代為俊，劉旭平，周燕

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

基于MDCK懸浮細(xì)胞生產(chǎn)禽流感疫苗的放大工藝開發(fā)

代為俊，劉旭平，周燕

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

為放大流感疫苗生產(chǎn)工藝至1500 L反應(yīng)器規(guī)模，通過冷模實(shí)驗(yàn)研究了不同體積反應(yīng)器條件下的混合時(shí)間、流體剪切力、體積氧傳遞系數(shù)和二氧化碳傳遞系數(shù)的區(qū)別。在1500 L反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)速為60 r/min，深層通氣速率控制在22.5 L/min能夠較好的滿足供氧需求和提高CO2的移除效果，同時(shí)也避免了剪切力對(duì)細(xì)胞的損傷。在1500 L反應(yīng)器中病毒感染細(xì)胞60 h后，病毒滴度為211HA units/25 μL，單位細(xì)胞病毒產(chǎn)量(Svy)為13145.05 virions/cell，2 L反應(yīng)器的Svy為13298.70 virions/cell，兩者僅相差1.16%。

流感疫苗；MDCK細(xì)胞；生物反應(yīng)器；冷模實(shí)驗(yàn)；放大

傳統(tǒng)的流感疫苗是基于雞胚工藝生產(chǎn)，然而由于其成本高、產(chǎn)量有限、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，已慢慢被淘汰[1]。近年來，基于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)工藝已經(jīng)可以取代雞胚培養(yǎng)工藝，并逐漸成為生產(chǎn)流感疫苗最主要的主流技術(shù)。一些歐美國(guó)家，已經(jīng)批準(zhǔn)基于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的流感疫苗上市[2-4]。MDCK細(xì)胞最適于生產(chǎn)甲型流感病毒和乙型流感病毒的三種細(xì)胞之一[5-6]，可以生產(chǎn)安全有效的人用和獸用疫苗，具有很高的產(chǎn)毒能力。而隨著病毒類疫苗的市場(chǎng)需求量的不斷擴(kuò)大，產(chǎn)能不足使得動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模高密度培養(yǎng)顯得更為重要。在搖瓶到大型生物反應(yīng)器的放大過程中，混合和氣液傳質(zhì)是最關(guān)鍵的問題。與微生物發(fā)酵不同，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)既涉及O2的供應(yīng)速率，又涉及過量CO2積累后的移除速率。O2和CO2傳遞表現(xiàn)出不同的特征，但兩者又都受攪拌轉(zhuǎn)速、深層通氣速率、溫度、裝液量、氣泡直徑的影響，且在不同尺寸反應(yīng)器內(nèi)表現(xiàn)出不同的特征。因此，有必要對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)的研究，通過揭示兩者的氣液傳質(zhì)規(guī)律，指導(dǎo)生物反應(yīng)器內(nèi)氧供應(yīng)和二氧化碳移除策略及生物反應(yīng)器的放大。

本文通過冷模實(shí)驗(yàn)對(duì)反應(yīng)器內(nèi)部流體混合、流體剪切和氣液傳質(zhì)特性進(jìn)行考察，在此基礎(chǔ)上選取關(guān)鍵放大參數(shù)，將2 L反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)和接毒工藝放大至1500 L規(guī)模，并將兩者最后的血凝值(HA)和單細(xì)胞病毒產(chǎn)量Svy相比較，為流感疫苗工藝放大提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、培養(yǎng)基和病毒株 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室對(duì)貼壁型MDCK細(xì)胞進(jìn)行馴化得到的懸浮型MDCK細(xì)胞株。培養(yǎng)基為Driving-M MDCK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，購(gòu)自上海倍諳基生物科技有限公司。病毒株為H9亞型禽流感病毒株，由肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司提供，實(shí)驗(yàn)環(huán)境為P2實(shí)驗(yàn)室。

1.2 冷模實(shí)驗(yàn)材料 1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液。測(cè)試培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

1.3 冷模實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法

1.3.1 混合時(shí)間測(cè)定方法 反應(yīng)器內(nèi)混合特性常用混合時(shí)間tmix表征，即反應(yīng)器內(nèi)流體混合均勻性達(dá)到95%所需的時(shí)間[7]。將LB培養(yǎng)基加入到反應(yīng)器內(nèi)，控制一定條件。在反應(yīng)器的頂部和底部對(duì)角位置分別裝上一個(gè)pH電極，穩(wěn)定時(shí)記錄初始值pHi。

本實(shí)驗(yàn)從反應(yīng)器的上端(遠(yuǎn)離pH電極)迅速加入V0體積的示蹤劑(1 mol/L NaOH，V0<0.5%V)，分別記錄反應(yīng)器上下pH隨時(shí)間的變化。pH電極記錄下的原始數(shù)據(jù)用公式(1)進(jìn)行歸一化處理，其中H(t)為標(biāo)準(zhǔn)化pH，pH(t)為實(shí)時(shí)pH，pHi為初始pH值，pHf為最終pH。當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)的流體完全混合均勻，則穩(wěn)定后的H(t)值為1.0。實(shí)際上，當(dāng)H(t)=1.0±0.5時(shí)，即可認(rèn)為混合均一。

t1、t2分別表示上下兩個(gè)電極測(cè)得混合均勻度達(dá)95%時(shí)所需的時(shí)間，混合時(shí)間tmix可表示

tmix=(t1+t2)/2 (2)

在反應(yīng)器內(nèi)加入等量1 mol HCl，調(diào)整測(cè)試培養(yǎng)至初始狀態(tài)；重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

按照上述方法，分別測(cè)定不同操作條件下的tmix。

1.3.2 體積氧傳質(zhì)系數(shù)(kLa)的測(cè)定[7-8]校正溶氧電極。將測(cè)試培養(yǎng)基加入到反應(yīng)器內(nèi)，設(shè)置一定操作參數(shù)。底層通氮?dú)?，排凈培養(yǎng)基中的氧氣(實(shí)際只需DO<10%即可)。轉(zhuǎn)換到深層通氣為空氣，記錄不同時(shí)刻的DO，直至DO>60%后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，繪制DO-t(10%≤DO≤60%)曲線。通過以下公式計(jì)算氣液傳質(zhì)系數(shù)kLa：

積分，得

其中，C0為初始氧濃度，Ct為t時(shí)刻的氧濃度，C*為飽和氧濃度。

利用對(duì)t做曲線，斜率即為kLa。

1.3.3 剪切力，渦流尺寸，葉端速率的計(jì)算 剪切力和渦流尺寸的計(jì)算公式如下[9]：

τk=ρL(εv)1/2，τik=ρL(εiv)1/2(6)

η=(v3/ε)1/4，ηi=(v3/εi)1/4(7)

當(dāng)V=D3時(shí)，εi、τik和ηi分別為局部能量耗散率、局部剪切力和局部湍流尺寸。式中，ε為單位體積內(nèi)的能量耗散率(W/kg)，V為反應(yīng)器中的液體體積(m3)，ρL為液體密度(kg/m3)，NP為功率準(zhǔn)數(shù)，N為轉(zhuǎn)速(s-1)，D為攪拌槳直徑(m)，ν為流體的運(yùn)動(dòng)粘度(m2/s)。

UT=πND(8)

其中，UT為葉端速率，N為轉(zhuǎn)速。

1.3.4 CO2傳質(zhì)系數(shù)的測(cè)定[7-8]先通CO2至反應(yīng)器內(nèi)pCO2>150 mmHg。改通空氣并開始計(jì)時(shí)。記錄pCO2隨時(shí)間的變化曲線。直到pCO2<100 mmHg停止實(shí)驗(yàn)。

CO2氣液傳質(zhì)系數(shù)的計(jì)算方法與O2相似，公式為：

其中，C*為飽和二氧化碳濃度。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

1.4.1 種子細(xì)胞復(fù)蘇 取出液氮罐中凍存的懸浮MDCK種子細(xì)胞，置于37 ℃水浴槽中快速孵化，離心棄上清，使用新鮮無血清培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞重懸，以0.8×106～1.0×106cells/mL的密度在125 mL的搖瓶?jī)?nèi)復(fù)蘇。每隔48 h，使用新鮮培養(yǎng)基以1︰3～1︰4(V/V)比例進(jìn)行稀釋傳代。

1.4.2 2 L反應(yīng)器種子培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的全懸浮MDCK細(xì)胞，以2.0×106cells/mL的活細(xì)胞密度接種至反應(yīng)器，培養(yǎng)體積為2 L。反應(yīng)器操作如下，pH為7.0，DO為40%空氣飽和度，溫度為37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為120 r/min。當(dāng)密度達(dá)到8.0×106cells/mL時(shí)，種子細(xì)胞懸液以1∶3～1∶4(V/V)比例稀釋，放大到下一級(jí)種子細(xì)胞反應(yīng)器中。30 L反應(yīng)器種子由2 L反應(yīng)器提供，200 L反應(yīng)器由30 L反應(yīng)器提供，500 L反應(yīng)器種子由200 L反應(yīng)器提供，1500 L反應(yīng)器種子由500 L反應(yīng)器提供。

1.4.3 反應(yīng)器接毒培養(yǎng) 當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至9.0×106～10.0×106cells/mL時(shí)，添加新鮮的Driving-M MDCK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度維持在6.0×106cells/mL，并且按照MOI=0.001接入病毒種子液進(jìn)行培養(yǎng)。TPCK-胰酶終濃度為5 μg/mL。同時(shí)，反應(yīng)器的參數(shù)也進(jìn)行變化，溫度為34 ℃，pH為7.2±0.2。培養(yǎng)過程中，每隔24 h取樣計(jì)數(shù)，培養(yǎng)懸液經(jīng)10000 r/min離心5 min后取上清于-20 ℃保存，用于病毒滴度檢測(cè)。

1.5 病毒滴度測(cè)定 測(cè)定流感病毒血凝滴度(HA滴度)所用血凝板是“U”形底96微孔反應(yīng)板自左至右各孔以微量移液器加入25 μL生理鹽水；于左側(cè)第1孔加25 μL病毒樣品，混勻后吸25 μL至第2孔，依次2倍比系列稀釋至第11孔，吸棄25 μL，第12孔為無病毒陰性對(duì)照；自右至左(防止竄孔)依次向各孔加入1.0% (V/V)雞紅細(xì)胞懸液(約5×107cells/mL)25 μL，振蕩混勻，室溫靜置30 min左右后觀察結(jié)果。

1.6 單位細(xì)胞產(chǎn)毒量的計(jì)算 單位細(xì)胞的產(chǎn)毒量(Svy)表征單個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)毒能力[10]，通過以下公式計(jì)算：

其中，RBC是雞紅細(xì)胞的密度(RBC/mL)，HA是病毒的血凝值(HA units/25 μL)，Xv是活細(xì)胞密度(106cells/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物反應(yīng)器中流體的混合時(shí)間 26.7 ℃ 50 r/min條件下1500 L反應(yīng)器的混合時(shí)間如圖1所示。從中可以看出當(dāng)堿加入反應(yīng)器時(shí)，頂部的pH會(huì)有一個(gè)突躍，隨后下降，而底部的pH反應(yīng)較慢但一直持續(xù)上升，直至達(dá)到均勻。頂部與底部的混合時(shí)間差異明顯，頂部的混合時(shí)間為32 s，底部的為63 s。

圖1 1500 L反應(yīng)器中混合時(shí)間測(cè)定曲線Fig 1 Representative normalized pH(H) response curves from the top and bottom probes in 1500 L bioreacter during the mixing time experiment

根據(jù)式(2)可知，在該條件下混合時(shí)間為47.5 s。同理測(cè)定了不同轉(zhuǎn)速下的混合時(shí)間，其結(jié)果如下表1，可以發(fā)現(xiàn)頂部的混合時(shí)間都小于底部的混合時(shí)間隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提高，單體體積輸入功率(P/V)增加，加速流體的混合，混合時(shí)間變短。

表1 不同攪拌轉(zhuǎn)速下頂部和底部混合時(shí)間差異Tab 1 Difference of top and bottom mixing time under different agitation speed

t1、t2分別表示上下兩個(gè)電極測(cè)得混合均勻度達(dá)95%時(shí)所需的時(shí)間，混合時(shí)間tmix=(t1+t2)/2

2.2 生物反應(yīng)器的流體剪切 隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提高，反應(yīng)器內(nèi)流體剪切力τk增加，η渦流尺寸減小。研究報(bào)道，剪切力大于1 N/m2就會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，而湍流尺寸接近或者小于細(xì)胞直徑時(shí)，將會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷[11]。因此，通過提高攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)混合效果進(jìn)行改善，還要考慮流體剪切力和渦流尺寸分布。

通過計(jì)算，得到200 L、500 L和1500 L反應(yīng)器內(nèi)局部剪切力和湍流尺寸的分布如圖2所示。隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提高，流體局部剪切力增大。當(dāng)500 L和1500 L反應(yīng)器的攪拌轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)，流體局部剪切力已經(jīng)大于1 N/m2，繼續(xù)提高攪拌轉(zhuǎn)速可能對(duì)細(xì)胞造成損傷。而200 L反應(yīng)器100 r/min條件下剪切力仍在細(xì)胞可承受的范圍內(nèi)，為0.749 N/m2。哺乳動(dòng)物細(xì)胞直徑一般在10～20 μm，當(dāng)湍流尺寸接近20 μm時(shí)就有可能對(duì)細(xì)胞造成損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)中200 L、500 L和1500 L反應(yīng)器在攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)局部湍流尺寸均已經(jīng)小于20 μm，因此，實(shí)際操作時(shí)攪拌轉(zhuǎn)速不應(yīng)超過150 r/min。

圖2 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)局部Kolmogorov剪切力和渦旋尺度的影響Fig 2 Influence of agitation speed on Kolmogorov shear stress and eddy size

此外，攪拌槳葉端速率對(duì)細(xì)胞的損傷作用也不可忽視。動(dòng)物細(xì)胞能耐受的葉端速率一般不大于2 m/s[12]。由圖3可知，2 L和30 L反應(yīng)器內(nèi)攪拌轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min時(shí)，UT均未超過細(xì)胞的耐受極限。但是200 L、500 L和1500 L反應(yīng)器內(nèi)攪拌轉(zhuǎn)速分別在130 r/min、100 r/min和70 r/min時(shí)，UT已經(jīng)接近2 m/s。這些攪拌轉(zhuǎn)速可以作為反應(yīng)器操作過程中設(shè)定的極限值，所以1500 L生物反應(yīng)器內(nèi)最大攪拌轉(zhuǎn)速不能超過70 r/min。

圖3 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)攪拌槳葉端速率的影響Fig 3 Influence of agitation speed on impeller tip speed

2.3 深層通氣和攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)體積氧傳質(zhì)速率的影響

從圖4看出，隨著深層通氣的增加，kLa大致呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是由于實(shí)驗(yàn)所用的microsparager，通氣量較大時(shí)，氣泡發(fā)生聚并，反而減小了氣泡的表面積，從而使得kLa減小。所以在選用microsparager作為鼓泡環(huán)的時(shí)候要選擇合適的通氣量。同時(shí)，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提高，傳質(zhì)系數(shù)不斷增大。這主要是因?yàn)椋孩贁嚢柁D(zhuǎn)速的提高加強(qiáng)了流體湍流特性，使液膜厚度變薄，從而減小了傳質(zhì)阻力，強(qiáng)化了傳質(zhì)；②對(duì)于深層通氣而言，攪拌轉(zhuǎn)速的提高還會(huì)延長(zhǎng)氣泡在反應(yīng)器內(nèi)的停留時(shí)間，從而增大了氣液接觸面積，起到了提高傳質(zhì)系數(shù)的作用。

圖4 深層通氣速率和攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)kLa的影響Fig 4 Influence of aeration rate and agitation speed on kLa

2.4 小泡在大型反應(yīng)器對(duì)氣液傳質(zhì)的影響 在1500 L生物反應(yīng)器中固定攪拌轉(zhuǎn)速為60 r/min，用microsparager進(jìn)行深層通空氣，研究深層通氣速率對(duì)CO2的移除速率的影響，結(jié)果見圖5。可以看出，通氣速率從7.5 L/min增加到22.5 L/min，pCO2的移除速率隨著增加，但是到30 L/min時(shí)pCO2移除速率反而降低。在20～60 r/min都出現(xiàn)這種現(xiàn)象。這是因?yàn)椋孩偻饬吭龃?，氣泡在microsparager開孔處產(chǎn)生聚并現(xiàn)象導(dǎo)致速率的下降；②在1500 L反應(yīng)器中液面高度接近2 m，從microsparager出來的氣泡較小，在上升過程發(fā)生溶解導(dǎo)致速率的變慢。

圖5 深層通氣對(duì)二氧化碳移除速率的影響Fig 5 Influence of aeration rate on CO2 remove rate

通過式(9)計(jì)算得到了不同攪拌轉(zhuǎn)速、不同深層通氣量條件下kLaCO2，如圖6所示。結(jié)果表明，深層通氣對(duì)改善二氧化碳的移除效果不明顯，當(dāng)轉(zhuǎn)速為30 r/min和通氣速率為15 L/min時(shí)，kLaCO2最大為1.3 h-1。所以在用microsparager作為鼓泡環(huán)時(shí)并不是攪拌轉(zhuǎn)速越大通氣速率越快，二氧化碳的移除效果越好。

圖6 攪拌轉(zhuǎn)速通氣速率對(duì)CO2移除速率的影響Fig 6 Influence of agitation speed and aeration speed on CO2 remove rate

2.5 反應(yīng)器病毒增值結(jié)果 根據(jù)上述研究結(jié)果，在1500 L反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)速為60 r/min，深層通氣速率控制在22.5 L/min，能夠較好的滿足供氧需求和提高CO2的移除效果，同時(shí)也降低了剪切力對(duì)細(xì)胞的損傷。

圖7 2 L和1500 L反應(yīng)器流感病毒增殖結(jié)果Fig 7 Influenza virus production between 2 L and 1500 L bioreactor

病毒感染細(xì)胞24 h、48 h和60 h后，病毒滴度分別為29、211和211HA units/25 μL；單位細(xì)胞的病毒產(chǎn)率Svy為13298.70 virions/cell，與2 L反應(yīng)器單位細(xì)胞病毒產(chǎn)率僅相差1.16%(圖7)。因此，可以認(rèn)為2 L反應(yīng)器接毒結(jié)果順利放大到1500 L反應(yīng)器，工藝從2 L實(shí)驗(yàn)室規(guī)模成功放大到1500 L規(guī)模。

3 結(jié) 論

混合與傳質(zhì)是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的兩大問題,是細(xì)胞培養(yǎng)過程中重要的環(huán)節(jié)，反應(yīng)器的混合傳質(zhì)的效果直接影響細(xì)胞培養(yǎng)過程。本文通過冷模實(shí)驗(yàn)對(duì)1500 L反應(yīng)器的混合和傳質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明大罐中存在混合不均一現(xiàn)象，提高轉(zhuǎn)速能加快液體的混合；隨著反應(yīng)器規(guī)模的增大，流體剪切力和葉端速度也隨之增大，所以在細(xì)胞培養(yǎng)過程中要選擇合適的攪拌轉(zhuǎn)速；由于鼓泡環(huán)為microsparager，體積氧傳遞系數(shù)kLa在一定范圍內(nèi)隨著深層通氣速率的提高而增加，當(dāng)深層通氣速率較大時(shí)，kLa減小。同時(shí)，隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提高，傳質(zhì)系數(shù)不斷增大；深層通氣速率和CO2移除速率的關(guān)系并不呈線性關(guān)系，在實(shí)際生產(chǎn)中需要具體考察，選取合理的深層通氣速率，滿足CO2移除要求。1500 L反應(yīng)器最終HA為211HA units/25 μL，單位細(xì)胞的病毒產(chǎn)量為13298.70 virions/cell，與2 L反應(yīng)器單位細(xì)胞病毒產(chǎn)率僅相差1.16%，基本重現(xiàn)2 L反應(yīng)器接毒結(jié)果。

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(編輯：李文平)

Development of Scale up for the Production of Influenza Vaccine Based on MDCK Suspension Cells

DAI Wei-jun, LIU Xu-ping, ZHOU Yan

(State Key Laboratory of Bioreacter Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

LIU Xuping, E-mail: xupingliu@ecust.edu.cn

In order to scale up the flu vaccine production to 1500 L animal cell culture bioreactor, cold form experiment was carried out in 1500 L bioreactor, including mixing time, liquid shear force, volumetric oxygen transfer coefficient and volumetric carbon dioxide transfer coefficient. When cultured in a 1500 L bioreactor, agitation speed and aeration rate was 60 r/min, and 22.5 L/min, respectively, which could meet the oxygen requirement, improve the effect of CO2remove and reduce the shear force on cells. Virus-infected cells after 60 h in a 1500 L bioreactor, the virus titer was 211HA units/25 μL, the specific virus yield (Svy) was 13298.70 virions/cell, which is the difference of 1.16% in 2 L bioreactor.

influenza vaccine; MDCK cell; bioreactor; cold form experiment; scale up

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.08

代為俊，碩士研究生，從事動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)研究。

劉旭平。E-mail: xupingliu@ecust.edu.cn

2017-02-17

A

1002-1280 (2017) 08-0046-06

S852.5