宋亞娜，林 艷, 陳子強(qiáng)

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氮肥水平對(duì)稻田細(xì)菌群落及N2O排放的影響*

宋亞娜，林 艷, 陳子強(qiáng)

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 福州 350003)

作為土壤氮素轉(zhuǎn)化的驅(qū)動(dòng)者, 微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系著稻田氮素利用及溫室氣體N2O排放等問(wèn)題。本研究分別基于高通量測(cè)序和熒光定量PCR技術(shù), 分析了不同氮肥水平[CK(不施氮)、N(施N 180 kg?hm-2)、2/3N(施N 120 kg?hm-2)、1/3N(施N 60 kg?hm-2)]下稻田細(xì)菌群落及硝化反硝化關(guān)鍵微生物功能基因豐度的變化。結(jié)果顯示: 氮肥水平提高增加了稻田細(xì)菌物種豐富度Chao1指數(shù)和群落多樣性Shannon指數(shù), 改變了細(xì)菌群落組成, 其中與硝化作用相關(guān)的硝化螺菌門(mén)Nitrospirae和嗜酸的醋桿菌門(mén)Acidobacteria的相對(duì)豐度隨氮肥水平提高而增加, 但甲烷氧化菌Methylosinus的相對(duì)豐度隨氮肥水平提高而降低。氮肥水平對(duì)稻田硝化作用關(guān)鍵微生物氨氧化細(xì)菌基因豐度的影響較大, 0~5 cm和10~20 cm深度土層中的基因豐度均隨氮肥用量增加而提高; 反硝化作用關(guān)鍵微生物功能基因、和的豐度在不施肥處理(CK)中顯著低于施肥處理(1/3N、2/3N和N) (<0.05), 但1/3N、2/3N和N處理的稻田基因豐度沒(méi)有明顯差異; 0~5 cm土層中和基因豐度存在隨氮肥水平提高而增加的趨勢(shì), 10~20 cm土層中基因豐度在2/3N和N處理下顯著高于1/3N處理(<0.05)。N處理的稻田N2O排放通量顯著高于2/3N及1/3N處理(<0.05), 后者又顯著高于CK處理(<0.05)。相關(guān)分析結(jié)果表明稻田N2O排放通量與0~5 cm土層中硝化螺菌門(mén)Nitrospirae相對(duì)豐度及10~20 cm土層中基因豐度存在顯著相關(guān)性(<0.05,=10)。綜上所述, 氮肥水平提高增加了稻田細(xì)菌群落多樣性, 促進(jìn)了稻田N2O排放, 且本研究稻田中硝化作用微生物群落及豐度變化與稻田N2O排放的關(guān)系更為密切。

氮肥水平; 稻田土壤; 微生物群落; 氨氧化細(xì)菌基因; 反硝化細(xì)菌基因; N2O排放; 高通量測(cè)序; 熒光定量PCR

氮肥不僅是提高作物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素, 也是決定農(nóng)田N2O排放量的重要因素。N2O是重要的農(nóng)業(yè)溫室氣體之一, 旱地和非飽和水稻土是N2O的主要農(nóng)業(yè)排放源, 由于氮肥投入量的增加, 農(nóng)業(yè)N2O的排放量到2030年預(yù)計(jì)將增加35%~60%[1]。

由微生物驅(qū)動(dòng)的硝化作用和反硝化作用是土壤釋放N2O的兩個(gè)最重要的途徑[2-4]。在硝化作用的氨氧化過(guò)程中經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)經(jīng)由羥胺形成中間產(chǎn)物N2O, 含有氨單加氧酶基因的微生物在這一過(guò)程中起主要驅(qū)動(dòng)作用[5]。土壤中的反硝化細(xì)菌在將NO3--N或NO2--N還原為N2的過(guò)程中產(chǎn)生N2O, 亞硝酸還原酶基因、氧化氮還原酶基因和氧化亞氮還原酶基因是常作為檢測(cè)環(huán)境中反硝化細(xì)菌的標(biāo)記基因[6]。研究表明施用氮肥有助于提高稻田土壤氨氧化細(xì)菌基因豐度[7], 但對(duì)反硝化細(xì)菌各功能基因多樣性的影響各不相同。如, 長(zhǎng)期施用氮肥明顯提高紅壤稻田基因群落多樣性[8]; 施氮可改變紫潮泥水稻土反硝化基因的豐度, 但并未明顯影響紅黃泥水稻土反硝化基因豐度[9]。硝化反硝化作用直接關(guān)系到稻田N2O的排放, 硝化反硝化微生物各功能基因多樣性及豐度的變化與稻田N2O排放的相關(guān)性值得深入研究。

在土壤微生物群落研究中, 與一般的DNA指紋圖譜技術(shù)相比高通量測(cè)序技術(shù)具有數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高、信息量大的特點(diǎn)。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模土壤微生物基因直接測(cè)序, 為土壤微生物物種、結(jié)構(gòu)、功能和遺傳多樣性的研究提供了豐富的信息[10-11]。高通量測(cè)序在稻田細(xì)菌多樣性的研究中已大量應(yīng)用, 如, 在生物黑炭對(duì)紅壤性稻田根際微生物的研究中, 發(fā)現(xiàn)一些對(duì)植物生長(zhǎng)有益的促生菌有增加的趨勢(shì)[12]; 采用Illumina miseq高通測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)菌的16S保守區(qū)進(jìn)行測(cè)序, 發(fā)現(xiàn)輪作土壤微生物豐富度(Chao1)遠(yuǎn)高于連做[13]。應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)必將有助于稻田N2O釋放相關(guān)微生物多樣性的深入研究。

化學(xué)氮肥是決定農(nóng)田N2O排放量的重要因素, 通過(guò)對(duì)我國(guó)單季稻、稻-旱輪作中的水稻及雙季稻等378個(gè)點(diǎn)位的N2O排放量的估算, 表明氮肥用量對(duì)排放結(jié)果具有極顯著的影響[14], 而且氮肥施用后也會(huì)在短期內(nèi)引起N2O排放量的顯著增加[15]。但是在施用氮肥增加稻田N2O排放過(guò)程中有關(guān)土壤微生物的作用還不十分清楚, 尤其是硝化與反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)變化所發(fā)揮的作用更需深入探討。本研究利用最新的分子生物學(xué)技術(shù)分析了稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化及其對(duì)稻田N2O排放的影響。我們以田間試驗(yàn)為對(duì)象, 通過(guò)高通量測(cè)序和熒光定量PCR技術(shù)分析不同氮肥水平下稻田土壤細(xì)菌的種類、群落結(jié)構(gòu)、多樣性及硝化和反硝化細(xì)菌功能基因豐度, 評(píng)價(jià)氮肥水平對(duì)稻田微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的影響及其與稻田N2O排放的相關(guān)性。為深入探討稻田氮素地球生物化學(xué)循環(huán)中的溫室氣體排放及持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 田間試驗(yàn)

本研究在位于福建省福州市前洋村(26°11′N(xiāo), 119°16′E)的福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地水稻田進(jìn)行。供試土壤為紅壤, 基本理化性狀為: 有機(jī)質(zhì)含量15.77 g?kg-1、pH 5.82、全氮1.28 g?kg-1、全磷0.27 g?kg-1、全鉀18.35 g?kg-1、堿解氮153.6 mg?kg-1、有效磷15.67 mg?kg-1、速效鉀77.98 mg?kg-1。

依據(jù)當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)的氮肥用量設(shè)置N[180 kg(N)?hm-2]、2/3N[120 kg(N)?hm-2]、1/3N[60 kg(N)?hm-2]和對(duì)照CK(不施氮磷鉀肥)4個(gè)處理。氮肥種類為尿素, 磷肥和鉀肥種類為過(guò)磷酸鈣和氯化鉀, 全部磷鉀肥和1/2氮肥用做基肥, 1/2氮肥在水稻分蘗后期追肥。磷肥和鉀肥均分別為50 kg(P2O5)?hm-2和100 kg(K2O)?hm-2。每個(gè)處理重復(fù)3次, 共12個(gè)田間小區(qū)隨機(jī)排列, 小區(qū)面積20 m2, 種植密度為175 000株?hm-2。供試水稻品種為‘薈豐優(yōu)3301’(LHuifengyou3301), 按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)進(jìn)行水稻栽培的水分及田間管理。田間試驗(yàn)于5月初播種, 6月初插秧, 10月初收獲。

1.2 土壤樣品采集

于水稻生長(zhǎng)最旺盛的開(kāi)花灌漿期, 每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選5個(gè)點(diǎn)采集土壤樣品, 為了更好區(qū)分表層和根層土壤, 用土鉆分別采集0~5 cm和10~20 cm深度的土層土壤, 將5點(diǎn)采集的土壤混合為1個(gè)樣品。12個(gè)小區(qū)取得0~5 cm和10~20 cm土層土樣各12個(gè), 共24個(gè)土壤樣品。田間采集的土樣放入4 ℃冰盒中保存, 于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將混合后的土壤去除根系、雜草、土壤動(dòng)物和石塊等雜質(zhì)并混勻后于-70 ℃冷凍保存用于土壤微生物分析。

1.3 土壤微生物DNA提取

土壤微生物總DNA提取采用FastDNA SPIN Kit (For Soil) (QBIOgene)的試劑盒方法, 稱取0.5 g解凍后的土壤樣品, 按試劑盒的試驗(yàn)步驟進(jìn)行土壤微生物總DNA提取, DNA樣品-20 ℃冰箱保存待用。

1.4 土壤微生物的高通量測(cè)序

將凍存的稻田土壤DNA樣品用干冰包裝后, 送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司, 進(jìn)行微生物16S擴(kuò)增子高通量測(cè)序。利用通用引物338F: ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和806R: GGACTAC HVGGGTWTCTAAT對(duì)細(xì)菌16S的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[16], PCR采用高保真酶Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer 25mL、DMSO 3mL、F/R引物各3mL、DNA模板 10mL、加無(wú)菌水至50mL的反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增條件為: 98 ℃, 30 s; 30′(98 ℃, 15 s; 58 ℃, 15 s; 72 ℃, 15 s); 72 ℃, 1 min。PCR產(chǎn)物采用Illumina公司MiSeq測(cè)序系統(tǒng)上機(jī)分析。利用QIIME(version 1.8.0)對(duì)原始序列進(jìn)行分析[17], 所有樣本的序列隨機(jī)抽取到30 000, 然后進(jìn)行各項(xiàng)分析, 在97%置信度下將每個(gè)樣品所有的16S rRNA基因序列進(jìn)行分類, 獲得門(mén)、綱、目、科和屬各水平下的分類單元。同時(shí)利用QIIME計(jì)算Alpha多樣性, 包括物種豐富度Chao1、香農(nóng)指數(shù)Shannon和辛普森指數(shù)Simpson等; 并進(jìn)行樣品間差異分析, 通過(guò)STAMP生成主成分分析PCA圖[18]。

1.5 土壤微生物的熒光定量PCR

利用氨氧化細(xì)菌基因及反硝化細(xì)菌的和基因的特異引物[6,19-21](表1), 在ABI PRISM7500 Real-Time PCR System擴(kuò)增儀上進(jìn)行絕對(duì)熒光定量PCR分析。反應(yīng)體系為25mL, 其中2mL稀釋5倍的DNA模板加反應(yīng)液23mL, 反應(yīng)液包括12.5mL SYBR Premix Ex TaqTM(2′), 0.5mL ROX Reference DyeⅡ(50′), 前、后引物各1mL(5 pmol?L-1, 英駿生物工程公司, 上海)和8mL超純水。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立依照He等[22]的方法。分別對(duì)土壤DNA用各個(gè)基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD-18(TaKaRa, 大連)載體中, 然后對(duì)插入正確片段的克隆進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取, 用Nanodrop ND-1000 UV-Vis測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度, 計(jì)算質(zhì)粒DNA拷貝數(shù), 按10倍梯度稀釋質(zhì)粒DNA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。本試驗(yàn)中和基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍分別為9.09′108~9.09′104copies?L-1、3.67′109~3.67′105copies?L-1、5.24′109~ 5.24′105copies?L-1和7.19′109~7.19′105copies?L-1。和基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的2均達(dá)0.99, 擴(kuò)增效率分別為1.01、0.98、0.99和1.01。

1.6 N2O排放通量監(jiān)測(cè)

于土壤樣品采集當(dāng)天, 采用靜態(tài)密閉箱法采集稻田N2O的排放樣品。N2O濃度采用氣相色譜(Agilent Technologies 7890B GC system, 美國(guó))測(cè)定, 檢測(cè)器是電子捕獲檢測(cè)器(ECD), 檢測(cè)器溫度330 ℃, 氣相色譜的分離材料是PQ填充柱, 柱溫55 ℃。標(biāo)準(zhǔn)氣體由大連大特氣體有限公司提供。N2O排放通量計(jì)算公式為[23-24]:

表1 熒光定量PCR的引物

=′′/′273/(273+) (1)

式中:為N2O排放通量[g?(m2?h)-1];為N2O標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的密度(1.964 kg?m-3);為經(jīng)過(guò)田間水層高度調(diào)整后采樣箱頂部距水面的實(shí)際高度(m);/為采樣過(guò)程中采樣箱內(nèi)N2O濃度變化率[L?(m3?h)-1], 即罩箱后密閉時(shí)間與箱內(nèi)氣體濃度進(jìn)行線性回歸方程的斜率;為采樣箱內(nèi)的平均溫度(℃)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析和制圖, 處理之間的平均值差異采用one-way ANOVA單因素方差分析, 用Excel 2007中的CORREL公式計(jì)算相關(guān)系數(shù), 以相關(guān)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表確定相關(guān)系數(shù)的顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮水平下稻田細(xì)菌群落變化

2.1.1 多樣性變化

本研究通過(guò)對(duì)16S rRNA的V3-V4區(qū)的高通量測(cè)序共測(cè)得有效序列1 998 211條, 平均每個(gè)樣品的測(cè)序深度為83 258條有效序列。測(cè)序所得的一些多樣性指數(shù)如表2所示。Chao1指數(shù)表示物種豐富程度, 其值越高表明物種的豐富度越高; Shannon指數(shù)(Shannon diversity index)反映樣品的多樣性程度, 值越高表明群落的多樣性越高; Simpsom指數(shù)(Simpson diversity index)反映物種的優(yōu)勢(shì)度, 數(shù)值越高說(shuō)明多樣性越單一[13]。結(jié)果表明稻田細(xì)菌的菌種豐富度指數(shù)Chao1在CK處理下最低, 1/3N處理下即顯著提高(<0.05), 2/3N和N處理間差異雖不顯著但二者均顯著(<0.05)高于1/3N處理; 同時(shí), 稻田土壤細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)隨氮肥水平的提高也顯著增加, N處理顯著(<0.05)高于2/3N和1/3N處理, 后者又顯著(<0.05)高于CK處理; 與Shannon指數(shù)相對(duì)應(yīng)的Simpson指數(shù)則呈現(xiàn)出施用氮肥的3個(gè)處理顯著(<0.05)低于不施肥的CK處理; 且上述指標(biāo)在0~5 cm和10~20 cm兩個(gè)深度土層中都具有相同的變化規(guī)律。

2.1.2 群落結(jié)構(gòu)分析

本研究測(cè)得的稻田土壤細(xì)菌主要菌門(mén)包括: 變形菌門(mén)(Proteobacteria)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)、硝化螺菌門(mén)(Nitrospirae)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和醋桿菌門(mén)(Acidobacteria)。這7類菌門(mén)占樣品總菌量的79.60%~89.30%, 平均84.78%。其中變形菌門(mén)、醋桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)在各樣品中所占比例較高, 依次均占26.94%、22.08%和18.55%?？梢?jiàn)變形菌門(mén)、醋桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)是本研究的稻田土壤微生物中的優(yōu)勢(shì)種群。

表2 不同氮肥水平下稻田不同深度土壤細(xì)菌豐富度及多樣性

N: 180 kg(N)?hm-2; 2/3N: 120 kg(N)?hm-2; 1/3N: 60 kg(N)?hm-2; CK: 0 kg(N)?hm-2. 同一土層同一列數(shù)值字母不同差異顯著(<0.05)。Values in the same column for the same depth of soil followed by different letters are significantly different (< 0.05).

圖1顯示了不同處理的土壤細(xì)菌各菌門(mén)的組成及其平均相對(duì)豐度。占土壤細(xì)菌總量比例較高的醋桿菌門(mén)在0~5 cm和10~20 cm兩個(gè)土層中均存在隨氮肥水平提高其相對(duì)豐度逐漸增加的趨勢(shì), 相對(duì)豐度分別從CK處理的18.40%、17.80%提高到N處理的25.50%、30.00%。不同處理的變形菌門(mén)的變化趨勢(shì)與醋桿菌門(mén)相反, 在兩個(gè)深度土層中其相對(duì)豐度分別從CK處理的35.50%、28.20%降低到N處理的22.80%、21.40%。

此外, 不同處理的硝化螺菌門(mén)的相對(duì)豐度也存在較明顯的變化規(guī)律, 0~5 cm和10~20 cm兩個(gè)土層中的硝化螺菌門(mén)的相對(duì)豐度分別從CK處理的2.80%和3.00%逐漸提高到N處理的5.70%和4.90%。

N: 180 kg(N)?hm-2; 2/3N: 120 kg(N)?hm-2; 1/3N: 60 kg(N)?hm-2; CK: 0 kg(N)?hm-2.

圖2進(jìn)一步顯示了比例最高的前10個(gè)屬的細(xì)菌在0~5 cm(圖2a)和10~20 cm(圖2b)土層的構(gòu)成情況。總體而言, 兩個(gè)深度土層中均存在3個(gè)屬的菌[互營(yíng)桿菌()、梭菌屬()和甲烷氧化菌()]的相對(duì)豐度在氮肥水平提高時(shí)降低, 其中甲烷氧化菌的相對(duì)豐度在0~5 cm土層中存在明顯的N≤2/3N≤1/3N

基于高通量測(cè)序的稻田土壤細(xì)菌群落組成的主成分分析PCA結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示, CK處理的細(xì)菌群落組成與1/3N、2/3N和N處理的細(xì)菌群落組成在變異較大的PC1方向上分布差異明顯, CK處理單獨(dú)聚類; 1/3N處理與2/3N及N處理在PC1 方向上也存在一定分布差異; 2/3N處理與N處理在PC1方向上幾乎沒(méi)有分布差異, 僅在變異較小的PC2方向上存在分布差異。此外, CK和1/3N處理的0~5 cm土層細(xì)菌群落組成與10~20 cm土層的細(xì)菌群落組成在PC2方向上也存在一定差異; 2/3N及N處理的不同深度土層的細(xì)菌群落組成幾乎沒(méi)有分布差異。說(shuō)明隨氮肥水平的提高稻田細(xì)菌群落組成在逐漸發(fā)生變化, 不施氮肥的稻田細(xì)菌群落組成與施用氮肥的稻田細(xì)菌群落組成差異最大, 在施用氮肥的不同處理間, 中、高氮肥處理的稻田細(xì)菌群落組成較為接近, 與低氮處理存在一定差異, 但差異不顯著。

2.2 稻田硝化反硝化微生物功能基因豐度分析

利用熒光定量PCR技術(shù)分析了與稻田氮素轉(zhuǎn)化及N2O排放相關(guān)的關(guān)鍵微生物功能基因的豐度。驅(qū)動(dòng)土壤氮素硝化過(guò)程關(guān)鍵步驟的基因豐度如圖4a所示。在0~5 cm和10~20 cm兩個(gè)深度土層中氨氧化細(xì)菌基因豐度均隨氮肥用量的提高而增加。0~5 cm土層中CK處理的氨氧化細(xì)菌基因豐度顯著(<0.05)低于1/3N處理, 1/3N處理又顯著(<0.05)低于2/3N和N處理; 10~20 cm土層中各個(gè)處理間的差異都到達(dá)了顯著水平(<0.05)。

N: 180 kg(N)?hm-2; 2/3N: 120 kg(N)?hm-2; 1/3N: 60 kg(N)?hm-2; CK: 0 kg(N)?hm-2. 同一屬不同字母表示差異顯著(<0.05)。Different letters above bars at the same genus indicated significant difference (< 0.05).

N: 180 kg(N)?hm-2; 2/3N: 120 kg(N)?hm-2; 1/3N: 60 kg(N)?hm-2; CK: 0 kg(N)?hm-2.

同時(shí), 本研究測(cè)定了驅(qū)動(dòng)反硝化過(guò)程的3個(gè)主要微生物功能基因、和的豐度。圖4b顯示了反硝化細(xì)菌基因豐度的變化, 在0~5 cm和10~20 cm兩個(gè)深度土層中不施肥的CK處理均顯著(<0.05)低于其余施肥的處理, 但在1/3N、2/3N和N處理間反硝化細(xì)菌基因豐度沒(méi)有明顯差異。結(jié)果表明施用氮肥可顯著提高稻田土壤硝化細(xì)菌基因豐度, 但氮肥用量多少的影響不顯著。

不同氮肥水平下的稻田反硝化細(xì)菌基因豐度在0~5 cm土層中變化較大, 隨氮肥水平提高而增加,呈現(xiàn)N≥2/3N≥1/3N>CK的變化趨勢(shì), 其中N處理顯著高于1/3N和CK處理(<0.05), 2/3N和1/3N處理又顯著高于CK處理(<0.05)(圖4c); 而在10~20 cm土層中1/3N、2/3N和N處理間的基因豐度差異不顯著, 但三者均顯著(<0.05)高于CK處理(圖4c); 此外, 各個(gè)處理均呈現(xiàn)出0~5 cm土層基因豐度顯著(<0.05)高于10~20 cm土層。表明稻田表層土壤中的基因豐度較高且變化較活躍。

稻田反硝化細(xì)菌基因豐度的測(cè)定結(jié)果顯示(圖4d): 0~5 cm和10~20 cm兩個(gè)深度土層中均存在N>1/3N>CK的顯著變化趨勢(shì)(<0.05); 對(duì)2/3N處理而言, 在0~5 cm土層中處于N和1/3N之間, 與這二者的差異都不顯著; 在10~20 cm土層中2/3N處理的基因豐度顯著(<0.05)高于1/3N處理, 但與N處理間差異不明顯。表明稻田土壤中的基因豐度變化較為活躍。

N: 180 kg(N)?hm-2; 2/3N: 120 kg(N)?hm-2; 1/3N: 60 kg(N)?hm-2; CK: 0 kg(N)?hm-2. 同一深度土層內(nèi)各柱上不同字母表示差異顯著(<0.05)。Different letters above bars at the same depth of soil indicated significant differences (< 0.05).

2.3 稻田N2O排放狀況

本研究在水稻生長(zhǎng)最旺盛的開(kāi)花灌漿期分析了土壤微生物群落的變化, 同時(shí)監(jiān)測(cè)了稻田N2O的排放狀況。結(jié)果顯示氮肥水平提高促進(jìn)了稻田N2O的排放, N處理的N2O排放通量顯著(<0.05)高于其他處理, 1/3N和2/3N處理的N2O排放通量差異不顯著, 但二者也均顯著(<0.05)高于不施肥的對(duì)照(CK) (圖5)。

將稻田N2O排放通量與土壤硝化反硝化細(xì)菌各功能基因拷貝數(shù)及硝化螺菌門(mén)、屬(本研究中比例最高的前10個(gè)屬中的硝化螺菌4—29和GOUTA19)相對(duì)豐度進(jìn)行相關(guān)分析, 結(jié)果如表3所示?？梢?jiàn), 0~5 cm土層中硝化螺菌門(mén)相對(duì)豐度與N2O排放通量的相關(guān)系數(shù)最高且達(dá)到顯著性水平(<0.05,=10), 10~20 cm土層中的氨氧化細(xì)菌基因拷貝數(shù)與N2O排放通量的相關(guān)系數(shù)最高也達(dá)到顯著性水平(<0.05,=10)。其余指標(biāo)與N2O排放通量的相關(guān)性不顯著。

N: 180 kg(N)?hm-2; 2/3N: 120 kg(N)?hm-2; 1/3N: 60 kg(N)?hm-2; CK: 0 kg(N)?hm-2. 柱上不同字母表示差異顯著(<0.05)。Different letters above bars indicated significant differences (< 0.05).

3 討論和結(jié)論

隨著DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展, 高通量測(cè)序技術(shù)逐漸成為研究土壤微生物多樣性及評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要手段和方法。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了不同氮肥水平下稻田土壤細(xì)菌群落的變化情況。發(fā)現(xiàn)水稻開(kāi)花灌漿期內(nèi), 施肥的稻田細(xì)菌物種豐度程度和多樣性都明顯高于不施肥的稻田, 且氮肥水平提高有助于增加土壤細(xì)菌豐富程度, 但當(dāng)?shù)仕捷^高后土壤細(xì)菌豐富度的增加不再明顯。與不施肥的稻田土壤比較, 施肥的稻田土壤養(yǎng)分(速效氮、磷、鉀)及有機(jī)碳含量都會(huì)增加, 可以為細(xì)菌生存和生長(zhǎng)提供更多的宜居微環(huán)境, 使土壤細(xì)菌種群多樣性增加[25-26]。本試驗(yàn)稻田土壤中變形菌門(mén)、醋桿菌門(mén)和綠彎菌門(mén)是占土壤細(xì)菌比例較高的3個(gè)主要細(xì)菌門(mén)。其中醋桿菌門(mén)相對(duì)豐度受氮肥水平影響最大, 氮肥用量增加促進(jìn)了醋桿菌門(mén)相對(duì)豐度的提高。醋桿菌是一類嗜酸的細(xì)菌, 氮肥水平提高有助于降低土壤pH增加土壤酸性[7], 從而促進(jìn)了醋桿菌門(mén)相對(duì)豐度的增加。

表3 稻田不同深度土層功能基因拷貝數(shù)及硝化螺菌相對(duì)豐度與N2O排放通量的相關(guān)系數(shù)

*顯著性檢驗(yàn)水平達(dá)0.05, 自由度為10。*: significant level is up to 0.05, freedom degree is 10.

與氮素轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的硝化螺菌門(mén)相對(duì)豐度在稻田細(xì)菌中所占比例雖然不高, 但對(duì)氮肥水平的提高響應(yīng)強(qiáng)烈, 其相對(duì)豐度隨氮肥用量增加而顯著提高。同時(shí), 在稻田土壤細(xì)菌中所占比例最高的10個(gè)細(xì)菌屬中的4—29和GOUTA19都屬于硝化螺菌門(mén), 且氮肥水平提高促進(jìn)了這二者相對(duì)豐度的增加。硝化螺菌是驅(qū)動(dòng)土壤硝化過(guò)程的主要微生物, 其相對(duì)豐度的提高可能增強(qiáng)稻田硝化作用, 而在硝化作用過(guò)程中伴有N2O的釋放。相關(guān)分析結(jié)果顯示稻田表層土壤中硝化螺菌門(mén)相對(duì)豐度與稻田N2O排放量有顯著相關(guān)性(<0.05,=10)。由此可見(jiàn), 本研究中硝化螺菌門(mén)相對(duì)豐度的增加對(duì)稻田N2O釋放應(yīng)存在一定貢獻(xiàn)。

此外, 在細(xì)菌屬水平的分析中還發(fā)現(xiàn)氮肥水平提高抑制了稻田土壤中的甲烷氧化菌屬, 尤其在0~5 cm的表層土中甲烷氧化菌屬相對(duì)豐度隨氮肥水平提高顯著降低。這可從微生物群落方面解釋氮肥抑制甲烷氧化的機(jī)制[27]。

本研究同時(shí)利用熒光定量PCR技術(shù)分析了稻田土壤中驅(qū)動(dòng)硝化反硝化的微生物功能基因豐度的變化。發(fā)現(xiàn)硝化作用限制性步驟氨氧化過(guò)程關(guān)鍵酶基因的豐度變化與氮肥用量密切相關(guān), 不同深度土層中均呈現(xiàn)出隨氮肥水平提高基因豐度增加的明顯趨勢(shì), 尤其在深度10~20 cm土中不同氮肥水平處理間的差異都達(dá)到顯著水平(<0.05)。反硝化作用是在硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、氧化氮還原酶和氧化亞氮還原酶4個(gè)酶的連續(xù)作用下將土壤中NO3--N或NO2--N還原為N2的過(guò)程。對(duì)其中3個(gè)關(guān)鍵酶基因豐度的測(cè)定發(fā)現(xiàn), 不施肥稻田土壤中亞硝酸還原酶基因、氧化氮還原酶基因和氧化亞氮還原酶基因的豐度都顯著低于其他施肥處理稻田。而在施肥處理的稻田中,基因和基因的豐度對(duì)氮肥用量增加的響應(yīng)程度明顯強(qiáng)于基因, 前2個(gè)基因豐度在0~5 cm土層中均存在隨氮肥用量提高而增加的趨勢(shì), 且10~20 cm土層中的基因在中、高氮處理下顯著提高; 但基因豐度對(duì)氮肥用量的增加沒(méi)有明顯響應(yīng), 高、中、低氮肥水平間沒(méi)有差異。說(shuō)明本研究稻田中驅(qū)動(dòng)反硝化過(guò)程的氧化氮還原酶基因和氧化亞氮還原酶基因受氮肥用量的影響較大。

硝化和反硝化過(guò)程被認(rèn)為是土壤釋放N2O的重要途徑, 通過(guò)與驅(qū)動(dòng)硝化反硝化的微生物相對(duì)豐度及功能基因豐度的相關(guān)分析, 發(fā)現(xiàn)在本研究中稻田N2O排放量與硝化作用微生物功能基因豐富程度的相關(guān)性更高, 表現(xiàn)在0~5 cm土層中的硝化螺菌門(mén)相對(duì)豐度及10~20 cm土層中氨氧化細(xì)菌基因豐度與N2O排放通量的相關(guān)性均達(dá)到顯著性水平(<0.05,=10)。許多試驗(yàn)研究表明反硝化微生物功能基因豐度與土壤N2O釋放之間無(wú)明顯相關(guān)性, 如不同季節(jié)土豆地反硝化基因(和)豐度變化與N2O釋放量無(wú)關(guān)[28]; 利用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)(72 h)農(nóng)田土壤反硝化基因()豐度變化和N2O釋放量之間沒(méi)有相關(guān)性[29]; 70%WFPS條件下的濕地反硝化基因豐度與N2O釋放之間沒(méi)有明確的相關(guān)性[30]。本研究中施用氮肥或氮肥用量增加引起的反硝化微生物、和基因豐度的提高與稻田N2O釋放量也都沒(méi)有相關(guān)性。

綜上說(shuō)述, 本研究通過(guò)對(duì)水稻開(kāi)花灌漿期內(nèi)稻田土壤的分析, 發(fā)現(xiàn)與無(wú)氮和低氮相比較高的氮肥用量能促進(jìn)稻田細(xì)菌群落多樣性提高及改變細(xì)菌群落組成, 同時(shí)可增加稻田溫室氣體N2O的排放, 且稻田土壤中參與硝化作用的微生物群落組成與豐度的變化與N2O排放增加的關(guān)聯(lián)更為密切。但因?yàn)橥寥繬2O的產(chǎn)生有多種途徑, 由多個(gè)酶催化進(jìn)行, 不同途徑的不同酶催化反應(yīng)間存在相互制約或促進(jìn)的復(fù)雜關(guān)系。因此, 還需要通過(guò)對(duì)水稻生長(zhǎng)過(guò)程中參與土壤N2O產(chǎn)生的關(guān)鍵微生物功能基因多樣性及其作用進(jìn)行系統(tǒng)的分析研究。此外, 從DNA水平研究硝化反硝化微生物基因群落僅能代表微生物的潛在生理功能, 仍需通過(guò)RNA水平深入研究硝化反硝化細(xì)菌各功能基因多樣性與N2O釋放的相關(guān)性。

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Effect of nitrogen fertilizer level on bacterial community and N2O emission in paddy soil*

SONG Yana, LIN Yan, CHEN Ziqiang

(Institute of Biological Technology, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China)

Microbial community structures are relevant for the utilization of nitrogen (N) and the emission of nitrous oxide (N2O) in paddy soils. Nitrification and denitrification are the main ways to produce N2O in soils and nitrification bacteria and denitrifying bacteria respectively drive the processes of nitrification and denitrification. In this study, changes in bacterial communities and the abundance of nitrification bacteria or denitrifying bacteria under different nitrogen fertilizer levels [CK (no N fertilization), 1/3N (N application of 60 kg?hm-2), 2/3N (N application of 120 kg?hm-2) and N (N application of 180 kg?hm-2] in paddy soils were analyzed respectively by high-throughput sequencing and real-time PCR. The analysis in abundance of nitrification bacteria or denitrifying bacteria was based on ammonia-oxidizing bacterialgeneand denitrifying bacterialgene orgeneorgene. The results showed that increase in application of nitrogen fertilizer enhanced Chao1 index and Shannon diversity index of bacterial communities and changed the composition of bacterial communities in paddy soil. The relative abundance of Nitrospirae and Acidobacteria increased with improvement of nitrogen fertilizers, while that of Methylosinus decreased with improvement of nitrogen fertilizers in paddy soils. There was greater impact of increased use of nitrogen fertilizer on the abundance ofgene in paddy soils. The abundance ofgene increased with increasing nitrogen application in the 0-5 cm or 10-20 cm depths of soil. The abundances ofgene,gene andgene in no-fertilizer soil (CK) were significantly lower than those in fertilizer soils (1/3N, 2/3N and N) (< 0.05). There was no significant difference in the abundance ofgene among 1/3N, 2/3N and N treatments. However, there was an increasing tendency in the abundance ofgene andgene with increasing application of nitrogen fertilizer in the 0-5 cm depth of soil. The abundance ofgene in the 10-20 cm depth of soil under both 2/3N and N treatments were significantly higher than that in 1/3N treatment (< 0.05). At the same time, the emission of N2O under N treatment was significantly higher than that under 2/3N or 1/3N treatment (< 0.05), and the latter two were also higher than that under CK (< 0.05). Correlation analysis showed that the emission of N2O was markedly correlated with the relative abundance of Nitrospirae in the 0-5 cm depth of soil and the abundance ofgene in the 10-20 cm depth of soil (< 0.05,= 10). In summary, increasing nitrogen application improved the diversity of bacterial communities and the emission of N2O in the studied paddy soils. Also there was a closer correlation between changes in abundance of nitrification bacteria and the emission of N2O. The results suggested that the influence of nitrification bacteria on the emission of N2O in the studied paddy soils was greater than that of denitrifying bacteria.

Nitrogen fertilizer level; Paddy soil; Microbial community; Ammonia-oxidizing bacterial gene; Denitrifying bacterial gene; Nitrous oxide emission; High-throughput sequencing; Real-time PCR

Feb. 22, 2017; accepted May 24, 2017

S154.3

A

1671-3990(2017)09-1266-10

10.13930/j.cnki.cjea.170146

2017-02-22

2017-05-24

* 福建省公益類科研院所專項(xiàng)(2015R1019-12)、福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015J01105)、福建省科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2015N0037)和福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院PI項(xiàng)目(2016PI-26)資助

* This study was funded by the Special Fund for Research Institutes in Public Interest in Fujian Province of China (2015R1019-12), Fujian Province Natural Science Foundation (2015J01105), Fujian Province Key Projects of Science and Technology (2015N0037) and Fujian Academy Agricultural Science’s PI Projects (2016PI-26).

Corresponding author: SONG Yana, E-mail: syana@sina.com

宋亞娜, 研究方向?yàn)橥寥牢⑸锓肿由鷳B(tài)。E-mail: syana@sina.com

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