董菲菲，張永杰，穆航帆，張 洪

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物工程研究所,河南開(kāi)封 475004)

Halobacteriumsalinarium5 L發(fā)酵罐中產(chǎn)細(xì)菌視紫紅質(zhì)(BR)發(fā)酵條件優(yōu)化

董菲菲，張永杰，穆航帆，張 洪*

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物工程研究所,河南開(kāi)封 475004)

優(yōu)化鹽沼鹽桿菌(Halobacteriumsalinarium)在5 L發(fā)酵罐中的生物量及細(xì)菌視紫紅質(zhì)含量的發(fā)酵條件,為該菌株的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察溫度、pH、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和不同流速的玉米漿對(duì)鹽沼鹽桿菌的影響。優(yōu)化后發(fā)酵條件為:溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速250 r/min,通氣量1.3 vvm,pH在發(fā)酵的過(guò)程中不用酸液和堿液調(diào)節(jié),補(bǔ)加玉米漿的流速為0.2 mL/min。在此條件下,菌體的生物量(用OD600表示)達(dá)到4.531,細(xì)菌視紫紅質(zhì)的含量達(dá)到90.86 mg/L,與未優(yōu)化的條件相比分別提高了43.8%、36%。

細(xì)菌視紫紅質(zhì),培養(yǎng)條件,鹽沼鹽桿菌

鹽沼鹽桿菌(Halobacteriumsalinarium)生長(zhǎng)于鹽湖、曬鹽場(chǎng)、海洋和鹽漬品等環(huán)境中[1-3],它們需要NaCl的濃度為20%～30%[4-5]。鹽沼鹽桿菌屬于嗜鹽菌,嗜鹽菌常被用于細(xì)菌視紫紅質(zhì)的生產(chǎn)[6]。

細(xì)菌視紫紅質(zhì)(bacteriorhodopsin,BR)簡(jiǎn)稱(chēng)BR,每個(gè)BR均是一個(gè)光驅(qū)的質(zhì)子泵,被光子激發(fā)之后,能夠?qū)⒐饽苻D(zhuǎn)化為化學(xué)能[7]。BR的這種性能被應(yīng)用在光學(xué)設(shè)備、電子設(shè)備、化學(xué)傳感、過(guò)濾裝置中[8-9]。BR應(yīng)用廣泛,包括視網(wǎng)膜退化引起的失明、眼科疾病、疫苗療法、惡性腫瘤以及其他疾病的治療,除此之外還有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、藥物的緩釋、傳遞和釋放、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡或死亡[10-12]。

近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)BR的應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究,并取得了不少成果[13-14]。但對(duì)利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)BR的研究較少。發(fā)酵條件的優(yōu)化對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖及其代謝產(chǎn)物的合成起著重要的作用[15-18]。研究報(bào)道在一些培養(yǎng)條件下可以誘導(dǎo)紫膜的合成,使得細(xì)胞膜上的紫膜碎片的覆蓋率超過(guò)50%[19]。

本文在搖瓶實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上,得到最佳培養(yǎng)基配方后,進(jìn)一步探究了溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量、pH及補(bǔ)料流速對(duì)H.salinarium在5 L發(fā)酵罐中菌體生物量及BR含量的影響,為該菌進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株:鹽沼鹽桿菌(H.salinarium)CGMCC1.2368,系產(chǎn)紫膜菌株 中國(guó)微生物菌種保藏中心。酸水解酪蛋白、酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;MgSO4·7H2O、KCl 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;NaCl 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸三鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;NaOH 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;NH4OH 中平能化集團(tuán)開(kāi)封東大化工有限公司試劑廠;DNA酶 上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司。實(shí)驗(yàn)室所用試劑均為分析純。

5 L發(fā)酵罐 上海寶興生物設(shè)備工程有限公司;752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器ZWY-2102 上海智城分析儀器有限公司;SX-500全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY公司;超凈工作臺(tái)SW-CJ-2FD 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(g/L):酸水解酪蛋白6 g/L,酵母浸粉10 g/L,MgSO4·7H2O 20 g/L,NaCl 200 g/L,瓊脂20 g/L,pH7.0;種子培養(yǎng)基(g/L):酸水解酪蛋白6 g/L,酵母浸粉10 g/L,MgSO4·7H2O 20 g/L,NaCl 200 g/L,pH7.0;初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酸水解酪蛋白9 g/L,酵母浸粉15.156 g/L,MgSO4·7H2O 26.718 g/L,KCl 3.186 g/L,檸檬酸三鈉5 g/L,(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 0.07 g/L,MnSO40.19 g/L,NaCl 200 g/L,pH7.0;補(bǔ)料培養(yǎng)基:4 g/L玉米漿200 mL。

1.2.2 菌體裂解液的配制 按照參考文獻(xiàn)[20]配制裂解液,取90 mL去離子水,4 mol 的NaOH 5 mL,4 mol的NH4OH 5 mL,加入0.1 mg脫氧核糖核酸酶,混合均勻,置于4 ℃保存,備用。

1.2.3 發(fā)酵液中菌體生物量的檢測(cè) 將每次取的發(fā)酵液8000 r/min離心10 min獲得上清,作為對(duì)照組,用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)發(fā)酵液的生物量,菌體的生物量用OD600表示。

1.2.5 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件

1.2.5.1 初始發(fā)酵條件 5 L發(fā)酵罐按3 L的裝液量將發(fā)酵培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中,在121 ℃的條件下滅菌20 min,待培養(yǎng)基冷卻到發(fā)酵設(shè)置溫度,且通氣量及轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后,按照10%的接種量將活化好的種子液接入發(fā)酵罐中,未優(yōu)化前培養(yǎng)溫度37 ℃,攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min,通氧量1.2 vvm,pH為7.0,發(fā)酵過(guò)程中不用酸液和堿液進(jìn)行調(diào)節(jié)。

1.2.5.2 發(fā)酵條件優(yōu)化 分別優(yōu)化發(fā)酵溫度、pH、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量,依次探究了 發(fā)酵培養(yǎng)溫度32、37、42 ℃,pH7.01～7.40、7.41～7.80、7.81～8.20及初始pH7.0(發(fā)酵過(guò)程不進(jìn)行pH控制),攪拌轉(zhuǎn)速200、250、300 r/min,通氣量1.2、1.3、1.4 vvm,及補(bǔ)料流速對(duì)H.salinarium菌株發(fā)酵過(guò)程的影響,每24 h取一次樣,檢測(cè)發(fā)酵液中菌體的生物量和BR的含量,用來(lái)確定最優(yōu)的發(fā)酵條件。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,利用origin 8.0 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵罐的初始培養(yǎng)和BR的含量

鹽沼鹽桿菌的初始培養(yǎng)使用的是未加入玉米漿的發(fā)酵培養(yǎng)基,在1.2.5的發(fā)酵條件下,鹽沼鹽桿菌的生物量和BR含量如圖1所示。

圖1 初始條件對(duì)鹽沼鹽桿菌發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.1 Effect of initial fermentation conditions on the fermentation process of H. salinarium

從圖1得出鹽沼鹽桿菌的生物量在24～144 h期間都是增大的,在發(fā)酵前48 h,菌體的生物量增加緩慢,48 h后菌體的生物量增加較大,在發(fā)酵第144 h時(shí),菌體生物量達(dá)到最大,之后菌體的生物量趨于穩(wěn)定,菌體的生物量最大是3.151。BR含量在24～144 h持續(xù)增加,在發(fā)酵144 h時(shí),BR的含量達(dá)到最大,隨后伴隨發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行BR的含量開(kāi)始逐漸下降。蛋白的含量最大為66.79 mg/L。因此確定最佳的發(fā)酵時(shí)間是144 h。Seyedkarimi[23]等人使用搖瓶培養(yǎng)鹽沼鹽桿菌,培養(yǎng)時(shí)間為12 d,菌體的生物量在第7 d達(dá)到最大值,之后菌體生長(zhǎng)進(jìn)入平穩(wěn)期,菌體的生物量最大為2.95。BR的含量在第7 d達(dá)到最大值為46 mg/L。通過(guò)與實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比得出:使用發(fā)酵罐培養(yǎng)鹽沼鹽桿菌可以使它的生物量和BR含量增多。

2.2 溫度對(duì)鹽沼鹽桿菌發(fā)酵過(guò)程的影響

溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖及代謝產(chǎn)物合成有重要的影響。本文研究了不同溫度對(duì)鹽沼鹽桿菌的生物量及合成BR含量的影響。實(shí)驗(yàn)中分別控制發(fā)酵罐溫度為32、37、42 ℃。不同溫度對(duì)鹽沼鹽桿菌的生物量和BR含量的影響如圖2所示。

圖2 溫度對(duì)鹽沼鹽桿菌發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.2 Effect of temperature on the fermentation process of H. salinarium

從圖2A得知,溫度對(duì)鹽沼鹽桿菌的生長(zhǎng)有較大的影響。當(dāng)32、37、42 ℃時(shí)菌體的生物量在24～144 h都是增加的,在144 h達(dá)到最大值,分別為2.802、3.158、2.67,之后菌體生物量幾乎不變化。當(dāng)溫度從32 ℃升高到37 ℃,隨著溫度的升高,菌體生長(zhǎng)增快,但是當(dāng)溫度為42 ℃時(shí)菌體生長(zhǎng)緩慢,這可能是由于菌體內(nèi)部沒(méi)有合成RNA[22],說(shuō)明溫度較高時(shí)不利于菌體的生長(zhǎng),通過(guò)圖2B可得,當(dāng)32、37、42 ℃時(shí)BR含量都是持續(xù)增加的,在144 h時(shí)達(dá)到最大值,BR含量分別為63.92、66.92、61.02 mg/L,之后BR含量開(kāi)始下降。發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)利于菌體的生長(zhǎng)和BR的合成,最終選定溫度為37 ℃,這個(gè)結(jié)果與其他研究者的一致[24]。

2.3 pH對(duì)鹽沼鹽桿菌發(fā)酵過(guò)程的影響

pH是決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素之一,它對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成起主要作用。為了確定pH對(duì)菌體生物量和BR含量的影響,實(shí)驗(yàn)分別探究了初始pH為7.0(在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)pH不進(jìn)行調(diào)控)及發(fā)酵過(guò)程中將pH控制在7.01～7.40、7.41～7.80、7.81～8.20范圍內(nèi),所得的結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對(duì)鹽沼鹽桿菌發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.3 Effect of pH on the fermentation process of H. salinarium

從圖3A得出,pH的變化對(duì)菌體的生物量有一定的影響,圖中CK表示初始的pH為7.0(在發(fā)酵過(guò)程不進(jìn)行pH控制),pH為7.01～7.40、7.41～7.80的菌體生物量均大于pH在7.81～8.20的菌體生物量;發(fā)酵時(shí)間為24～144 h時(shí),在設(shè)置的pH范圍內(nèi)菌體的生物量一直增加,當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為7.0(在發(fā)酵過(guò)程不進(jìn)行pH控制)時(shí),菌體的生物量在發(fā)酵的第144 h達(dá)到最大,為3.39,之后菌體的生物量幾乎不變化。從圖3B可以得到pH對(duì)視紫紅質(zhì)含量的影響,pH為7.01～7.40、7.41～7.80的BR含量均大于pH在7.81～8.20的BR含量;在發(fā)酵的第144 h時(shí)BR含量都達(dá)到最大,之后BR的含量開(kāi)始下降;當(dāng)培養(yǎng)基初始的pH為7.0(在發(fā)酵過(guò)程不進(jìn)行pH控制)時(shí)BR的含量最多,為75.54 mg/L。因此,發(fā)酵時(shí)設(shè)置初始pH為7.0(在發(fā)酵過(guò)程不進(jìn)行pH控制)。

2.4 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)鹽沼鹽桿菌發(fā)酵過(guò)程的影響

發(fā)酵過(guò)程中氧的濃度是影響發(fā)酵的又一個(gè)重要因素,高的攪拌轉(zhuǎn)速利于氧氣迅速溶解發(fā)酵液中。為了確定合適的攪拌轉(zhuǎn)速,實(shí)驗(yàn)分別考察了攪拌轉(zhuǎn)速為200、250、300 r/min時(shí),鹽沼鹽桿菌的生長(zhǎng)及BR含量如圖4所示。

圖4 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)鹽沼鹽桿菌發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.4 Effect of agitation speed on the fermentation process of H. salinarium

從圖4A得知,攪拌轉(zhuǎn)速為200、250、300 r/min菌體的生物量在發(fā)酵時(shí)間為144 h時(shí)都達(dá)到最大,之后趨于穩(wěn)定,菌體的生物量分別為3.118、3.843、3.38。當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min菌體的生物量變化較慢,隨著轉(zhuǎn)速增加菌體的生物量變大,當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到300 r/min時(shí),菌體的生物量沒(méi)有繼續(xù)增加,這說(shuō)明轉(zhuǎn)速提高,體系的剪切力隨之變大,對(duì)菌體的生長(zhǎng)不利。從圖4B得出BR的含量在144 h達(dá)到最大,之后BR的含量開(kāi)始減少。BR的含量分別為72.92、79.92和71.11 mg/L。轉(zhuǎn)速為300 r/min時(shí)BR含量的最大值比其他條件的最大值都小,原因可能是溶解氧對(duì)BR合成有較大的影響,氧含量不高的情況下有利于BR的合成,高濃度的氧抑制BR的形成[25-26]。因此,轉(zhuǎn)速的變化直接影響氧在發(fā)酵液中的傳質(zhì)效率,進(jìn)而影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成,最終選擇250 r/min為最適攪拌轉(zhuǎn)速。

2.5 通氣量對(duì)鹽沼鹽桿菌發(fā)酵過(guò)程的影響

通氣量是決定供氧的一個(gè)重要的因素,通氣量增加可以使發(fā)酵罐內(nèi)截面氣速增加,發(fā)酵液的氣含率增加,進(jìn)而增加氣-液的比表面積,這樣有利于氧的傳遞。為了確定合適的通氣量,實(shí)驗(yàn)考察的通氣量分別為1.2、1.3、1.4 vvm,鹽沼鹽桿菌的生長(zhǎng)及BR含量,如圖5所示。

圖5 通氣量對(duì)鹽沼鹽桿菌發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.5 Effect of ventilation volume on the fermentation process of H. salinarium

從圖5A得出菌體的生物量在發(fā)酵時(shí)間為144 h達(dá)到最大值,分別是3.268、3.916和3.796,在通氣量為1.2 vvm時(shí)菌體生長(zhǎng)較慢,隨著通氣量的增加菌體的生物量也增大,說(shuō)明通氣量過(guò)小,使發(fā)酵液中的氧含量不高,菌體的生長(zhǎng)受到抑制,在通氣量為1.3 vvm時(shí),菌體生長(zhǎng)旺盛,但是當(dāng)通氣量為1.4 vvm時(shí),菌體的生物量沒(méi)有繼續(xù)增大,說(shuō)明通氣量過(guò)大使氧的傳質(zhì)效率變小,從而影響菌體的生長(zhǎng)。從圖5B得出BR的含量在發(fā)酵的第144 h達(dá)到最大,之后BR的含量開(kāi)始降低。BR的含量分別為77.24、83.56和76.56 mg/L。通氣量為1.4 vvm時(shí)BR的含量都小于其他通氣量條件下的BR含量,原因可能是氧含量對(duì)BR的合成起主要的作用,低氧含量的情況下更有利于BR的形成[25-26]。因此,氧的傳遞和氧的含量直接影響菌體的生長(zhǎng)和BR的合成,溶解氧在發(fā)酵過(guò)程中是一個(gè)特別重要的限制因子。最終選擇的通氣量為1.3 vvm。

2.6 不同流速的玉米漿對(duì)鹽沼鹽桿菌發(fā)酵過(guò)程的影響

玉米漿作為一種較好的微生物生長(zhǎng)或代謝產(chǎn)物合成的促進(jìn)劑已經(jīng)廣泛用于發(fā)酵生產(chǎn)中。為了獲得最佳的補(bǔ)料流速,實(shí)驗(yàn)考察了在菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期即菌體生長(zhǎng)的第四天進(jìn)行補(bǔ)料,補(bǔ)料流速分別為0.1、0.2和0.3 mL/min時(shí),鹽沼鹽桿菌的生長(zhǎng)及BR含量,如圖6所示。以不補(bǔ)玉米漿作為對(duì)照。

圖6 不同流速的玉米漿對(duì)鹽沼鹽桿菌發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.6 Effect of corn pulp with different flow rates on the fermentation process of H. salinarium

由圖6A可知,補(bǔ)加玉米漿后菌體的生物量均增大,玉米漿流速為0.2 mL/min和沒(méi)有補(bǔ)加玉米漿的菌體的生物量在發(fā)酵的第144 h均達(dá)到最大,分別為4.531、3.916,設(shè)置玉米漿的流速為0.1 mL/min和0.3 mL/min時(shí)菌體的生物量在發(fā)酵96～120 h內(nèi)增加的幅度一致,在發(fā)酵的第168 h達(dá)到最大值,分別為4.416、4.141。BR的含量如圖6B,在發(fā)酵的第144 h達(dá)到最大值,分別為83.56、87.46、90.86、86.86 mg/L。說(shuō)明玉米漿的流速為0.2 mL/min時(shí)有利于菌體的生長(zhǎng)和BR的合成,因此在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加合適流速的物質(zhì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成有顯著的影響,最終選擇補(bǔ)加的流速為0.2 mL/min。

3 結(jié)論

目前,BR是一類(lèi)“綠色”的生物材料,它可以用于許多領(lǐng)域,研究意義重大。BR的獲取主要是借助于搖瓶的生產(chǎn),因此加強(qiáng)對(duì)BR含量的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本文在5 L發(fā)酵罐中,研究了溫度、pH、轉(zhuǎn)速、通氧量及補(bǔ)加不同流速的玉米漿對(duì)鹽沼鹽桿菌的生長(zhǎng)和BR含量的影響。在發(fā)酵的過(guò)程中菌體生物量是先增大后趨于穩(wěn)定,BR含量的變化趨勢(shì)是先增加達(dá)到最大值后開(kāi)始逐漸下降。在發(fā)酵過(guò)程中溫度過(guò)高不利于菌體的生長(zhǎng),氧含量過(guò)高抑制BR的合成。在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加玉米漿可以使菌體的生物量增加,BR的含量也隨之增多。最終確定最佳的條件是溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速為250 r/min,初始pH為7.0(在發(fā)酵過(guò)程不進(jìn)行pH控制),通氣量為1.3 vvm,補(bǔ)加玉米漿的流速為0.2 mL/min,優(yōu)化后菌體的生物量達(dá)到4.531,BR含量達(dá)到90.86 mg/L,和未優(yōu)化的條件相比分別提高43.8%、36%,本次實(shí)驗(yàn)為鹽沼鹽桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。

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Fermentation conditions optimization of producing bacteriorhodopsin byHalobacteriumsalinariumin a 5 L fermentor

DONG Fei-fei,ZHANG Yong-jie,MU Hang-fan,ZHANG Hong*

(College of Life Science,Henan University,Kaifeng 475004,China)

The technological conditions for bacteriorhodopsin and biomass by theHalobacteriumsalinariumin a 5 L fermenter were optimized,in order to provide the basis for further application of the strain. The effects of temperature,pH,agitation speed,ventilation volume and corn pulp with different flow rates on theHalobacteriumsalinariumwere investigated by single factor experiments. The optimum fermentation conditions were temperature at 37 ℃,agitation speed at 250 r/min,ventilation volume at 1.3 vvm,flow rate of corn pulp at 0.2 mL/min. pH was not regulated by acid and alkali in the fermentation process. Under these conditions,the maximum biomass was 4.531,the maximum BR yield was 90.86 mg/L,which was about respectively 43.8%、36% greater than those obtained with initial fermentation conditions.

bacteriorhodopsin;culture condition;Halobacteriumsalinarium

2017-01-19

董菲菲(1989-),女,在讀研究生,研究方向:生物物質(zhì)分離工程研究,E-mail:dff890106@126.com。

*通訊作者:張洪(1964-),男,博士,副教授,主要從事生物物質(zhì)分離及生物材料的研究,E-mail:zhanghong4601@163.com。

河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(142102210392)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)15-0164-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.15.031