5 mL離心管中，PBS洗一遍以除去培養(yǎng)基，加入300 μL胰酶細胞消化液消化細胞，注意避免過度消化，加入600 μL培養(yǎng)基終止消化，將細胞轉移至之前的5 mL離心管中，1 000 g離心5 min，小心吸除上清，殘留約50 μL的培養(yǎng)基，以避免吸走細胞。用預冷的PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)，取5～10萬個細胞，1 000 g離心5 min，小心吸除上清，殘留約50 μL培養(yǎng)基，加入195 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，混勻，最后加入10 μL碘化丙啶（PI）染色液，混勻，室溫避光孵育30 min，孵育過程中重懸細胞3次以增加染色效果，立即上流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 三維腫瘤細胞球侵襲實驗用PBS配制1%瓊脂糖溶液，用高壓滅菌鍋滅菌，滅菌后應立即放入60℃的水浴鍋中，以避免凝固。吸取50 μL瓊脂糖溶液加入96孔板（RNase&DNase free）中，待瓊脂糖凝固后，將200 μL H1975細胞懸液（5×103）接種到用瓊脂糖處理過的96孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育2～3 d使細胞成球。待細胞成球后，加入Mor-platin（0、5、10 μg/mL）處理24 h，采用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

2 結果

2.1 Mor-platin的抗細胞增殖效應

采用細胞毒性實驗CCK-8法，比較Mor-platin和cisplatin對人肝癌細胞HepG2的細胞增殖的影響。結果顯示（圖1），在兩種藥物作用下，細胞存活率隨著藥物劑量的增加而降低，具有劑量依賴性。Morplatin的半數(shù)抑制濃度為10.20 μg/mL，而cisplatin的半數(shù)抑制濃度是21.53 μg/mL，是Mor-platin的2倍多。此研究結果表明，藥物濃度相同時，Mor-paltin會導致更多的細胞死亡，Mor-platin相比于cisplatin，具有更好的抗癌效果。

圖1 Mor-platin和cisplatin對HepG2細胞的毒性實驗Figure 1Cell viability of HepG2 cells treated with Mor-platin and cisplatin

2.2 Mor-platin線粒體靶向性

由于Mor-platin具有磷光，在激光共聚焦下顯示紅色，所以可以觀察和追蹤細胞內的Mor-platin。利用線粒體綠色熒光探針MTG將線粒體染成綠色，觀察綠色的線粒體是否會與紅色的Mor-platin重疊，以此來研究Mor-platin是否會靶向到線粒體中。由圖2激光共聚焦圖片得知，紅色的Mor-platin與綠色的線粒體有重疊，重疊的部分顯示黃色，pearson's相關系數(shù)超過0.8，說明Mor-platin能夠靶向到線粒體中，與線粒體共定位。

圖2 Mor-platin和MTG的激光共聚焦圖片F(xiàn)igure 2Laser confocal images of cells incubated with Mor-platin and Mito-Tracker green

2.3 Mor-platin使線粒體形態(tài)發(fā)生變化

完整的線粒體形態(tài)是腫瘤細胞能量產生和生物合成所必需。Mor-platin靶向到線粒體后，是否會引起線粒體形態(tài)的變化，進而影響線粒體的功能。因此，運用電子顯微鏡觀察Mor-platin對線粒體形態(tài)的影響。電子顯微鏡圖片（圖3）顯示，無藥物的對照組細胞的線粒體形態(tài)正常，具有完整的內外雙層膜結構，線粒體嵴很多，而加入Mor-platin后細胞線粒體膜結構不完整，嵴不清晰或者消失，線粒體中出現(xiàn)大片空白區(qū)域，說明線粒體膜破壞后可能會導致線粒體中的蛋白丟失。

圖3 有無Mor-platin處理后細胞線粒體的TEM圖片F(xiàn)igure 3TEM micrographs of untreated cells as well as cells treated with 5.0 μg/mL Mor-platin for 24 h

2.4 Mor-platin對細胞凋亡的影響

Mor-platin對人肝癌細胞HepG2凋亡的影響用Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒進行檢測。研究結果顯示，2.5、5和10 μg/mL Mor-platin導致的細胞凋亡數(shù)較少，與對照組相差較小，而20 μg/mL Morplatin能導致20%以上細胞凋亡，40 μg/mL Mor-platin能引起80%的細胞凋亡（圖4）。

2.5 Mor-platin抑制三維腫瘤細胞球侵襲

前期研究發(fā)現(xiàn)Mor-platin能夠抑制人肺癌細胞H1975細胞遷移，使用細胞劃痕實驗和Transwell實驗加以驗證，但是上述兩種實驗是在二維層面進行細胞遷移研究，在三維層面細胞的遷移行為也許會表現(xiàn)出不一樣的效果［12-13］。因為動物細胞生長在三維環(huán)境中，有研究表明二維細胞模型不能夠很好地模擬體內微環(huán)境［14-15］。三維細胞球模型由于可以調節(jié)細胞-細胞和細胞-細胞質間的相互作用［16］，因此在腫瘤研究中，三維細胞球模型是體外測量早期腫瘤行為和毒性物質對腫瘤影響的金標準。本研究建立三維腫瘤細胞球模型并從細胞球面積的大小來估計細胞侵襲能力。研究結果顯示，Mor-platin處理細胞24 h后，腫瘤細胞球的面積比沒有加藥物的對照組細胞球面積小，且隨著劑量增加，腫瘤細胞球面積依次減小，說明Mor-platin能夠抑制三維腫瘤細胞球侵襲（圖5）。

圖4 Mor-platin對HepG2細胞凋亡的影響Figure 4Cell apoptosis of HepG2 cells by Mor-platin

圖5 Mor-platin對三維細胞球的影響（100μm）Figure 5Mor-platin affected 3D cell's growth(100μm)

3 討論

本研究結果顯示，Mor-platin對HepG2的半數(shù)抑制濃度比cisplatin低，說明Mor-platin比cisplatin具有更好的抗癌效果。線粒體是真核細胞內有氧代謝的主要場所，為細胞的活動提供能量，在內源性細胞凋亡中也發(fā)揮著重要作用。自從Otto Warburg在上個世紀首次發(fā)現(xiàn)Warburg effect效應（即大多數(shù)腫瘤細胞通過產能率相對低的糖酵解為自身供能，而健康細胞是依靠線粒體氧化糖類分子釋放能量）后，正常細胞和腫瘤細胞線粒體之間的顯著差異陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)［7，17-18］。由于線粒體密切參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，因此線粒體靶向性的抗腫瘤藥物成為研究熱點，并且對這些藥物的抗癌機制也進行了研究［19-21］。本研究新合成的Mor-platin能夠靶向到細胞線粒體中，從而在線粒體中富集。隨之，使細胞線粒體形態(tài)發(fā)生變化，導致細胞凋亡。除此之外還發(fā)現(xiàn)，Mor-platin能夠抑制三維腫瘤細胞球生長，從而驗證Mor-platin能夠抑制細胞侵襲，與之前的研究結果相符［10］。前期研究表明，Mor-platin對人肺癌細胞和人肝癌細胞具有相同的效果，并且從機制進行了解釋，Mor-platin能夠靶向細胞線粒體，造成線粒體損傷，最終導致細胞凋亡，本研究從腫瘤三維細胞球模型進一步驗證Mor-platin可以抑制細胞侵襲，由此認為Mor-platin的作用可能為新的抗腫瘤藥物研究提供思路。

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（2017-02-08收稿）

（2017-06-23修回）

（編輯：鄭莉 校對：周曉穎）

A new mitochondria-targeted platinum complex Mor-platin inhibits HepG2 cell proliferation and cell invasion

Shuqun LI1,Qian CHEN1,Weijia LIAO1,Jun WENG1,Qingrong MO1,Jingling Li2,Yaqun YU1

Yaqun YU;E-mail:Yuyaqun0222@sina.com
1Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery,Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541000,China;2Department of Medical Record Statistics Room,Affiliated Children's Hospital of Soochow University,Suzhou 215000,China

Objective:To investigate the effects of Mor-platin,a novel mitochondrial platinum complex,on proliferation and migration of human hepatoma carcinoma HepG2 cells.Methods:Cell counting kit-8(CCK-8)assay was used to analyze cell proliferation of Morplatin and classic anticancer drugs,particularly cisplatin,in HepG2 cells.A laser confocal microscope was used to observe whether Mor-platin can target mitochondria.The morphological changes in cellular mitochondria after treatment with Mor-platin were observed on a transmission electron microscope.Cell apoptosis was measured by flow cytometry,and cell invasion was evaluated by three-dimensional tumor spheroid model.Results:Mor-platin can inhibit cell proliferation and is dose dependent.The half inhibitory concentration(IC50)of Mor-platin is lower than that of cisplatin.Laser confocal images showed that Mor-platin can target cell mitochondria and enrich cell mitochondria.Transmission electron microscopy images showed that cell mitochondrial morphology changed after Mor-platin treatment.Furthermore,cell mitochondrial membrane is incomplete and mitochondrial cristae are reduced.Cell apoptosis caused by Mor-platin is dose dependent.The three-dimensional tumor spheroid model showed that the cell areas of the group subjected to Mor-platin treatment are smaller than those of the control group.Conclusion:Mor-platin can target cell mitochondria,change the cell mitochondrial morphology,inhibit cell proliferation,and thus promote cell apoptosis.It also showed better anticancer effects than cisplatin.Furthermore,Mor-platin can inhibit three-dimensional tumor spheroid invasion.These results suggest that Mor-platin is a potential antitumor drug.

cisplatin,mitochondria,anticancer drugs,human hepatoma carcinoma cells,cell proliferation,cell apoptosis,cell invasion

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.15.136

①桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽胰外科（廣西壯族自治區(qū)桂林市541000）；②蘇州大學附屬兒童醫(yī)院病案統(tǒng)計室

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81372163）和廣西省自然科學基金項目（編號：2015GXNSFAA139111）資助

喻亞群Yuyaqun0222@sina.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81372163)and the Natural Science Foundation of Guangxi(No.2015GXNSFAA139111)

李淑群專業(yè)方向為肝癌的診治。

E-mail：lishuqun2008@126.com