龐錦偉，姚欣，雷超，劉鋒軍

（1.渭南市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西渭南714000；2.陜西省發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，陜西渭南714000）

氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定酵素產(chǎn)品中短鏈脂肪酸

龐錦偉1，2，姚欣1，2，雷超1，2，劉鋒軍1，2

（1.渭南市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西渭南714000；2.陜西省發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，陜西渭南714000）

建立了用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）測(cè)定酵素樣品中5種短鏈脂肪酸（SCFA）的定性定量方法。結(jié)果表明，該方法可以有效分離測(cè)定酵素樣品中5種SCFA，該方法檢出限低（0.030～0.100mg/kg），加標(biāo)回收率80.1%～110.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）1.36%～10.0%。用該方法分析37種酵素樣品中SCFA，結(jié)果表明，86.5%的酵素產(chǎn)品檢出乙酸（1.02～36.1 g/kg），僅有一種酵素產(chǎn)品檢出丁酸（含量為0.056 g/kg），其余均未檢出。該方法適用于酵素產(chǎn)品中短鏈脂肪酸的檢測(cè)。

短鏈脂肪酸；酵素；氣相色譜-質(zhì)譜法

短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）通常是指碳鏈中碳原子數(shù)少于6個(gè)的有機(jī)脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等[1-3]。SCFA是由于飲食中不消化的淀粉、纖維多糖等在結(jié)腸腔內(nèi)經(jīng)厭氧菌（雙歧桿菌、乳桿菌、類(lèi)桿菌等）酵解生成，其是結(jié)腸粘膜的主要能量供應(yīng)來(lái)源，還可以維護(hù)腸道上皮細(xì)胞的完整性和杯狀細(xì)胞的分泌功能，同時(shí)還具有促進(jìn)水、鈉吸收，刺激結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖和黏膜生長(zhǎng)，增加腸系膜血流和胃腸激素分泌等生理作用[4-8]。酵素是以動(dòng)物、植物、菌類(lèi)等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定活性成分的產(chǎn)品[9]，包括低聚糖、氨基酸、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)成分以及具有生物活性的酶（蛋白酶、超氧化物歧化酶、脂肪酶等）、生物堿等功能性成分，能夠有效消除體內(nèi)自由基，使酵素具有改善人體內(nèi)微環(huán)境、提高免疫力、降低膽固醇等功效[10-19]。酵素流行于日本、中國(guó)臺(tái)灣等地區(qū)，近年來(lái)作為健康食品在我國(guó)逐步流行起來(lái)[20]。但由于缺乏相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和管理規(guī)范，導(dǎo)致目前市場(chǎng)魚(yú)龍混雜，部分生產(chǎn)者或銷(xiāo)售者在沒(méi)有檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持下宣稱(chēng)其產(chǎn)品含有短鏈脂肪酸，造成消費(fèi)者的困擾和執(zhí)法難點(diǎn)，因此測(cè)定酵素產(chǎn)品中短鏈脂肪酸含量對(duì)制定產(chǎn)品方法標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范市場(chǎng)、加強(qiáng)監(jiān)管等方面有著重要意義。

本研究建立了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）測(cè)定酵素產(chǎn)品中乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸和戊酸5種短鏈脂肪酸的定量分析方法，并對(duì)37種酵素產(chǎn)品樣品的分析。本方法具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，對(duì)酵素產(chǎn)品中短鏈脂肪酸的檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸（色譜標(biāo)樣）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜級(jí)）、其他試劑均為分析純：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

酵素樣品由某生產(chǎn)廠商直接提供，共計(jì)37個(gè)樣品。其中固體類(lèi)酵素樣品24個(gè)，液體類(lèi)酵素樣品13個(gè)；復(fù)合原料酵素樣品28個(gè)，單一原料酵素樣品9個(gè)。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、VF-WAXms毛細(xì)管色譜柱（30m×25mm×0.25μm）、DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱（30m×25mm×0.25μm）、OV-351毛細(xì)管色譜柱（30m× 0.32mm×0.25μm）：美國(guó)Agilent公司；VG3S25漩渦振蕩器：德國(guó)IKA公司；AS20500A超聲波清洗器：天津奧特塞恩斯儀器有限公司；GL-20G-II低溫高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；0.22μm針頭式過(guò)濾器：天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g試樣（精確至0.01 g）置于50m L聚丙烯離心管中，加入5m L體積比1∶1的甲醇-水溶液（含0.2%HCl），渦旋混勻1m in后500W超聲波提取15m in，待溶液冷卻后8 000 r/min離心5min（如固體類(lèi)酵素則12 000 r/min離心8min，重復(fù)一次），取上清液通過(guò)0.22μm濾膜后上機(jī)[21]。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)序列配制

分別稱(chēng)取5種短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.1mg）于容量瓶中，加體積比1∶1的甲醇-水溶液（含0.2%HCl）定容至刻線，得到單短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度分別為乙酸42.0mg/L，丙酸39.7mg/L，丁酸38.3mg/L，異戊酸37.6mg/L，戊酸37.0mg/L。分別移取1.00m L單短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10m L容量瓶中，用體積比1∶1的甲醇-水溶液（含0.2% HCl）稀釋至刻線，得到混合短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)使用液。再用體積比1∶1的甲醇-水溶液（含0.2%HCl）逐級(jí)稀釋混合短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)使用液成混合標(biāo)準(zhǔn)序列溶液。

1.3.3 氣質(zhì)條件

程序升溫：初始溫度100℃，以5℃/min升至150℃后，升溫至240℃并保持3m in；進(jìn)樣口溫度：230℃；輔助溫度：240℃；四極桿溫度：150℃；離子源溫度：230℃；進(jìn)樣量：1μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；載氣：高純氦氣（純度＞99.999%）；載氣流速：2m L/m in。

1.3.4 定性定量分析

用所獲得的GC-MS圖譜與標(biāo)準(zhǔn)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，將峰相似度＞90%的標(biāo)本峰以及不同短鏈脂肪酸的分子離子峰作為選擇離子，根據(jù)軟件確定各離子的豐度和范圍。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱選擇試驗(yàn)

綜合考慮所測(cè)定的5種短鏈脂肪酸的沸點(diǎn)和極性并結(jié)合酵素樣品的特性，選擇VF-WAXms、DB-FFAP和OV-351三種色譜柱作為候選色譜柱進(jìn)行分析測(cè)定，根據(jù)分離效果綜合考慮使用VF-WAXms毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行酵素產(chǎn)品中5種短鏈脂肪酸的分析測(cè)定[22]。

2.2 方法分離度和線性關(guān)系試驗(yàn)

在所采用的儀器條件下，對(duì)5種短鏈脂肪酸的混合標(biāo)液進(jìn)行分析測(cè)定（見(jiàn)圖1），以考察5種SCFA的分離度和線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 5種短鏈脂肪酸混合標(biāo)液GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chrom atogram of five SCFAsm ixed standard solution analysis by GC-MS

表1 5種短鏈脂肪酸的出峰時(shí)間和線性關(guān)系結(jié)果Table 1 Results of peak time and linear relationships of five SCFAs

由圖1、表1可知，5種SCFA的出峰順序依次為：乙酸（3.65min）、丙酸（4.68m in）、丁酸（5.97m in）、異戊酸（6.62min）、戊酸（7.77m in），在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，5種SCFA均具有良好的分離度（分離度＞2）和線性關(guān)系（R2＞0.995），5種SCFA的線性范圍較寬，均可以達(dá)到102。

2.3 方法精密度和檢出限試驗(yàn)

在所采用的儀器條件下，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)序列溶液進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣（重復(fù)5次），以考察方法的穩(wěn)定性，并用1∶1（V/V）甲醇-水溶液（含0.2%HCl）逐步稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)序列溶液直至信噪比（S/N）＜3，以考察方法的檢出限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5種短鏈脂肪酸的穩(wěn)定性和檢出限結(jié)果Table 2 Results of stability and lim its of detection of five SCFAs

由表2可知，在該儀器條件下，5種SCFA出峰時(shí)間偏差極?。?.001%～0.132%）、峰面積偏差和峰高偏差均在合理范圍內(nèi)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出該方法測(cè)定5種SCFA的檢出限為0.030～0.100mg/kg，表明該方法檢出限，完全能夠滿足檢測(cè)要求。

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

向酵素樣品加入不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（加入量見(jiàn)表3），按照樣品處理方法處理后上機(jī)，每個(gè)濃度水平重復(fù)處理5次，以考察方法準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 5種短鏈脂肪酸加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rate tests of five SCFAs

由表3可知，5種SCFA加標(biāo)回收率為80.1%～110.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandard deviation，RSD）為1.36%～10.0%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度，方法可靠。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

由于溶劑中含有甲醇，可能與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中酸類(lèi)物質(zhì)酯化反應(yīng)影響測(cè)定結(jié)果，因此增加穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，即在混合標(biāo)準(zhǔn)序列溶液配制后1～24 h使用所用方法分別進(jìn)樣，以考察方法的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，隨著時(shí)間的推移，5中SCFA的標(biāo)準(zhǔn)峰面積呈現(xiàn)先穩(wěn)定再逐步降低，10 h后出現(xiàn)相應(yīng)短鏈脂肪酸酯的峰并逐漸增大，因此綜合考慮認(rèn)為樣品處理完成后不易放置超過(guò)8 h，同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液也應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，以免造成較大誤差。

2.6 酵素樣品中SCFA含量測(cè)定試驗(yàn)

用上述方法對(duì)35種酵素樣品進(jìn)行了5種SCFA含量測(cè)定。結(jié)果表明，乙酸是所檢酵素樣品中短鏈脂肪酸檢出率最高的，86.5%的酵素產(chǎn)品檢出乙酸成分，含量范圍為1.02～36.1 g/L，均值為7.8g/L。其中固體酵素檢出率（61.5%）遠(yuǎn)低于液體酵素檢出率（100%），復(fù)合原料酵素檢出率（82.1%）遠(yuǎn)低于單一原料酵素檢出率（100%）。剔除未檢出的樣品，固體酵素乙酸含量（12.21 g/L）遠(yuǎn)高于液體酵素（6.39 g/L），復(fù)合原料酵素乙酸含量（9.13 g/L）約為單一原料酵素乙酸含量（4.55 g/L）的2倍。綜合而言，復(fù)合原料的固體酵素中乙酸含量多于其他酵素樣品。其他SCFA測(cè)定結(jié)果僅有一種酵素樣品檢出丁酸，含量為0.056 g/L，其余3種短鏈脂肪酸均未檢出。結(jié)合發(fā)酵工藝可以認(rèn)為乙酸是酵素產(chǎn)品中最主要的短鏈脂肪酸。

3 結(jié)論

采用甲醇水溶液超聲提取酵素樣品中的短鏈脂肪酸，使用VF-WAXms毛細(xì)管色譜柱的GC-MS可以同時(shí)分離測(cè)定乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸5種SCFA，方法具有分離效果好，線性范圍0.037～4.200mg/L、回收率80.1%～110.6%，檢出限0.030～0.100mg/kg，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，將此方法應(yīng)用于酵素實(shí)際樣品的測(cè)定，結(jié)果86.5%的酵素產(chǎn)品檢出乙酸成分（1.02～36.1 g/L），僅有一種酵素樣品檢出丁酸，其余3種短鏈脂肪酸均未檢出。該方法適用于酵素樣品中短鏈脂肪酸的檢測(cè)，也為酵素產(chǎn)品檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化奠定了理論和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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Determ ination of short-chain fatty acids in fermentsby gaschromatography-massspectrometry

PANG Jinwei1,2,YAO Xin1,2,LEIChao1,2,LIU Fengjun1,2
(1.Weinan Supervision&Inspection Institute ofProductQuality,Weinan 714000,China; 2.ShaanxiProvincialSupervision and Inspection CenterforFermented ProductQuality,Weinan 714000,China)

The qualitative and quantitative analysismethods of 5 kindsof short-chain fatty acids(SCFA)in ferments sampleswere established by gas chromatography-massspectrometry(GC-MS).The resultsshowed that themethod could effectively separate the five kindsof SCFA in fermentssamples,and had low lim itsof detection(0.030-0.100mg/kg),adding standard recovery rate range 80.1%-110.6%,and relative standard deviation(RSD) 1.36%-10.0%.The determination resultsof37 kindsof fermentssamplesanalysisby themethod indicated thatacetic acid was detected in 86.5%fermentssamples(1.02-36.1 g/kg),butyric acid wasdetected in only one sample(0.056 g/kg),and other componentswere notdetected.Therefore,the method could be used fordetermination of five SCFAs in fermentsproducts.

short-chain fatty acids;ferment;gas chromatography-massspectrometry

O657.63

0254-5071（2017）08-0165-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.036

2017-05-26

龐錦偉（1990-），男，助理工程師，碩士，主要從事食品質(zhì)量檢驗(yàn)工作。