任勰珂，陳莉*，盧紅梅，賈青慧

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；3.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025）

響應(yīng)面法優(yōu)化薏仁米糠蛋白堿提工藝的研究

任勰珂1，2，陳莉1，3*，盧紅梅1，3，賈青慧2，3

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；3.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025）

該試驗(yàn)以貴州興仁縣產(chǎn)純種小薏仁米米糠作為研究對(duì)象，采用堿提酸沉法提取薏仁米糠中的蛋白質(zhì)?？疾炝弦罕取A提溫度、堿提時(shí)間、堿提pH對(duì)蛋白提取率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立各因素對(duì)提取率的二次多項(xiàng)式回歸預(yù)測(cè)模型，確定最佳堿提工藝參數(shù)。結(jié)果表明，堿提酸沉法提取薏仁米糠蛋白最佳提取工藝為料液比1∶22（g∶m L），堿提溫度45.5℃，堿提時(shí)間3 h，堿提pH9.6，平均蛋白提取率為78.9%。

薏仁米糠蛋白；提取率；堿提酸沉法；響應(yīng)面優(yōu)化

薏仁米在加工成精米的過(guò)程中需去掉外殼和占總質(zhì)量10%左右的種皮和胚[1]，種皮和胚加工制成的米糠是薏仁米加工的主要副產(chǎn)品[2]。米糠在國(guó)外被稱為“天賜營(yíng)養(yǎng)源”[3]，含有米糠蛋白、米糠油、米糠多糖、米糠植酸鈣等多種營(yíng)養(yǎng)成分[4-6]，具有較高的保健開(kāi)發(fā)價(jià)值。貴州省薏仁米資源豐富，但目前大多加工企業(yè)還屬于粗放型加工，精深加工缺乏，生產(chǎn)設(shè)備落后、技術(shù)不完善[7]，大量的糠殼等副產(chǎn)物僅作為低值產(chǎn)品直接處理銷售[8]，綜合利用不充分，給薏仁米生產(chǎn)加工企業(yè)造成了較大損失。

本研究采用貴州興仁縣產(chǎn)純種小薏仁米米糠作為研究對(duì)象，采用堿提酸沉法提取薏仁米糠中的蛋白質(zhì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化堿提酸沉法提取工藝，確定最佳提取工藝參數(shù)，用Design-Expert軟件建立各因素對(duì)提取率的二次多項(xiàng)式回歸預(yù)測(cè)模型，以期為薏仁米糠蛋白的提取和利用提供依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，對(duì)推動(dòng)貴州省薏仁米產(chǎn)業(yè)向精深加工方向發(fā)展具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

薏仁米糠：貴州興仁縣興誠(chéng)華英食品有限公司，將薏仁米糠粉碎后（粉碎度為50～300目）用30～60℃沸程的石油醚以1∶3（mg/m L）的比例在室溫條件下振蕩脫脂3 h，過(guò)濾，并用石油醚沖洗，放于通風(fēng)廚中風(fēng)干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、硼酸、濃鹽酸、濃硫酸、石油醚、硫酸鉀等（均為分析純）、牛血清白蛋白（生化試劑）：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司。

雙縮脲試劑：1.5 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0 g的酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）溶于500m L蒸餾水中，在攪拌條件下加入300m L 10%NaOH溶液，用水稀釋至1 000m L，此試劑可長(zhǎng)期保存。

1.2 儀器與設(shè)備

SH220石墨消解儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；CMD-20X恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上?，槴\試驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-b型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；ZD-2A自動(dòng)電位滴定儀：上海大普儀器有限公司；FW-80萬(wàn)能粉碎機(jī)：上海仕元科學(xué)器材有限公司；722S可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；80-2電動(dòng)離心機(jī)：常州澳華儀器有限公司；CJJ-781磁力加熱攪拌器：城西曉陽(yáng)電子儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 薏仁米糠蛋白提取工藝流程

脫脂薏仁米糠→堿液浸泡提取→離心→上清液等電點(diǎn)沉淀→靜置、離心→沉淀物→水洗至中性→真空干燥→薏仁米糠蛋白

1.3.2 單因素試驗(yàn)

固定其他條件不變，分別考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶m L））；堿提pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0）；堿提溫度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃）；堿提時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h）對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以薏仁米糠蛋白提取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)[9]，對(duì)堿提pH（A）、堿提溫度（B）、堿提時(shí)間（C）、料液比（D）進(jìn)行響應(yīng)面分析，因素與水平如表1所示。再用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，對(duì)所得模型進(jìn)行失擬性檢驗(yàn)、方差分析[10]，確定堿提酸沉法提取薏仁米糠蛋白的最佳工藝條件。

表1 堿提酸沉法提取薏仁米糠蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction conditions optim ization o f adlay bran protein by alkaliextraction and acid precipitation method

1.3.4 測(cè)定方法

薏仁米糠蛋白等電點(diǎn)的確定：取蛋白提取液20m L，用15%HCl溶液調(diào)節(jié)pH值分別為3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0，4 000 r/min離心15min，采用雙縮脲法測(cè)出各上清液的蛋白含量，以pH為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)量濃度（mg/m L）為縱坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)量濃度-pH標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蛋白含量：參照參考文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。蛋白提取率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 薏仁米糠蛋白等電點(diǎn)確定

2.1.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum album in

由圖1可知，牛血清白蛋白質(zhì)量濃度在0～10mg/m L范圍內(nèi)與吸光度值具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.053 7x-0.008 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

2.1.2 薏仁米糠蛋白等電點(diǎn)測(cè)定

圖2 薏仁米糠蛋白等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determ ination resu lts of isoelectric point of adlay bran protein

由圖2可知，蛋白提取液在不同pH條件下，經(jīng)離心沉淀后，當(dāng)pH值為4.2時(shí)上清液中殘留的蛋白質(zhì)量濃度最低，為2.526mg/m L，表明在此pH條件下大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)沉淀，因此薏仁米糠蛋白等電點(diǎn)為pH4.2。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響

由圖3可知，隨著料液比的增加，薏仁米糠蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在料液比為1∶10（g∶m L）時(shí)，提取率最低為46.99%；在料液比為1∶20（g∶m L）時(shí)，薏仁米糠蛋白提取率達(dá)最大值為76.63%，這可能是因?yàn)樵诹弦罕容^低時(shí)，提取液黏度較大，分子擴(kuò)散速率較低，則蛋白分子溶出率低，導(dǎo)致提取率較低；隨著料液比的增大，提取液黏度降低，蛋白分子溶出率增加，提取率增加[18]。繼續(xù)增大料液比，蛋白提取率反而下降。因此選擇料液比為1∶20（g∶m L）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 料液比對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.3 Effect ofm aterial-liquid ratio on extraction rate of ad lay bran protein

2.2.2 堿提pH對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響

圖4 堿提pH對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of alkaliextraction pH on extraction rate of adlay bran protein

由圖4可知，隨著堿提pH值的增加，薏仁米糠蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。在pH值為7.5時(shí)，薏仁米糠蛋白提取率較低；當(dāng)pH值為9.5時(shí)，薏仁米糠蛋白提取率達(dá)到最高為77.04%，可能是因?yàn)檗踩拭卓返鞍字写罅康亩蜴I和疏水基團(tuán)使其溶解性下降，而堿液對(duì)蛋白質(zhì)分子中氫鍵具有破壞作用，并可使某些極性基團(tuán)發(fā)生解離，使蛋白質(zhì)表面分子帶相同電荷，從而提高蛋白質(zhì)分子的溶出，所以隨著pH的不斷增大，薏仁米糠蛋白的提取率也不斷增大[12]。但pH過(guò)高，會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)量造成不良影響，降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此選擇堿提pH為9.5進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 堿提溫度對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響

由圖5可知，隨著堿提溫度的升高，薏仁米糠蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在35～45℃時(shí)，隨著溫度的增加，薏仁米糠蛋白提取率增加，當(dāng)堿提溫度為45℃時(shí)，薏仁米糠蛋白提取率達(dá)到最高為48.54%；繼續(xù)升高堿提溫度，薏仁米糠蛋白提取率有所下降，這可能是熱動(dòng)能的增加，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)、非極性集基團(tuán)暴露，聚集和沉降作用使蛋白溶解度降低[13]。因此選擇堿提溫度為45℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 堿提溫度對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of alkaliextraction temperature on extraction rate of adlay bran protein

2.2.4 堿提時(shí)間對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響

圖6 堿提時(shí)間對(duì)薏仁米糠蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of a lkaliextraction time on extraction rate o f ad lay bran protein

由圖6可知，隨著提取時(shí)間的增加，薏仁米糠蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)堿提時(shí)間為3.0 h時(shí)，薏仁米糠蛋白提取率達(dá)到最高為57.05%；繼續(xù)延長(zhǎng)堿提時(shí)間，薏仁米糠蛋白提取率逐漸降低。出現(xiàn)這樣的變化趨勢(shì)可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，薏仁米糠蛋白不斷被溶出，提取率不斷增加，達(dá)到一定的時(shí)間，溶解量達(dá)到最大值，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，部分蛋白發(fā)生水解，導(dǎo)致提取率降低[14-16]。因此選擇堿提時(shí)間為3.0 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得料液比（A）、堿提pH（B）、堿提溫度（C）、堿提時(shí)間（D）的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=82.71+3.54A+1.47B+0.65C+ 2.46D+1.76AB-0.25AC-0.81AD-1.13BC-0.21CD-4.18A2-8.48B2-4.36C2-8.24D2。

由表4、表5可知，對(duì)所得模型進(jìn)行失擬性檢驗(yàn)、方差分析顯示：該模型的一次項(xiàng)和交互項(xiàng)顯著（P＜0.05），平方項(xiàng)和立方項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。在本試驗(yàn)所涉及范圍內(nèi)，模型的P值＜0.000 1，模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.109 0＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，方程擬合不足，檢驗(yàn)不顯著，無(wú)其他因素影響本試驗(yàn)，說(shuō)明該模型能夠較好的反應(yīng)各個(gè)因素的變化對(duì)薏仁米糠蛋白提取率造成的影響。由F值可得，各個(gè)因素對(duì)蛋白提取率影響的主次順序?yàn)椋毫弦罕龋緣A提時(shí)間＞堿提pH＞堿提溫度。各系數(shù)方差分析結(jié)果表明，料液比、堿提pH影響極顯著（P＜0.01），堿提時(shí)間影響顯著，堿提溫度影響不顯著；在交互作用中，堿提pH和堿提溫度交互作用顯著（P＜0.05），其他交互作用均不顯著（P＞0.05）；在二次項(xiàng)中，堿提pH、堿提溫度、堿提時(shí)間、料液比影響都極顯著（P＜0.01）。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

表4 模型的失擬性檢驗(yàn)Table 4 Loss-faulty determ ination of the model

表5 二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 5 Variance analysis of quadratic polynom ialm odel

2.3.2 響應(yīng)面最優(yōu)結(jié)果

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量間的交換作用以及確定最優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)Design-ExpertV8.0.6軟件繪制響應(yīng)面曲線圖進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知，6組以薏仁米糠蛋白提取率為響應(yīng)值的趨勢(shì)圖，其等高線圖可直觀反應(yīng)出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩因素交互作用顯著。由圖7可知堿提pH和堿提溫度的交互作用對(duì)蛋白提取率的影響最為顯著（P＜0.05）。以蛋白提取率最大為目標(biāo)，應(yīng)用響應(yīng)面分析軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)各因素在試驗(yàn)范圍內(nèi)進(jìn)行最優(yōu)化處理，得到薏仁米糠蛋白堿提酸沉法最佳提取工藝為料液比1∶21.74（g∶m L），酶解溫度45.49℃，堿提時(shí)間2.96 h，堿提pH9.62，在此條件下薏仁米糠蛋白平均提取率為80.39%。

2.3.3 最佳工藝條件的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的最佳工藝條件的準(zhǔn)確性，并且為了方便實(shí)際操作，將提取工藝修正為料液比1∶22（g∶m L），堿提溫度45.5℃，堿提時(shí)間3 h，堿提pH 9.6。在上述最佳工藝條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到薏仁米糠蛋白提取率分別為78.2%、79.3%，79.2%，平均提取率為78.9%，與模型理論值相接近。說(shuō)明利用該模型可以較好的預(yù)測(cè)薏仁米糠蛋白的提取條件。

圖7 料液比、堿提時(shí)間、堿提pH、堿提溫度交互作用對(duì)薏仁米糠蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between material-liquid ratio,alkaliextraction time, pH and temperature on extraction rate of adlay bran protein

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用薏仁副產(chǎn)物—薏仁米糠，通過(guò)堿提酸沉法提取薏仁米糠蛋白。運(yùn)用Design-Expert建立各因素對(duì)提取率的二次多項(xiàng)式回歸預(yù)測(cè)模型，并提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。試驗(yàn)表明料液比、堿提pH影響極顯著（P＜0.01），堿提時(shí)間影響顯著（P＜0.05），堿提pH和堿提溫度交互作用顯著P＜0.05），這幾個(gè)因素對(duì)蛋白提取率的影響非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。經(jīng)回歸分析及檢驗(yàn)表明，此法合理可行，最佳工藝條件為料液比1∶22（g∶m L），堿提溫度45.5℃，堿提時(shí)間3 h，堿提pH 9.6。此最佳條件下平均蛋白質(zhì)提取率為78.9%。

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Optim ization ofalkaliextraction processofadlay bran protein by response surfacemethodology

REN Xieke1,2,CHEN Li1,3*,LU Hongmei1,3,JIA Qinghui2,3
(1.SchoolofLiquorand Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.College ofChem istry and Chem icalEngineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.Key Laboratory ofFermentation Engineering and BiologicalPharmacy ofGuizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Using the adlay bran from Guizhou Xingren county as research object,the protein in adlay branwasextracted by alkaliextraction and acid precipitationmethod.The effectsofmaterial-liquid ratio,alkaliextraction temperature,timeand pH on protein extraction ratewere investigated.On the basis of single factor experiments,the quadratic polynom ial regressionmodelwas established by 4 factors and 3 levels response surface experimentsoptimizationandmultiple regression fittinganalysis.Theoptimum alkaliextraction conditionswere identified asmaterial-liquid ratio1∶22(g∶m l), alkaliextraction temperature45.5℃,time3 h and pH 9.6.Under the conditions,theaverage protein extraction ratewas78.9%.

adlay bran protein;extraction rate;alkaliextraction and acid precipitationmethod;responsesurfaceoptimization

TS201.3

0254-5071（2017）08-0099-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.022

2017-03-29

貴州省科技合作計(jì)劃（LH[2015]7668）

任勰珂（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。

*通訊作者：陳莉（1981-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。