張觀飛，何靜如，陳衛(wèi)軍，陳文學，馬超，劉雪，陳海明*

（海南大學食品學院，海南海口570228）

低醇度椰子水成分和抗氧化活性研究

張觀飛，何靜如，陳衛(wèi)軍，陳文學，馬超，劉雪，陳海明*

（海南大學食品學院，海南海口570228）

該研究以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DV10為菌種，發(fā)酵低醇度椰子水，分析了發(fā)酵對椰子水中還原糖、總酚、有機酸含量以及抗氧化活性的影響。結(jié)果顯示，發(fā)酵對成熟椰子水的成分和抗氧化活性有重要的影響。低醇度椰子水發(fā)酵10 d后，葡萄糖、果糖和酒精度分別為9.21 g/L、5.06 g/L和5.2%vol；乳酸從0.18mg/m L增加至4.00mg/m L、琥珀酸從0.17mg/m L增加至0.87mg/m L，酒石酸和蘋果酸從32.09mg/L和1.23mg/m L下降至0；總酚含量從39.95mg GAE/m L逐漸升高至67.89mg GAE/m L。另外，低醇度椰子水的抗氧化活性也有較大的改善，F(xiàn)RAP值從290.07μmol/L FeSO4上升至432.36μmol/L FeSO4，ABTS+·清除率從15.77%上升至69.84%，且相關(guān)性分析表明抗氧化活性升高歸因于總酚含量的升高。

椰子水；發(fā)酵；成分分析；抗氧化活性

椰子水是存在于椰子果實腔內(nèi)的一種天然果汁，富含糖類、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)元素，是一種天然的功能性礦物飲料[1-2]。最新報道顯示，椰子水中的兒茶酸和表兒茶酸表現(xiàn)出很強的抑菌、抗氧化及抗癌等活性[3]。另外，GE L等[4]發(fā)現(xiàn)椰子水中含有大量的細胞分裂素（植物生長激素），長期飲用有助于延遲人類皮膚細胞的老化。椰子水中的營養(yǎng)元素與其成熟度密切相關(guān)，如成熟椰子水含有較多的蛋白質(zhì)和無機鹽，成熟度從7個月到9個月，椰子水的pH值從4.7上升至5.5[5]。有關(guān)嫩椰子水的研究較多，成熟椰子水的報道相對較少[2]。但是，工業(yè)生產(chǎn)所用的原料均為成熟椰子。不像嫩椰子水的酸甜可口，成熟椰子水較為酸澀，不宜直接飲用[6]。因此，工業(yè)生產(chǎn)中的成熟椰子水除了少部分用作發(fā)酵椰纖果的培養(yǎng)基外，絕大部分作為廢棄物丟棄，造成了大量的資源浪費，同時也對環(huán)境產(chǎn)生了不同程度的污染[7-10]。

微生物發(fā)酵技術(shù)是改善物料風味和品質(zhì)、增加營養(yǎng)價值和生物利用率的重要手段之一。近十年來，發(fā)酵飲料已成為研究熱點。通過微生物發(fā)酵，不但可以改變其原有的風味，成分組成和活性同樣會產(chǎn)生不同程度的變化。PRADO FC等[11]采用植物乳桿菌發(fā)酵椰子水制得的飲料風味最佳，MUKISA IM等[12]采用乳酸菌發(fā)酵高粱麥芽，從發(fā)酵產(chǎn)物中成功分離出一種有機風味成分，WATAWANA M I等[13]采用紅茶真菌發(fā)酵椰子水7 d后，總酚含量升高，發(fā)酵椰子水的抗氧化能力和抑制淀粉水解酶活性都明顯升高。國內(nèi)也有以麩皮紅棗汁、南瓜、甜玉米等為對象制備相應的發(fā)酵飲料的報道[14-16]。但是，酵母菌發(fā)酵過程中成熟椰子水的成分變化以及抗氧化活性方面的研究還少見報道。

本研究選用發(fā)酵能力較強的釀酒酵母（Saccha romyces cerevisiae）DV10對成熟的椰子水進行發(fā)酵，制備低醇度椰子水飲料，探討發(fā)酵過程中還原糖、總酚和有機酸含量的變化，并對其抗氧化活性進行分析（鐵離子還原能力（ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP）和2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）自由基清除率），旨在改善成熟椰子水的營養(yǎng)價值，擴大其應用范疇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 活性干酵母和椰子水

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DV10：加拿大拉曼公司，使用前用5%的蔗糖水在42℃活化30m in。椰子水取自新鮮的椰子：海南泰豐源公司，椰子破殼后分別用濾布和硅藻土進行過濾，得到澄清的椰子水，經(jīng)測定椰子水的糖度為4.4°Bx，pH值為5.83。

1.1.2 化學試劑

標準品（葡萄糖、果糖、草酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等）以及和福林酚試劑（分析純）：上海索萊寶生物科技有限公司；ABTS、三吡啶三吖嗪（tripyridyl-triazine，TPTZ）：日本TCI公司；一水沒食子酸（gallic acidmonohydrate，GAM）標準品：美國Sigma公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；Fresco 17超高速離心機：美國賽默飛世爾公司；PAL-1手持折光儀：日本愛拓公司；FE20 pH計：梅特勒-托利多公司；DA-130N酒精計：日本京都電子工業(yè)株式會社；1200、1260高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 低醇度椰子水飲料發(fā)酵

過濾后的椰子水用蔗糖調(diào)節(jié)糖度至10°Bx，置于90℃水浴中加熱10m in，冷卻后添加0.02%偏重亞硫酸氫鈉，取2 L裝入已滅菌的3 L發(fā)酵罐中。按體積分數(shù)5%的接種量將活化好的酵母接種到發(fā)酵液后，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱，發(fā)酵10 d，當酒精度穩(wěn)定后結(jié)束發(fā)酵，每隔24 h取樣測定發(fā)酵液中的還原糖、總酚、有機酸含量及其抗氧化活性。

1.3.2 還原糖含量的測定

還原糖含量的測定參照MORALESP等[17]的方法。于25m L的錐形瓶中加入預處理好的大孔樹脂D301R（3.0 g）和10m L的樣品，50℃水浴條件下恒溫攪拌2h。然后4 000×g離心10min，取上清液過0.45μm水系濾膜后，用高效液相色譜法測定還原糖含量。色譜條件為ZORBAX色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），示差折光檢測器。流動相為乙腈和超純水（75∶25，V/V），流速1.0m L/min，柱溫35℃，進樣量5μL。洗脫時間15m in，后洗脫時間5m in，實驗重復3次。根據(jù)保留時間定性，并配制不同濃度果糖和葡萄糖標準品繪制標準曲線。

1.3.3 酒精含量的測定

發(fā)酵液蒸餾后用酒精計測定酒精度。

1.3.4 總酚的測定

總酚含量的測定采用福林酚分光光度法[18]。具塞試管中依次加入0.5m L樣品、3.0m L水和0.2m L福林酚試劑，混勻后室溫下在避光保存5min；然后加入1.3m L 10%的Na2CO3溶液，混勻后室溫下避光靜置90min。最后在波長765 nm條件下測定混合液的吸光度值。標準曲線的測定以一水沒食子酸作為標準品，最終結(jié)果以沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）表示（單位：mg GAE/m L）。按照標準曲線回歸方程計算樣品中總酚含量。

1.3.5 鐵離子還原能力的測定

FRAP值的測定參考ESCUDERO-LOóPEZB等[7]的方法。FRAP工作液由0.3mol/L醋酸鈉溶液（pH 3.6）、20mmol/L六水氯化鐵溶液和10 mmol/L三吡啶三吖嗪（2,4,6-Tri (2-pyridinyl)-s-triazine，TPTZ）溶液混合而成（醋酸鹽緩沖液∶六水氯化鐵∶TPTZ=10∶1∶1，V/V）。具塞試管中加入0.5m L樣品和3.5m LFRAP工作液，搖勻后室溫下避光放置30m in。最后在波長593 nm條件下測定混合液的吸光度值，實驗重復3次。FRAP標準曲線的測定以七水硫酸亞鐵溶液作為標準物，最終結(jié)果以當量μmol/LFeSO4表示。

1.3.6 ABTS自由基清除能力的測定

ABTS自由基清除能力的測定參照CHANDRASEKARA N等[19]的方法。配制7.4mmol/LABTS溶液和2.6mmol/L過硫酸鉀溶液，混合后制成ABTS工作母液。ABTS工作母液于室溫下避光存放12～16 h，使用前用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）進行稀釋。要求ABTS工作液的吸光度值減去PBS空白對照后，A734nm值為0.7±0.05。準確量取0.2m L的各樣品溶液與3.8m L的ABTS工作液于具塞試管中，輕輕混勻，反應2～6m in后于波長734 nm處測定其吸光度值。實驗同時設(shè)試劑空白和樣品空白，重復3次。ABTS自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為未加樣的ABTS的吸光度值；A1為樣品與ABTS反應后的吸光度值。

1.3.7 有機酸的測定

有機酸的測定參考COELHO EM等[20]的方法。采用ZORBAX SB-Aq StableBond型色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），二極管陣列檢測器，檢測器波長為210 nm，洗脫時間15min，后洗脫時間5min，試驗重復3次。色譜條件為：流動相由磷酸二氫鉀緩沖液（0.02mol/L，pH 2.60）和甲醇（97∶3）組成，流速1.0m L/min，柱溫30℃，進樣量10μL，沖洗方式為等度洗脫。根據(jù)保留時間定性并分別配制不同濃度的草酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸繪制標準曲線。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析方法

所有結(jié)果均使用DPS 6.5數(shù)據(jù)分析軟件進行方差分析，結(jié)果以平均值±標準差表示。采用Origin 9.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中還原糖含量和酒精度的變化

低醇度椰子水發(fā)酵過程中還原糖含量和酒精度含量的變化如圖1所示。由圖1可知，未發(fā)酵的椰子水中果糖和葡萄糖含量分別為3.77 g/L和9.25 g/L，還原糖含量約1.30%，與劉敏[21]測得的成熟果齡椰子水中的還原糖含量相近。由圖1可知，發(fā)酵結(jié)束后，葡萄糖和果糖的質(zhì)量濃度為9.26 g/L和5.06 g/L；在發(fā)酵第2 d時，還原糖的含量最高為108.45 g/L；第3天時大部分還原糖被消耗轉(zhuǎn)化為酒精，酒精度緩慢增加至5.2%vol。另外，發(fā)酵前葡萄糖含量為9.25g/L，高于果糖含量3.77 g/L，但發(fā)酵到第2天時，葡萄糖的含量（55.80 g/L）卻少于果糖的含量（62.09 g/L），說明發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗速率大于果糖的消耗速率，相比于果糖，葡萄糖是釀酒酵母生長和發(fā)酵過程中的優(yōu)先能源[22]。LU Z等[23]用釀酒酵母發(fā)酵黃瓜汁時也得出類似的結(jié)論。

圖1 發(fā)酵時間對成熟椰子的水中還原糖含量(a)和酒精度(b)的影響Fig.1 Effect of fermentation tim e on the reducing sugar contents(a) and alcoho lcontent(b)ofm ature coconut drink

2.2 發(fā)酵過程中總酚含量的變化

椰子水發(fā)酵過程中總酚含量的變化如圖2所示。由圖2可知，發(fā)酵椰子水中的總酚含量呈先增加后減少的趨勢，在生長對數(shù)期內(nèi)快速增加（前4 d從39.95上升至80.02mg GAE/m L），進入穩(wěn)定期后則逐漸下降（從最高值80.02mg GAE/m L下降至67.89mg GAE/m L）。發(fā)酵后總酚含量增加可能原因是由真菌β-葡萄糖苷酶誘導β-糖苷鍵水解而釋放出能夠與福林酚試劑反應的酚類[24]。進入穩(wěn)定期后其總酚含量下降，則主要是因為通過氧化酶釋放的酚類發(fā)生聚合反應，當營養(yǎng)物耗竭時真菌受到脅迫而誘導該反應激活[25]。DULFFV等[24]發(fā)酵青梅果副產(chǎn)物時候也得到類似的結(jié)論。

圖2 發(fā)酵時間對成熟椰子的水中總酚含量的影響Fig.2 Effect of fermentation tim e on totalphenolic content of mature coconut drink

2.3 發(fā)酵過程中有機酸的變化

低醇度椰子水發(fā)酵過程中有機酸含量的變化如表1所示。由表1可知，與未發(fā)酵的椰子水相比，發(fā)酵后的椰子水有機酸的含量顯著增加。其中，丙酮酸從0.01mg/m L增加至0.49mg/m L、乳酸從0.18mg/m L增加至4.00mg/m L、檸檬酸從0.03mg/m L增加至0.09mg/m L，琥珀酸從0.17mg/m L增加至0.87mg/m L。同時，在發(fā)酵過程中一部分有機酸因被消耗而減少，如草酸、酒石酸、蘋果酸和乙酸。有機酸含量的變化對椰子水的風味、口感、pH以及各類化學物質(zhì)的平衡均起到重要的作用[26]。

發(fā)酵過程中，進入穩(wěn)定期之前產(chǎn)生并積累了較多的丙酮酸，發(fā)酵結(jié)束后一部分被消耗和利用，使得低醇度椰子水中的丙酮酸含量有所下降，總體來說，發(fā)酵后丙酮酸的含量顯著增加（P＜0.05）。在劉曉艷等[27]的研究中，荔枝酒發(fā)酵過程丙酮酸也是呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。

發(fā)酵過程中酒石酸和乙酸的量均呈現(xiàn)下降趨勢，可能是因為乳酸菌能降解酒石酸產(chǎn)生乳酸和乙酸，但是乙酸易揮發(fā)，因此含量極少[28]。檸檬酸是酒精發(fā)酵的產(chǎn)物之一，所以發(fā)酵椰子水中的檸檬酸含量明顯增加；酒精發(fā)酵之后的蘋果酸-乳酸發(fā)酵可將蘋果酸轉(zhuǎn)化為酒精或者乳酸[29]，所以蘋果酸的含量從1.23mg/m L降低至0，而乳酸的含量則從0.18mg/m L上升至4.00mg/m L。琥珀酸含量的增加則主要歸因于酵母發(fā)酵過程中酶解反應[30]。

表1 發(fā)酵時間對成熟椰子的水中有機酸含量的影響Table 1 Effect of fermentation tim e on the organic acid contents ofmature coconut drink

2.4 低醇度發(fā)酵對椰子水抗氧化活性的影響

發(fā)酵過程中低醇度椰子水的抗氧化活性的變化用FRAP和ABTS值三個特征指標進行表征，結(jié)果見圖3。由圖3可知，發(fā)酵后椰子水的鐵離子還原能力顯著升高（P＜0.05），中間經(jīng)歷了一個先增加（從290.07μmol/LFeSO4上升至542.20μmol/LFeSO4）后下降降至432.36μmol/LFeSO4的過程。發(fā)酵后期鐵離子還原能力逐漸下降可能是由總酚含量的下降引起的，ESCUDERO-LóPEZ B等[7]用酵母發(fā)酵橙汁，結(jié)果表明鐵離子還原能力與總酚含量具有顯著的相關(guān)性。NEGIB等[31]用釀酒酵母和東方伊薩酵母發(fā)酵沙棘果汁，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的沙棘果汁具有更高的鐵離子還原能力。發(fā)酵成熟椰子水ABTS自由基清除率明顯升高（P＜0.05），從15.77%上升至69.84%（第10天）。據(jù)報道，發(fā)酵果蔬汁也得到類似的結(jié)果。如SANDHU K S等[32]發(fā)酵小麥汁后其ABTS自由基清除能力顯著升高。相關(guān)性分析顯示，總酚含量與抗氧化活性（FRAP與ABTS值）之間相關(guān)性極其顯著（P＜0.01），其相關(guān)系數(shù)分別為0.811和0.879?？寡趸钚缘奶岣咧饕獨w因于總酚含量的提高[29]。

圖3 成熟椰子的水抗氧化能力隨發(fā)酵時間的變化Fig.3 Changes of antioxidantactivity ofmature coconut drink with fermentation tim e

3 結(jié)論

經(jīng)酵母發(fā)酵后的成熟椰子水在成分和抗氧化活性均顯著變化。發(fā)酵結(jié)束后酒精度為5.2%vol，總酚含量（從39.95mg GAE/m L顯著升高至67.89mgGAE/m L）和抗氧化活性都顯著升高，F(xiàn)RAP值從290.07μmol/LFeSO4上升至432.36μmol/L FeSO4，ABTS+·清除率從15.77%上升至69.84%。乳酸（從0.18增加至4.00mg/m L）、琥珀酸（從0.17增加至0.87mg/m L）、檸檬酸（從0.03增加到0.09mg/L）和丙酮酸（從0.01增加至0.49mg/m L）等有機酸的含量顯著升高，對酒體風味的改善有著重要的意義。發(fā)酵后的低醇度椰子水，可直接飲用也可進一步調(diào)配，顏色喜人，風味良好，是解決椰子水資源浪費和環(huán)境污染的新途徑，同時還有助于提高成熟椰子的附加值。

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Componentsand antioxidantactivity of coconutdrinkw ith low-alcoholcontent

ZHANGGuanfei,HE Jingru,CHENWeijun,CHENWenxue,MA Chao,LIU Xue,CHEN Haim ing*
(College ofFood Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

Fermented coconutdrink w ith low-alcohol contentwasproduced by Saccharomycescerevisiae DV10.The variation of reducing sugar,total phenolic,organic acids contents and antioxidant activity ofmatured coconut drink during fermentation was determined.Results showed that the components and antioxidantactivity of the fermented coconut drink were significantly influenced by fermentation.After fermentation for 10 d,the glucose content,fructose contentand alcoholcontentof coconutdrinkw ith low-alochol contentwere9.21 g/L,5.06 g/L and 5.2%vol,respectively.The lactic acid contentincreased to 4.00mg/m l from 0.18mg/m l,succinic acid increased to 0.87mg/m l from 0.17mg/m l,tartaric acid decreased to 0 from 32.09mg/L andmalic acid decreased to 0 from 1.23mg/m l,totalphenolic content increased to 67.89mg GAE/m l from 39.95mgGAE/m l.Inaddition, theantioxidantactivity of coconuedrink with low-alochol contentwasalso improved obviously.FRAPvalueand ABTSscavenging rate increased to 432.36μmol/LFeSO4and 69.84%from 290.07μmol/LFeSO4and 15.77%,respectively.Moreover,a seriesof correlation analysisdemonstrated that the increaseofantioxidantactivity could beattributed to the riseof totalphenolic contents.

coconutdrink;fermentation;compositionalanalysis;antioxidantactivity

TS262.7

0254-5071（2017）08-0144-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.031

2017-06-13

海南省自然科學基金（317002）；海南省重點實驗室和工程技術(shù)研究中心建設(shè)專項（gczx2015004）；海南大學科研啟動項目（kyqd1630）

張觀飛（1989-），男，碩士研究生，研究方向為熱帶農(nóng)產(chǎn)品加工。

*通訊作者：陳海明（1984-），男，講師，博士，研究方向為熱帶農(nóng)產(chǎn)品加工。