陳譜，王悅，施秉銀

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西西安710061)

Graves甲亢和Graves突眼治療前后TBX21、GATA3、RORC、FOXP3 mRNA表達水平的變化

陳譜，王悅，施秉銀

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西西安710061)

目的探討Graves甲亢和Graves眼病患者不同治療方法治療前后外周血單個核細胞中Th1、Th2、Th17、Treg細胞轉(zhuǎn)錄因子TBX21、GATA3、RORC、FOXP3 mRNA表達水平的變化及其意義。方法選擇2014年9月至2016年5月就診于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌門診的新發(fā)未治的Graves甲亢患者12例，給予甲硫咪唑治療(MMI)；Graves眼病患者12例給予甲強龍沖擊治療(IVMP)，采集患者治療前后外周血，提取外周血單個核細胞RNA，通過實時熒光定量PCR檢測Th1、Th2、Th17及Treg細胞轉(zhuǎn)錄因子(TBX21、GATA3、RORC及FOXP3)mRNA的表達情況。結(jié)果Graves甲亢病組治療緩解后與治療前比較，RORC[(0.090 2±0.036 4)vs(0.292 6±0.198 6)]和FOXP3[(0.088 9±0.058 7)vs(0.148 6±0.072 6)]的表達均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；Graves眼病組治療前后相比TBX21[(0.043 7±0.026 0)vs(0.043 6±0.019 6)]、GATA3[(0.040 5±0.023 3)vs(0.043 7±0.015 8)]、RORC[(0.184 4±0.094 9)vs(0.174 5±0.066 5)]及FOXP3[(0.1324±0.075 7)vs(0.187 0±0.059 5)]差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。治療前Graves眼病組與Graves病組比較RORC[(0.184 4±0.094 9)vs(0.090 2±0.036 4)]的表達顯著高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論MMI和IVMP治療會影響T細胞的分化；各T細胞亞群轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達水平的變化與疾病的發(fā)展和治療結(jié)果密切相關(guān)。

Graves甲亢；Graves眼?。籘BX21；GATA3；RORC；FOXP3

Graves病是一種器官特異性自身免疫性疾病，臨床以彌漫性甲狀腺腫大，甲狀腺毒癥為特征。Graves眼病患者可伴有或不伴有甲狀腺功能亢進癥，Graves眼病可出現(xiàn)在甲亢前或在甲亢經(jīng)過藥物、手術(shù)、放射性碘等治療后發(fā)生[1]，但大約有80%的患者Graves眼病與Graves病幾乎同時發(fā)生[2]。Graves甲亢的治療是一個漫長的過程，且容易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率達40%[3]或甚至能達到50%～60%[4]。對于發(fā)病機制，有研究證明T淋巴細胞致敏甲狀腺素受體，合成針對這些抗原的甲狀腺素受體抗體，T細胞在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，抗原特異性T淋巴細胞接受自身抗原TSHR的刺激后分化為不同的T淋巴細胞亞群，行使不同的功能。本研究通過檢測治療前后患者外周單個核細胞中各T細胞亞群的轉(zhuǎn)錄因子的表達，旨在探討Graves甲亢及Graves眼病治療前后Th1、Th2、Tth17和Treg的變化及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2014年9月至2016年5月就診于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌門診的患者，根據(jù)臨床表現(xiàn)和血清游離三碘甲腺原氨酸(FT3)升高、血清游離甲狀腺素(FT4)升高、促甲狀腺激素(TSH)降低、促甲狀腺素受體抗體(TRAb)增高收集初發(fā)未治的Graves甲亢患者，給予此患者起始量為30 mg/d的甲硫咪唑(MMI)[5]，定期根據(jù)臨床表現(xiàn)及甲狀腺功能水平調(diào)整藥物劑量。將經(jīng)上述規(guī)律治療且停藥后3個月甲功仍處于正常的患者(12例)納入本研究，并按其治療前后分為Graves甲亢治療前組和Graves甲亢治療后組；根據(jù)國際NOSPECT標準及CAS活動狀態(tài)評估，選擇NOSPECT四級且活動度CAS≥3分的患者[6]，給予靜滴9 g為一個療程的甲基強的松龍(IVMP)和起始量30 mg/d的甲硫咪唑(MMI)，將規(guī)律治療后眶部癥狀得以緩解的患者(12例)納入研究，并按其治療前后分為Graves眼病治療前組及Graves眼病治療后組。Graves甲亢組及Graves眼病組，治療后未得到緩解的患者不計入實驗組中。所有入選對象年齡(40±13)歲，均排除近期有感染史、妊娠、合并其他免疫性疾病史。兩組性別、年齡等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法分別在治療前和治療緩解后于清晨空腹采集入組患者靜脈血3 mL，用淋巴分離液分離血液中單個核細胞后，用trizol提取RNA。嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)cDNA，進行實時定量PCR檢測TBX21、GATA3、RORC、FOXP3及內(nèi)參18S的表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進行分析，年齡、FT4以及TBX21、GATA3、RORC、FOXP3定量結(jié)果以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，組內(nèi)比較進行配對t檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗；性別比較進行χ2檢驗，均P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料兩組患者臨床資料及治療前后FT4的結(jié)果顯示給予治療后，Graves甲亢及Graves突眼兩種疾病的患者甲功均轉(zhuǎn)為正常，見表1。

2.2 兩組患者T細胞亞型轉(zhuǎn)錄因子的表達變化Graves突眼治療前與治療緩解后TBX21和GAGT3差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，RORC在治療緩解后表達低于治療前，而FOXP3在治療緩解后表達高于治療前，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2和圖1A。Graves甲亢治療緩解后TBX21、GAGT3、RORC及FOXP3四種轉(zhuǎn)錄因子均高于治療前，且RORC和FOXP3差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2和圖1B。Graves突眼治療前各T細胞亞型轉(zhuǎn)錄因子的表達均高于Graves甲亢治療前，同時Th17細胞的轉(zhuǎn)錄因子RORC的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，見表2和圖1C。

表1 兩組患者臨床資料比較

表2 Graves甲亢及突眼治療前后T細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達

表2 Graves甲亢及突眼治療前后T細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達

注：Graves甲亢治療后組與治療前組比較，aP＜0.05；治療前Graves病組與Graves突眼組比較，bP＜0.01；Graves突眼治療前與Graves甲亢治療前TBX21比較(t=1.607，P=0.127)，GAGT3(t=1.654，P=0.112)，RORC(t=3.211，P=0.006)，F(xiàn)OXP3(t=1.791，P=0.087)。

組別Graves突眼FOXP3 0.132 4±0.075 7 0.187 0±0.059 5 -1.693 0.119 0.088 9±0.058 7 0.148 6±0.072 6a-2.385 0.036時間治療前治療后例數(shù)12 12 t值P值Graves甲亢治療前治療后12 12 t/值P值TBX21 0.043 7±0.026 0 0.043 6±0.019 6 0.009 0.993 0.030 0±0.013 6 0.047 9±0.036 8 -1.481 0.167 GAGT3 0.040 5±0.023 3 0.0437±0.015 8 -0.375 0.715 0.026 5±0.017 7 0.045 1±0.026 3 -1.848 0.092 RORC 0.184 4±0.094 9 0.174 5±0.066 5 0.344 0.737 0.090 2±0.036 4b0.292 6±0.198 6a-3.100 0.010

圖1 Graves甲亢及突眼治療前后T細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達

3 討論

機體在正常情況下T淋巴細胞的各個亞群相互作用，維持著機體的正常免疫功能。當(dāng)淋巴細胞亞群中各細胞數(shù)量、比例或功能發(fā)生異常時，就有可能導(dǎo)致機體免疫功能發(fā)生紊亂并出現(xiàn)病理變化。CD4+T細胞主要分化為輔助性T細胞(Th1、Th2、Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)[7]。目前很多血清學(xué)或細胞水平的研究表明，T淋巴細胞亞群在自身免疫性疾病中都有異常改變。

Graves病是由促甲狀腺素受體抗體引起的一種自身免疫性疾病，目前有很多關(guān)于其發(fā)病及治療后緩解機制的研究，Th1、Th2、Th17及Treg的免疫水平成為近年的研究熱點。計學(xué)理等[8]、謝建平等[9]、李學(xué)軍等[10]曾研究了Graves病不同治療方法治療前后患者外周血細胞因子的變化，其結(jié)果顯示Th1和Th2細胞在外周血中的比例各研究不盡相同，而本實驗從轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平研究顯示初發(fā)未治的Graves甲亢病及Graves眼病患者的Th1和Th2細胞水平在治療前與治療緩解后均沒有明顯的變化。本實驗在Th17轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的結(jié)果為Graves病治療緩解后高于治療前，在Graves眼病治療前后Th17轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平?jīng)]有明顯變化。然而，Th17細胞作為炎癥介導(dǎo)細胞，治療后外周Th17細胞應(yīng)降低，炎癥反應(yīng)減輕，疾病得以緩解，其轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平卻高于治療前，這可能與疾病過程中的轉(zhuǎn)錄生成有關(guān)，雖然轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平高，但其生成Th17數(shù)目卻沒增或破壞過多導(dǎo)致外周Th17細胞降低。綜合以上實驗我們可以看到，雖然在Graves甲亢病及Graves眼病患者治療前后Th1、Th2和Th17細胞會有細胞、細胞因子及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子水平的變化，但是目前的研究結(jié)果也不大一致，因此我們暫且可能無法通過Th1、Th2和Th17細胞相關(guān)因素對疾病的發(fā)展與緩解做出明確的判斷，因此我們需更多的實驗進一步的探討這三種T細胞亞型與疾病是否存在一定的關(guān)聯(lián)。

楊靜等[11]關(guān)于調(diào)節(jié)性T細胞的研究結(jié)果為Graves病碘131及抗甲狀腺藥物治療后Treg在外周血中的比例較治療前均升高；查兵兵等[12]研究了Graves病碘131治療一個月后的外周血Treg細胞及Foxp3 mRNA表達水平的變化，其結(jié)果顯示兩者在治療后均有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；我們的研究結(jié)果為Treg細胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達水平在Graves病治療緩解后有所增加，但在Graves突眼治療前后變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以上研究結(jié)果均顯示，調(diào)節(jié)性T細胞及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的mRNA表達水平會在Graves甲亢治療緩解后有明顯增多，但在Graves突眼中就無此改變。這就提示我們Treg細胞的變化可能與Graves病的發(fā)展有一定的相關(guān)性。

綜上所述，Graves病的發(fā)病機制復(fù)雜，不同時期T細胞亞群的比例不同，Graves甲亢和Graves突眼雖然都會存在甲狀腺激素較高，但在發(fā)病機制方面有很大的不同。通過本實驗以及和其他眾多研究的對比與總結(jié)發(fā)現(xiàn)，目前Th1、Th2和Th17細胞或轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達水平在Graves病治療中的特征性趨勢不明顯，然而調(diào)節(jié)性T細胞和其轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達水平的變化趨勢隨著疾病的緩解明顯增多，這就意味著或許調(diào)節(jié)性T細胞及其轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達水平可以作為后續(xù)觀察Graves甲亢治療緩解的一個新思路。

[1]Orgiazzi J.Thyroid autoimmunity[J].Bull Acad Natl Med,2013,197 (1):43-59.

[2]Bartalena L,Tanda ML.Clinical practice.Graves′ophthalmopathy [J].N Engl J Med,2009,360(10):994-1001.

[3]Torring O,Tallstedt L,Wallin G,et al.Graves′hyperthyroidism:treatment with antithyroid drugs,surgery,or radioiodine—a prospective, randomized study.Thyroid Study Group[J].J Clin Endocrinol Metab,1996,81(8):2986-2993.

[4]Boelaert K.Treatment of Graves’disease with antithyroid drugs:current perspectives[J].Thyroid,2010,20(9):943-946.

[5]Liu X,Qiang W,Liu X,et al.A second course of antithyroid drug therapy for recurrent Graves′disease:an experience in endocrinepractice[J].Eur J Endocrinol,2015,172(3):321-326.

[6]蘇青.美國甲狀腺協(xié)會/美國臨床內(nèi)分泌醫(yī)師協(xié)會甲亢診療指南介紹[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2013,29(2):J0001-J0006.

[7]Chen Z,Lin F,Gao Y,et al.FOXP3 and RORrt:transcriptional regulation of Treg and Th17[J].Int Immunopharmacol,2011,11(5): 536-542.

[8]計學(xué)理,韓秋菊,劉建國,等.Graves病131I治療前后甲狀腺激素水平與細胞因子相關(guān)性探討[J].中國地方病防治雜志,2007,22(3): 186-188.

[9]謝建平,吳成秀,嚴宗遜,等.Graves病治療前后細胞因子水平的變化[J].中華核醫(yī)學(xué)雜志,2004,24(4):247-249.

[10]李學(xué)軍,閆冰,趙巖.甲巰咪唑?qū)raves病患者外周血清Thl和Th2細胞因子的影響[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2008,42(6):533-535.

[11]楊靜,潘天榮,杜益君,等.Graves病～(131)I或抗甲狀腺藥物治療前后外周血CD4～+CD25～+CD127～(low)調(diào)節(jié)性T細胞的變化[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2016,51(5):691-695.

[12]查兵兵,劉軍,查英,等.Graves病患者(131)I治療前后CD4+CD25+ Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的變化[J].中國免疫學(xué)雜志,2012,28(11): 1032-1035.

Changes of the mRNA expression of TBX21,GATA3,RORC,FOXP3 before and after the treatment of Graves' hyperthyroidism and Graves'ophthalmopathy.

CHEN Pu,WANG Yue,SHI Bing-yin.Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710061,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the mRNA expression of Th1,Th2,Th17 and Treg transcription factors (TBX21,GATA3,RORC and FOXP3)in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)of patients with Graves′hyperthyroidism and Graves′ophthalmopathy treated by methimazole(MMI)and methylprednisolone pulse therapy(IVMP), respectively.MethodsA total of 12 patients with early-onset Graves′hyperthyroidism and 12 patients with Graves′ophthalmopathy,who admitted to Department of Endocrinology of the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University from September 2014 to May 2016,were respectively treated with MMI and IVMP.PBMCs were obtained before and after different the treatment,and the RNAs of PBMCs were extracted.qRT-PCR was used to analyze the mRNA expression levels of Th1,Th2,Th17 and Treg transcription factors(TBX21,GATA3,RORC and FOXP3).ResultsThe mRNA level of RORC and FOXP3 of Graves′hyperthyroidism group before the treatment of MMI were respectively (0.090 2±0.036 4)and(0.088 9±0.058 7),which were significantly lower than(0.292 6±0.198 6)and(0.148 6±0.072 6) after the treatment(P＜0.05).Moreover,there was no significantly differences in the expression of TBX21(0.0437± 0.0260)vs(0.043 6±0.019 6),GATA3(0.040 5±0.023 3)vs(0.043 7±0.015 8),RORC(0.184 4±0.094 9)vs(0.174 5± 0.066 5)and FOXP3(0.132 4±0.075 7)vs(0.187 0±0.059 5)in Graves′ophthalmopathy patients before and after the treatment of IVMP.However,the expression of RORC(0.184 4±0.094 9)vs(0.090 2±0.0364)in Graves′ophthalmopathy group was significantly higher than that in Graves′hyperthyroidism group(P＜0.01).ConclusionMMI and IVMP treatment have effect on the differentiation of T cells.The changes in the mRNA expression of the transcription factors of each T cell subset are closely related to the development of the disease and the outcome of the treatment.

Graves′hyperthyroidism;Graves′ophthalmopathy;TBX21;GATA3;RORC;FOXP3

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.008

R582+.1

A

1003—6350（2017）15—2437—04

2017-01-06)

國家自然科學(xué)基金(編號：81670725)

施秉銀。E-mail：shibingy@126.com