潘傳波，郭劍華，郭 亮，李 卿，馬善治，劉渝松，漆 偉，劉才英，葉承莉，唐 彥

（1.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院，重慶 400010；2.重慶市中藥研究院，重慶 400020）

四黃定痛貼劑藥效學研究

潘傳波1，郭劍華1，郭 亮1，李 卿2，馬善治1，劉渝松1，漆 偉1，劉才英1，葉承莉1，唐 彥1

（1.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院，重慶 400010；2.重慶市中藥研究院，重慶 400020）

目的：觀察四黃定痛貼劑的藥效學作用。方法：給大鼠涂抹四黃定痛貼劑（高、中、低3種劑量），以大鼠急性痛風性關節(jié)炎和急性血瘀為模型，觀察其藥理作用。結果：四黃定痛貼劑高劑量組對大鼠急性痛風性關節(jié)炎造模后2h和6h的步態(tài)評分明顯降低、足腫脹周徑有明顯減小作用、腫脹率有明顯抑制作用、明顯降低大鼠急性痛風性關節(jié)炎關節(jié)腔的中性粒細胞、IL-1β、TNF-α和MPO的含量；組織病理學檢查結果顯示：模型組大鼠踝關節(jié)滑膜細胞增生，血管翳形成，周圍結締組織水腫、變性壞死伴急慢性炎細胞浸潤。四黃定痛貼劑高、中劑量組對造模處踝關節(jié)組織病理變化有一定改善和修復趨勢。四黃定痛貼劑高劑量組能明顯降低大鼠的全血黏度（高切、低切）、高、中、低切還原黏度和紅細胞剛性指數(shù)。結論：四黃定痛貼劑對急性炎癥有明顯的抗炎作用，同時還具有一定的活血化瘀作用。

四黃定痛貼劑；大鼠；藥效學研究

四黃定痛貼劑源于治療急性痛風性關節(jié)炎的經驗方四黃定痛湯，通過優(yōu)化處方和劑型改良為外用中藥貼劑，功效散寒祛濕、通絡止痛。本研究擬通過動物試驗觀察四黃定痛貼劑抗炎鎮(zhèn)痛和活血化瘀的藥效學作用，為臨床用藥提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

動物：SD大鼠，SPF級，全雄，180～220g，由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（渝）2012-0006，動物合格證號0001954。SD大鼠，SPF級，雌雄兼用，200～260g，由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供，實驗動物生產許可證號SCXK（渝）2012-0006，動物合格證號0002236。

試劑及耗材：0.9%氯化鈉注射液，太極集團西南藥業(yè)股份有限公司，批號16041016；戊巴比妥鈉，SIGMA公司，批號908M031；鹽酸腎上腺素注射液，重慶迪康長江制藥有限公司，批號160801；大鼠白介素1β（IL-1β）、大鼠髓過氧化物酶（MPO）、大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫分析試劑盒Shanghai jijin chemistry technology，批號E201609014A；HCT，濟南希森美康醫(yī)用電子有限公司，批號G5365。EDTA一次性真空采血管，河北鑫樂醫(yī)療器械科技股份有限公司生產，批號16109002；肝素鈉一次性真空采血管，河北鑫樂醫(yī)療器械科技股份有限公司生產，批號16078802。

主要實驗儀器與設備：UW-4200S電子天平，島津國際貿易有限公司；Allegra X-12離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；FASCO-3010B全自動血液流變快測儀，重慶大學維多生物工程研究所；XT-2000i全自動動物血液分析儀，日本希森美康株式會社；ST-360酶標儀，上?？迫A試驗系統(tǒng)有限公司；PV-200足趾容積測量儀，成都泰盟科技有限公司；DNP-98021A電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學儀器有限公司；RM2235輪轉切片機，德國琜卡儀器有限公司；ASP300S高級智能脫水機，德國徠卡儀器有限公司；TK-218型恒溫攤片烤片機，湖北泰維醫(yī)療科技有限責任公司；TB-718型生物組織自動包埋機，湖北泰維醫(yī)療科技有限責任公司；TR-180生物組織全自動染色機，湖北泰維醫(yī)療科技有限公司；Mias2000圖象處理系統(tǒng)，四川大學圖象處理國家研究所。

供試品與陽性對照藥品：四黃定痛貼劑，由重慶市中藥研究院藥化研究所提供，1mL相當于4.4g藥材，批號160601。雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（扶他林），北京諾華制藥有限公司生產，批號VP0345。

2 實驗方法與結果

2.1 對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠的影響

2.1.1 實驗方法［1-5］

SD大鼠60只，全雄，待檢疫及適應飼養(yǎng)期結束后，采用隨機區(qū)組法（以體質量為主要關鍵字、隨機數(shù)字為次要關鍵字）分為6組，每組10只，即溶媒對照組（純化水）、模型組（純化水）、四黃定痛貼劑高、中、低劑量組（生藥76.0、38.0、19.0mg/cm2）和陽性對照組（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑0.5mg/cm2）。各組于給藥前一天備皮，用6%的硫化鈉脫毛劑將動物背部脊柱兩側毛發(fā)脫去，去毛范圍約為40cm2（4cm×10cm）。將各樣品均勻涂抹于整個脫毛區(qū)，在上面用二層滅菌紗布覆蓋（溶媒對照品用滅菌紗布吸附后貼敷與脫毛區(qū)），再用膠布固定，6h后，去除覆蓋物，用溫水去除殘留的各樣品。給藥體積為2.0mL/只，1日1次，連續(xù)9天。

第7天測定動物右側踝關節(jié)周徑和容積，然后給藥后0.5h造模（正常組除外）：模型組、陽性對照組、四黃定痛貼劑高、中、低劑量組，分別用5號注射針在大鼠右側踝關節(jié)后側插入至跟腱內側，將0.2mL尿酸鈉溶液注入到關節(jié)腔內，其中空白組將0.2mL生理鹽水注入到關節(jié)腔內，測定造模后分別于藥后2h、6h、12h、24h、48h測定右側踝關節(jié)周徑和容積，計算腫脹率、步態(tài)進行分級評分，評分標準見表4。造模48h后麻醉處死，隨后消毒右側踝關節(jié)部位，立即以銳利刀片切開關節(jié)囊，用1mL的無菌生理鹽水沖洗大鼠關節(jié)腔，涂片并固定后鏡下計數(shù)白細胞，并用酶聯(lián)免疫法測定關節(jié)沖洗液中IL-1β、TNF-α、MPO的含量；最后取踝關節(jié)組織，10%甲醛溶液固定，HE染色。對關節(jié)滑膜組織進行組織形態(tài)檢查，評分標準見表2。

表1 大鼠步態(tài)分級評分標準

表2 關節(jié)滑膜組織炎癥程度分級標準

2.1.2 結果

對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠步態(tài)的影響。與溶媒對照組比較，模型組大鼠造模后2、6、12和24h的步態(tài)評分明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，四黃定痛貼劑生藥76.0 mg/cm2組在造模后2h和6h的大鼠步態(tài)評分明顯降低（P＜0.05），提示四黃定痛貼劑對造模后的急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠的步態(tài)有明顯的改善作用。結果見表3。

表3 對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠步態(tài)的影響 （±s）

表3 對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠步態(tài)的影響 （±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n 劑量（mg生藥/cm2）造模后2h（mm）造模后6h（mm）造模后12h（mm）造模后24h（mm）造模后48h（mm）溶媒對照組 10 / 0.20±0.42**0.10±0.32**0.00±0.00**0.00±0.00**0.00±0.00模型組 10 / 2.70±0.48 2.40±0.70 1.50±0.71 1.30±0.67 0.70±0.82陽性對照組 10 0.5 1.60±0.52**1.20±0.92**0.50±0.53**0.50±0.71*0.10±0.32高劑量組 10 76.0 2.00±0.47*1.50±0.71*0.90±0.57 0.70±0.48 0.20±0.42中劑量組 10 38.0 2.30±0.67 1.80±0.79 1.30±0.82 1.00±0.82 0.50±0.97低劑量組 10 19.0 2.90±0.32 2.30±0.48 1.50±0.71 1.20±0.42 0.70±0.48

對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠足周徑的影響。與溶媒對照組比較，模型組大鼠造模后2、6、12、24和48h的足周徑明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，四黃定痛貼劑生藥76.0 mg/cm2組在造模后2h和6h的大鼠足周徑明顯降低（P＜0.05），提示四黃定痛貼劑對造模后的急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠足腫脹有明顯的改善作用。見表4。

表4 對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠足周徑的影響 （±s）

表4 對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠足周徑的影響 （±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n 劑量（mg生藥/cm2） 造模后2h（mm） 造模后6h（mm） 造模后12h（mm） 造模后24h（mm） 造模后48h（mm）溶媒對照組 10 / 3.74±0.26**3.51±0.16**3.41±0.12**3.38±0.12**3.35±0.11**模型組 10 / 7.97±0.59 8.34±0.57 3.95±0.21 3.77±0.15 3.62±0.15陽性對照組 10 0.5 6.92±0.64**7.88±0.42 3.49±0.25**3.72±0.31 3.41±0.23高劑量組 10 76.0 7.42±0.44*7.98±0.68*3.70±0.23 3.45±0.14 3.39±0.15中劑量組 10 38.0 7.94±0.27 8.14±0.50 3.97±0.14 3.70±0.22 3.61±0.17低劑量組 10 19.0 8.24±2.65 8.74±2.92 4.18±1.23 3.94±1.16 3.70±1.12

對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠足腫脹的影響。與溶媒對照組比較，模型組大鼠造模后2、6、12、24和48h的足腫脹率明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，四黃定痛貼劑生藥76.0 mg/cm2組在造模后2和6h的大鼠腫脹率明顯降低（P＜0.05），提示四黃定痛貼劑對造模后的急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠足腫脹有明顯的抑制作用。見表5。

表5 對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠足腫脹的影響 （±s）

表5 對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠足腫脹的影響 （±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n 劑量（mg生藥/cm2） 造模后2h（%） 造模后6h（%） 造模后12h（%） 造模后24h（%） 造模后48h（%）溶媒對照組 10 / 11.27±7.48**10.15±7.02**8.30±5.47**5.36±5.85**0.75±6.06**模型組 10 / 28.62±7.85 36.67±8.92 21.94±7.19 16.02±5.66 8.15±3.37陽性對照組 10 0.5 15.44±5.54**17.16±5.36**13.40±4.96*9.32±5.15*4.82±7.30高劑量組 10 76.0 19.08±7.96*22.01±9.37**15.84±8.61 11.47±6.94 4.28±5.69中劑量組 10 38.0 29.64±10.77 34.76±12.34 19.62±9.41 15.94±7.59 7.30±4.00低劑量組 10 19.0 28.06±5.12 37.89±3.13 24.88±5.60 18.30±5.66 9.87±5.13

對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠關節(jié)腔中性粒細胞、IL-1β、TNF-α及MPO的影響。與溶媒對照組比較，模型組大鼠關節(jié)腔中性粒細胞、IL-1β、TNF-α、MPO含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，四黃定痛貼劑生藥76.0mg/cm2組能明顯降低大鼠急性痛風性關節(jié)炎關節(jié)腔的中性粒細胞、IL-1β、TNF-α、MPO的含量（P＜0.05）；四黃定痛貼劑38.0mg生藥/cm2組亦能降低IL-1β、TNF-α的含量（P＜0.05）。提示四黃定痛貼劑對造模后的急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠踝關節(jié)腔中的炎性介質和過氧化物等有明顯的抑制作用。見表6。

表6 對關節(jié)腔中性粒細胞、IL-1β、TNF-α及MPO的影響 （±s）

表6 對關節(jié)腔中性粒細胞、IL-1β、TNF-α及MPO的影響 （±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n 劑量（mg生藥/cm2） 中心粒細胞（個/ mm2） IL-1β（pg/mL） TNF-α（pg/mL） MPO（pg/mL）溶媒對照組 10 / 18.9±5.9**35.4±3.1**374.1±38.2**643.5±61.4**模型組 10 / 390.0±86.8 56.1±6.3 648.3±63.4 1057.3±112.8陽性對照組 10 0.5 285.5±47.4**36.7±4.8**431.6±17.7**799.5±47.0**高劑量組 10 76.0 296.7±47.3*39.7±5.4**515.0±22.8**882.5±62.8**中劑量組 10 38.0 320.7±79.0 43.6±5.2**570.4±33.7*945.6±53.7低劑量組 10 19.0 356.4±69.0 54.5±7.9 640.8±36.9 1180.2±49.9

對急性痛風性關節(jié)炎模型大鼠關節(jié)滑膜組織病理學的影響。與模型組比較，溶媒對照組與模型組踝關節(jié)病理表現(xiàn)有顯著性差異，表明模型組踝關節(jié)組織有明顯的病理變化發(fā)生，表現(xiàn)為造模處踝關節(jié)滑膜細胞增生，血管翳形成，周圍結締組織水腫、變性壞死伴急慢性炎細胞浸潤。四黃定痛貼劑生藥76.0、38.0、19.0mg/cm2組與模型組比較造模處踝關節(jié)組織病理表現(xiàn)未見顯著性差異，但四黃定痛貼劑生藥76.0、38.0mg/cm2組對造模處踝關節(jié)組織病理變化有一定改善和修復趨勢。

2.2 對急性血瘀模型大鼠血液流變學指標的影響

2.2.1 實驗方法［6-7］

SD大鼠60只，雌雄各30只，待檢疫及適應飼養(yǎng)期結束后，隨機分為6組，每組10只，即溶媒對照組（純化水）、模型組（純化水）、四黃定痛貼劑高、中、低劑量組（生藥16.0、8.0、4.0mg/cm2）和陽性對照組（雙氯芬酸二乙胺乳膠劑0.5mg/cm2）。各組于給藥前一天備皮，用6%的硫化鈉脫毛劑將動物背部脊柱兩側毛發(fā)脫去，去毛范圍約為40cm2（4cm×10cm）。將各樣品均勻涂抹于整個脫毛區(qū)，在上面用二層滅菌紗布覆蓋（溶媒對照品用滅菌紗布吸附后貼敷與脫毛區(qū)），再用膠布固定，6h后，去除覆蓋物，用溫水去除殘留的各樣品。給藥體積為2.0mL，1日1次，連續(xù)7天。

末次給藥后1h，除溶媒對照組外，其余各組均按0.08mL/100g皮下注射0.1%的鹽酸腎上腺素注射液，2h后將動物置于4℃冰水中浸泡5min，于首次注射后4h再次給予同等劑量相同途徑的鹽酸腎上腺素注射液，禁食不禁水18h。次日取血測定紅細胞壓積（HCT），再分別用1%肝素抗凝的試管采血，肝素抗凝血測定全血黏度，再將血離心，測定血漿黏度。

2.2.2 結果

與溶媒對照組比較，模型組大鼠全血黏度，血漿黏度，高、中、低切還原黏度和紅細胞剛性指數(shù)均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，四黃定痛貼劑生藥76.0mg/cm2組能明顯降低大鼠的全血黏度（高切、低切）、高、中、低切還原黏度和紅細胞剛性指數(shù)（P＜0.05）；生藥38.0mg/cm2組亦明顯降低大鼠的高切還原黏度和低切還原黏度（P＜0.01）。提示四黃定痛貼劑對大鼠急性血瘀模型有一定的活血化瘀作用。見表7。

表7 對急性血瘀模型大鼠血液流變學指標的影響 （±s）

表7 對急性血瘀模型大鼠血液流變學指標的影響 （±s）

全血黏度 血漿黏度（mpas.s）200/s 30/s 3/s溶媒對照組 10 / 5.39±0.89**6.56±1.07**12.33±1.44**0.96±0.10*模型組 10 / 7.42±1.09 8.93±1.22 15.20±1.22 1.03±0.05陽性對照組 10 0.5 5.79±0.79**7.07±0.95**13.19±1.28**1.03±0.14高劑量組 10 76.0 6.27±0.61*7.65±0.61 13.37±0.97**0.96±0.11中劑量組 10 38.0 6.49±0.79 7.85±0.82 14.08±0.99 1.02±0.04低劑量組 10 19.0 7.90±1.33 9.02±1.70 14.05±3.15 1.03±0.06組別 n 劑量（mg生藥/cm2）

續(xù)表7

3 討 論

痛風是由于嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄障礙所導致的一種異質性疾病，其臨床特點是高尿酸血癥、痛風性急性關節(jié)炎反復發(fā)作、痛風石沉積、特征性慢性關節(jié)炎和關節(jié)畸形，常累及腎引起慢性間質性腎炎和腎尿酸結石形成。

四黃定痛貼劑的功能主治為散寒祛濕、通絡止痛，臨床用于治療急性痛風性關節(jié)炎。藥效學主要有以下兩個方面。

抗炎作用。四黃定痛貼劑生藥76.0mg/cm2組對大鼠急性痛風性關節(jié)炎造模后2h和6h的步態(tài)評分明顯降低，對大鼠急性痛風性關節(jié)炎造模后2h和6h足腫脹的周徑和腫脹率有明顯降低作用，明顯降低大鼠急性痛風性關節(jié)炎關節(jié)腔的中性粒細胞、IL-1β、TNF-α和MPO的含量；生藥38.0mg/cm2組能降低IL-1β、TNF-α的含量。組織病理學檢查結果顯示生藥76.0、38.0mg/cm2組對造模處踝關節(jié)組織病理變化有一定改善和修復趨勢。提示四黃定痛貼劑對尿酸鈉致大鼠急性痛風性關節(jié)炎有明顯抗炎作用。

活血化瘀作用。四黃定痛貼劑生藥76.0mg/cm2組能明顯降低大鼠的全血黏度（高切、低切）、高、中、低切還原黏度和紅細胞剛性指數(shù)，生藥38.0mg/cm2組亦明顯降低大鼠的高切還原黏度和低切還原黏度。提示四黃定痛貼劑對大鼠急性血瘀模型有一定的活血化瘀作用。

研究結果表明，四黃定痛貼劑對急性炎癥有明顯的抗炎作用，同時還具有一定活血化瘀作用。

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Objective：To observe pharmacodynamic effect of Sihuang Dingtong Patch. Method: Taking acute gouty arthritis and acute blood stasis of rats as the models, we smear Sihuang Dingtong Patch for rats and observe its pharmacological action. Result: The crude drug of 76.0mg /cm2 Sihuang Dingtong Patch decreased gait score significantly, reduced paw swelling perimeter significantly, had obvious inhibition on swelling rate and decreased the content of neutrophil, IL-1β, TNF-α and MPO in articular cavity of acute gouty arthritis rats at the time point of 2h and 6h after acute gouty arthritis rat models were established. Histopathology examination result showed that synovial cells hyperplasia, pannus formation, peripheral connective tissue edema, degeneration and necrosis companied with acute and chronic inflammatory cell infiltration in ankle joint of rats in model group. The crude drug of 76.0mg /cm2and 38.0mg / cm2Sihuang Dingtong Patch had certain improving and repairing development trend in histopathological changes of ankle joint at the site of model establishment. The crude drug of 76.0mg /cm2Sihuang Dingtong Patch could decrease whole blood viscosity, including whole high blood viscosity and whole low blood viscosity, high shear relative reduced viscosity, middle shear relative reduced viscosity, low shear relative reduced viscosity and erythrocyte rigidity index. Conculsion: Sihuang Dingtong Patch has obvious anti-inflammatory effect on acute inflammation as well as activating blood and resolving blood stasis effect.

Sihuang Dingtong Patch；Rat；Pharmacodynamic study

R285.9

B

1004-2814（2017）07-0744-04

2017-04-19