劉健雄，徐嘉輝，陳德明，潘嘉問

(1.鶴山市人民醫(yī)院普通外科，廣東鶴山529700；2.廣東省中醫(yī)藥工程研究院，廣東廣州510095；3.鶴山市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東鶴山529700)

香菇多糖對腫瘤壞死因子-α誘導炎癥細胞模型的作用

劉健雄1，徐嘉輝2，陳德明1，潘嘉問3

(1.鶴山市人民醫(yī)院普通外科，廣東鶴山529700；2.廣東省中醫(yī)藥工程研究院，廣東廣州510095；3.鶴山市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東鶴山529700)

目的研究香菇多糖對TNF-α誘導炎癥細胞模型的作用。方法選取小鼠RAW264.7巨噬細胞為研究載體，實驗分為空白組、模型組、香菇多糖高、中和低濃度組，共5組，每組設(shè)5個復孔。采用1 g/L、10 g/L、100 g/LTNF-α誘導建立炎癥細胞模型，予香菇多糖進行給藥孵育，于37℃及5%CO2的條件下培養(yǎng)6 h，取上清樣品備測IL-6、IL-18與IL-23。采用酶聯(lián)免疫法檢測IL-6、IL-18與IL-23含量水平。結(jié)果采用10 g/L TNF-α誘導成功建立炎癥細胞模型。藥物孵育后，5組的IL-6、IL-18及IL-23水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中，香菇多糖高、中、低濃度組和模型組的IL-6[(38.85±4.49)pg/mL、(56.53±7.41)pg/mL、(82.16±5.48)pg/mL vs(97.50±12.04)pg/mL]、IL-18 [(28.26±4.54)pg/mL、(43.71±5.29)pg/mL、(52.62±6.55)pg/mL vs(80.27±6.90)pg/mL]及IL-23[(60.63±4.02)pg/mL、(74.91±7.64)pg/mL、(90.51±8.73)pg/mL vs(121.31±9.97)pg/mL]水平比較，香菇多糖高、中、低濃度組明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。香菇多糖高濃度組的IL-18水平與空白組相當[(28.26±4.54)pg/mL vs(17.76± 1.22)pg/mL]，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)論香菇多糖能夠抑制TNF-α誘導炎癥細胞模型的IL-6、IL-18和IL-23，故而具有免疫調(diào)節(jié)作用，且高濃度香菇多糖能夠顯著減少IL-18的分泌。

腫瘤壞死因子-α；香菇多糖；胃癌；輔助化療

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，流行病學研究表明，胃癌高發(fā)年齡為50～60歲[1]。隨著老年化問題的日漸嚴重，我國已經(jīng)成為胃癌的高發(fā)國家之一，嚴重制約人們的生存質(zhì)量與臨床結(jié)局，給家庭及社會帶來沉重負擔。手術(shù)治療是目前臨床診治胃癌行之有效的干預手段，但術(shù)后恢復與避免再發(fā)是臨床的重點與難點[2]。研究表明，術(shù)后輔助化療有利于提高患者的生存率，但化療藥物的毒副反應(yīng)相對亦會制約患者的生存質(zhì)量，因而尋找減少術(shù)后化療不良反應(yīng)及改善機體功能成為了目前的急切需求[3]。香菇多糖是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，能用于術(shù)后化療的輔助治療[4]。本文通過研究香菇多糖對腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α誘導RAW264.7細胞炎癥模型的作用，探討其對改善機體抗炎免疫功能的作用機制，為胃癌術(shù)后化療恢復提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料DMEM高糖細胞培養(yǎng)基，由美國Cellgro公司提供；澳洲胎牛血清，由美國Gibco公司提供；TNF-α標準品，由羅氏公司提供；白介素(interleukin，IL)-6、IL-18和IL-23酶聯(lián)免疫試劑盒，由杭州聯(lián)科生物有限公司提供；香菇多糖注射液，由金陵藥業(yè)股份有限公司福州梅峰制藥廠生產(chǎn)，國藥準字Z10920012。小鼠RAW 264.7巨噬細胞，由中國科學院細胞庫提供。

1.2 實驗儀器全波長多功能酶標儀由美國Thermo公司生產(chǎn)；高速離心機由德國Eppendorf公司生產(chǎn)；光學顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn)；CO2培養(yǎng)箱由日本Sanyo公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)RAW 264.7細胞的傳代：以含有體積分數(shù)10%胎牛血清的高糖DMEM細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，于37℃，5%CO2條件使用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。采用一次性細胞刮刀進行脫壁及傳代，每天換液1次，2 d傳代1次，傳至10代穩(wěn)定后取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3.2 分組接種以每孔1×104個細胞接種至96孔板，于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)12 h。選擇貼壁及生長良好的細胞板進行試驗，標記并分為空白組、模型組、低濃度組、中濃度組及高濃度組，每孔設(shè)5個孔，邊緣采用PBS封板。

1.3.3 建立模型參考文獻方法，采用TNF-α誘導RAW267.4細胞建立炎癥細胞模型：以37℃磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次；于模型組及香菇多糖高、中、低濃度組孔中加入濃度調(diào)至TNF-α 1 g/L、10 g/L、100 g/L的細胞培養(yǎng)基，在空白組孔中加入等量培養(yǎng)基，適應(yīng)性培養(yǎng)30 min，觀察貼壁情況。

1.3.4 給藥孵育建模后，以終濃度為100 μg/L、200 μg/L、300 μg/L的香菇多糖注射液進行加藥孵育，以等量37℃PBS加入空白組與模型組；輕輕震蕩數(shù)下，于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)6 h，取上清樣品備測IL-6、IL-18和IL-23。

1.3.5 檢測樣本采用酶聯(lián)免疫法對備測樣本進行IL-6、IL-18和IL-23含量水平的檢測，按照說明書方法檢測波長選擇450 nm與570 nm，OD值使用標準曲線進行換算，其中，OD=OD450nm-OD570nm。

1.4 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析，組間兩兩比較采用Bonferroni分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TNF-α誘導RAW264.7細胞炎癥模型的建立情況采用TNF-α濃度為1 g/L、10 g/L、100 g/L的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min進行建模，10 g/L濃度水平的RAW264.7細胞出現(xiàn)變形，100 g/L濃度水平的RAW264.7細胞出現(xiàn)嚴重變形，甚至脫壁漂浮現(xiàn)象，而1 g/L濃度水平的RAW264.7細胞沒有出現(xiàn)明顯變形壞死表現(xiàn)，見圖1。因此，采用10 g/L的濃度水平TNF-α誘導建立炎癥細胞模型進行給藥孵育實驗。

2.2 不同濃度香菇多糖對TNF-α誘導RAW264.7細胞炎癥模型的IL-6、IL-18和IL-23水平的影響藥物孵育后，各組的IL-6、IL-18及IL-23水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中，香菇多糖高、中、低濃度組IL-6、IL-18及IL-23水平均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。但是，在IL-18含量方面，香菇多糖高濃度組與空白組相當，差異無統(tǒng)計學意義(95%CI=-0.08～21.08，P＞0.05)，提示該藥高濃度組能夠顯著降低IL-18水平，見表1。

圖1 不同濃度TNF-α作用下誘導RAW264.7細胞的生長情況

表1 不同濃度香菇多糖對TNF-α誘導RAW264.7細胞炎癥模型的IL-6、IL-18和IL-23的含量水平影響

表1 不同濃度香菇多糖對TNF-α誘導RAW264.7細胞炎癥模型的IL-6、IL-18和IL-23的含量水平影響

注：與模型組比較，aP＜0.05；與空白組比較，bP＞0.05。

38.20±3.50 121.31±9.97 60.63±4.02a74.91±7.64a90.51±8.73a93.50 0.00空白組模型組高濃度組中濃度組低濃度組F值P值5 5 5 5 5 0.00 10.00 10.00 10.00 10.00 21.43±4.85 97.50±12.04 38.85±4.49a56.53±7.41a82.16±5.48a87.73 0.00 17.76±1.22 80.27±6.90 28.26±4.54ab43.71±5.29a52.62±6.55a103.29 0.00

3 討論

胃癌術(shù)后患者機體免疫功能低下，加之化療藥物的不良作用，加重了患者機體復合，從而影響機體恢復與生存質(zhì)量。臨床研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖能夠顯著改善胃癌根治術(shù)后化療患者外周T細胞亞群，通過激活CD4+細胞，從而提高機體抗炎免疫功能，但具體作用機制尚未明確闡明[5]。系統(tǒng)評價表明，TNF-α的多態(tài)性與胃癌發(fā)病相關(guān)，是我國胃癌危險人群發(fā)病的重要因素之一[6]。同時，術(shù)后患者組織學的改變以及化療藥物自身對機體的作用均不同程度導致機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，常見低熱、疼痛等臨床癥狀，因而影響機體恢復。小鼠RAW264.7細胞是良好細胞實驗載體，被廣泛運用于體外炎癥機制研究[7]。已有研究表明，TNF-α能夠誘導RAW264.7細胞建立炎癥細胞模型[8]。本研究結(jié)果表明，以10 g/L濃度水平的TNF-α誘導建立炎癥細胞模型最為符合體外實驗要求。

既往臨床研究表明，香菇多糖能夠提高中晚期胃癌FOLFOX4化療方案的療效，提高患者的耐受性與減少不良反應(yīng)的發(fā)生，其能明顯改善Th2細胞中IL-10的過度表達，從而抑制T細胞克隆增殖以控制腫瘤的進展[9]。本研究結(jié)果則表明，香菇多糖能夠顯著減少炎癥細胞模型IL-6、IL-18和IL-23的分泌，高濃度組IL-18水平與空白組正常水平相當。IL-18是多功能促炎因子，不僅能夠促進Th1細胞和自殺細胞表達Fas配體介導細胞毒性，還能夠增強Th2細胞因子的分泌[10]，故香菇多糖在臨床實際中的抗炎免疫調(diào)節(jié)效果可能與調(diào)節(jié)IL-18的分泌相關(guān)。此外，Th17細胞在胃癌及術(shù)后也起到重要免疫調(diào)節(jié)作用。已有研究認為，IL-23可能通過PI3K/Akt信號通路促進胃癌細胞的遷移，因而IL-23在胃癌患者組織中出現(xiàn)高表達[11]。而本研究結(jié)果則表明，香菇多糖能夠抑制TNF-α誘導的炎癥細胞模型的IL-23分泌。

綜上所述，香菇多糖能夠抑制TNF-α誘導炎癥細胞模型的IL-6、IL-18和IL-23，對Th2和Th17細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，且高濃度香菇多糖能夠顯著減少IL-18的分泌。

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Effect of lentinan in treating the cell model of inflammatory response induced by tumor necrosis factor-α.

LIU Jian-xiong1,XU Jia-hui2,CHEN De-ming1,PANG Jia-wen3.1.Department of General Surgery,Heshan People's Hospital,Heshan 529700,Guangdong,CHINA;2.Guangdong Engineering Institute of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA;3.Department of Oncology,Heshan People's Hospital,Heshan 529700, Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of lentinan in treating the cell model of inflammatory response induced by tumor necrosis factor(TNF)-α.MethodsRAW 264.7 cell was used as the study model,and there were 5 groups including the blank group,model group,high,medium and low concentrations of lentinan group.The inflammatory cell models induced by TNF-α(1 g/L,10 g/L,100 g/L).Then under the situation of 37℃and 5%CO2,test groups were added lentinan to have the incubation with 6 h,and the supernatant was collected.The concentrations of interleukin (IL)-6,IL-18 and IL-23 were tested by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsIt is successful to use 10 g/L TNF-α to induce the inflammatory cell model.After the incubation,there were difference between five groups inthe concentrations of IL-6,IL-18 and IL-23(P＜0.05).Moreover,the concentrations of IL-6 of(38.85±4.49)pg/mL, (56.53±7.41)pg/mL,(82.16±5.48)pg/mL,respectively,IL-18 of(28.26±4.54)pg/mL,(43.71±5.29)pg/mL,(52.62± 6.55)pg/mL,respectively and IL-23 of(60.63±4.02)pg/mL,(74.91±7.64)pg/mL,(90.51±8.73)pg/mL,respectively in high,medium and low concentrations of lentinan group were obviously lower than(97.50±12.04)pg/mL,(80.27±6.90) pg/mL,(121.31±9.97)pg/mL in the model group(P＜0.05).However,there was no significant difference between the high concentration of lentinan group and blank one in the aspect of IL-18,(28.26±4.54)pg/mL vs(17.76±1.22)pg/mL (P＞0.05).ConclusionLentinan can inhibit the secretion of IL-6,IL-18,and IL-23 in the cell model of inflammatory response induced by TNF-α,so it has immunomodulatory effect and the high concentration of lentinan could obviously decrease the section of IL-18.

Tumor necrosis factor-α(TNF-α);Lentinan;Gastric cancer;Adjuvant chemotherapy

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.004

R735.2

A

1003—6350（2017）15—2423—03

2017-05-07)

廣東省江門市衛(wèi)生局醫(yī)學科研基金(編號：A2012738)

劉健雄。E-mail：13695812@qq.com