顧歡歡，褚秀玲，蘇建青

(聊城大學農學院，山東聊城 252059 )

響應面法優(yōu)化纖維素酶輔助提取淫羊藿多糖工藝

顧歡歡，褚秀玲*，蘇建青

(聊城大學農學院，山東聊城 252059 )

為優(yōu)化淫羊藿多糖的提取工藝，采用纖維素酶輔助熱水浸提法從淫羊藿中提取淫羊藿多糖，在單因素試驗結果的基礎上，選擇酶濃度、酶提溫度、酶提時間為自變量，采用三因素三水平的Box-Behnken響應面設計，優(yōu)化淫羊藿多糖的提取工藝。試驗結果表明，淫羊藿多糖酶輔助提取的最佳工藝參數為：酶濃度110 U/μL，酶提溫度60 ℃，酶提時間100 min，且酶提溫度對多糖提取率的影響最大。在最佳優(yōu)化條件下淫羊藿多糖提取率為10.06%，接近模型的最大預測值(10.199%)。試驗為淫羊藿多糖的臨床開發(fā)應用提供了依據。

淫羊藿多糖；酶輔助法；響應面法

淫羊藿又名仙靈脾，始載于《神農本草經》，是小檗科(Berberidacea)淫羊藿屬(Epimedium)多年生草本植物?！侗静菥V目》記載其莖、葉入藥，辛溫無毒，有堅筋骨、益精氣、補腰膝和強心力等作用，是我國傳統(tǒng)的補益類中藥[1]。淫羊藿中主要含有黃酮、木質素、生物堿及多糖等多種生物活性物質，其中淫羊藿多糖是淫羊藿總提取物中較重要的活性成分[2]。根據藥理學研究證明：多糖具有抗腫瘤[3]、調節(jié)免疫[4-5]、抗氧化[6]、抗病毒[7]、延緩衰老[8]等多種生理活性。淫羊藿多糖在淫羊藿中含量豐富，但目前國內外對淫羊藿多糖的研究報道較少。而傳統(tǒng)的提取多糖的方法時間長、效率低、溫度高，容易造成多糖的降解及生物活性的降低[9]。因此，建立和優(yōu)化多糖的提取工藝具有重要的意義。本文采用酶輔助法提取淫羊藿多糖，利用響應面法優(yōu)化其提取工藝參數，旨在為進一步研究開發(fā)淫羊藿多糖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 722可見分光光度計為上海欣茂儀器有限公司產品；FW-200高速萬能粉碎機為南京九州干燥設備廠產品；HH-8恒溫水浴鍋為金壇市新航儀器廠產品。

1.1.2 材料 淫羊藿飲片(批號：20160302)，購自聊城利民大藥店。淫羊藿經50 ℃烘干12 h后，高速粉碎，過60目篩備用。葡萄糖(分析純)、濃硫酸(分析純)和苯酚(分析純)均為萊陽經濟技術開發(fā)區(qū)精細化工廠產品；纖維素酶(C109262)購自阿拉丁。

1.2 方法

1.2.1 標準品溶液制備 精密稱取烘干的分析純葡萄糖0.2 g，置于100 mL容量瓶中，加重蒸水定容，搖勻，即得葡萄糖標準溶液(2 mg/mL)。

1.2.2 標準曲線的繪制 標準曲線的制備參考文獻[10]，略有改動：精密吸取葡萄糖標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL分別置于100 mL容量瓶中，加重蒸水定容，搖勻，即得濃度分別為20、40、60、80、100、120、140、160 ug/mL的標準溶液。各取1 mL于干燥潔凈試管中，加入5%的苯酚溶液1 mL，迅速加入濃硫酸5 mL，振蕩混勻，冷水浴10 min后，在490 nm處測定其吸光度。以葡萄糖的濃度(x)為橫坐標，吸光度(y)為縱坐標制作標準曲線，計算回歸方程。

1.2.3 酶溶液制備 精密稱取纖維素酶5.0 g，置于燒杯中，加純凈水溶解后，將其轉移至50 mL容量瓶中，定容，搖勻，即得1000 U/mL的纖維素酶溶液。

1.2.4 酶法提取 酶法提取參考文獻[11]，略有改進，具體方法如下：精確稱取淫羊藿粉末1.00 g，加入25 mL純凈水，調節(jié)pH=5，加入適量的纖維素酶，置于一定溫度條件下進行淫羊藿多糖的提取，提取一定時間后沸水浴滅活5 min，冷卻后加入25 mL純凈水，90 ℃恒溫水浴2 h，冷卻后過濾，最后定容于100 mL容量瓶中，用于總多糖含量測定。

1.2.5 多糖的含量測定 多糖含量測定的方法為苯酚-硫酸法[12]。樣品溶液10倍稀釋后，取1 mL于10 mL試管中，按1.2.2標準曲線下的方法進行測定。

1.2.6 單因素試驗設計 選擇酶濃度、酶提溫度、酶提時間這3個對淫羊藿總多糖提取工藝有影響的參數進行單因素試驗。具體條件見表1。

表1 單因素設計Tab 1 The single factors design condition

1.2.7 響應面試驗設計 根據單因素試驗選擇的響應面試驗范圍，利用Design-Expert10.0.4軟件，以酶濃度(X1，U/μL)、酶提溫度(X2，℃)、酶提時間(X3，min)作為變量，以-1、0、1代表變量水平，進行Box-Behnken設計三因素三水平實驗方案，見表2。試驗數據用Design Expert軟件進行回歸分析，優(yōu)化出各因素對提取得率影響的回歸方程，分析各個因素對多糖提取率的影響，并做出響應面和等高圖。

表2 淫羊藿總多糖提取因素與水平Tab 2 Factors and level of total polysaccharides extraction from Epimedium

2 結 果

2.1 標準曲線的建立 葡萄糖的標準曲線見圖1。以吸光度x(OD)為橫坐標，葡萄糖濃度y為縱坐標制作標準曲線，葡萄糖葡萄糖線性回歸方程為y=115.04x-13.953，R2=0.9989，葡萄糖標準溶液濃度為20～160 ug/mL范圍時，線性關系良好。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig 1 Standard curve of glucose

2.2 單因素對淫羊藿總多糖提取率的影響

2.2.1 酶濃度對淫羊藿總多糖提取率的影響 酶濃度對淫羊藿總多糖提取率的影響結果見圖2?？梢钥闯觯S著纖維素酶濃度的增加淫羊藿多糖的提取率也逐漸增大，110 U/μL時提取率最高，但90 U/μL到110 U/μL提取率增幅不大，考慮到經濟因素選取最優(yōu)酶濃度為90 U/μL為宜。

2.2.2 酶提溫度對淫羊藿總多糖提取率的影響 酶提溫度對淫羊藿總多糖提取率的影響結果見圖3。可以看出，當溫度在30～50 ℃之間時，淫羊藿總多糖提取率隨溫度的升高而呈上升趨勢，當溫度超過50 ℃時，總多糖提取率隨溫度的升高而逐漸降低。因此，酶提溫度選擇50 ℃為宜。

圖2 酶濃度對淫羊藿總多糖提取率的影響Fig 2 Effect of enzyme concentration on extraction rate of total polysaccharides from Epimedium

圖3 酶提溫度對淫羊藿總多糖提取率的影響Fig 3 Effect of extraction temperature on extraction rate of total polysaccharides from Epimedium

2.2.3 酶提時間對淫羊藿總多糖提取率的影響 酶提時間對淫羊藿總多糖提取率的影響結果見圖4?？梢钥闯觯柑釙r間在20～80 min，隨著酶提時間的增加，淫羊藿總多糖的提取率也呈增加的趨勢，在80 min達到最大，酶提時間再增加，多糖提取率呈下降的趨勢。

圖4 酶提時間對淫羊藿總多糖提取率的影響Fig 4 Effect of enzyme extraction time on extraction rate of total polysaccharides from Epimedium

2.3 淫羊藿總多糖提取工藝優(yōu)化

2.3.1 響應面實驗設計與結果 根據Box-Benhn-ken中心組合設計原理，綜合單因素試驗結果，選取酶濃度、酶提溫度、酶提時間3個因素，在單因素試驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法，研究三因素不同組合對淫羊藿多糖提取率的影響，試驗設計及結果見表3。

表3 淫羊藿多糖提取的響應面設計與結果Tab 3 Response surface design and total polysaccharides extraction from Epimedium

對表3試驗數據進行回歸分析，得到各因素影響多糖提取率的一次效應、二次方效應及其交互效應的回歸方程：Y(%)=9.88+0.24X1+0.52X2-8.75X3+0.087X1X2+0.055X1X3+0.053X2X3-0.068X12-0.55X22-0.12X32，其中Y代表淫羊藿多糖提取率(%)，X1纖維素酶濃度(U/μL)，X2酶提溫度(℃)，X3酶提時間(min)。利用Design-Expert10.0.4軟件對表3中的數據進行多元回歸擬合，顯著性檢驗，結果見表4。

表4 響應面二次回歸模型的方差分析Tab 4 Result of analysis of variance to the response surface quadratic model

續(xù)表

*P<0.05差異顯著，**P<0.01差異極顯著，/差異不顯著

*P<0.05 was significant,**P<0.01 was extremely significant, / has no significant difference

由表4可以看出，各因素中纖維素酶濃度一次項X1極顯著，酶提溫度一次項X2極顯著，酶提溫度二次項X22極顯著，酶提時間二次項X32顯著。在本實驗設計范圍內，R2=0.8669，校正后的R2=0.9607，模型F=44.50，該模型回歸顯著性P<0.0001，說明建立的模型極顯著；失擬項F值為1.00，P=0.4792>0.05，不顯著，說明模型的擬合程度良好，未知因素對試驗結果干擾較小，該模型可以用于淫羊藿多糖的提取優(yōu)化。

2.3.2 相應曲面分析與優(yōu)化 根據回歸方程，作出響應面圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析酶濃度(X1)、酶提溫度(X2)和酶提時間(X3)對淫羊藿多糖提取率的影響，相應曲面的三維立體見圖5.a-c與等高圖見圖6.d-f。

由圖5.a和圖6.d可以看出，隨著酶濃度的增加，提取得率緩慢增加，說明增加酶濃度有利于提高提取率，但增加的速度相對較小，當酶濃度超過90 U/μL后出現提取得率趨于平穩(wěn)的趨勢；而提取得率隨著提取溫度的增加而快速增大，當提取溫度在50 ℃時，提取率達到最大值，之后隨溫度的增加，提取率呈下降趨勢。說明提取溫度對提取率的影響較大。

由圖5.b和圖6.e可以看出，提取率隨酶提時間的增加緩慢增大，在80 min時達到最大值，之后隨時間的增大而緩慢降低，可能是隨著酶解的進行，有非多糖類物質析出，影響多糖得率的測定；而隨著酶濃度的增加提取率同樣是緩慢增長的趨勢，說明酶提時間和酶濃度對提取率的影響相對較小。

由圖5.c和圖6.f可以看出，酶提溫度在40～50 ℃之間時，提取率隨溫度的升高而迅速增大，溫度在50 ℃后，提取率呈明顯的下降趨勢；而隨著酶提時間的增大，提取率變化趨勢不明顯，說明相對于酶提時間，酶提溫度對提取率的影響較大。

2.3.3 驗證試驗 為驗證試驗的可操作性，選取同一樣品，在纖維素酶濃度110 U/μL、酶提溫度60 ℃、酶提時間100 min的最佳提取條件下進行驗證性試驗，提取3次，計算淫羊藿多糖的平均提取率為10.06%，非常接近理論預測值10.199%。因此，采用響應面優(yōu)化方法對淫羊藿多糖的提取工藝進行優(yōu)化，可得到最優(yōu)的工藝參數，為進一步的試驗研究奠定基礎，為淫羊藿的開發(fā)利用提供依據。

3 討 論

多糖是存在于生物體內的一類生物大分子物質，具有重要的生物活性。多糖傳統(tǒng)的提取方法是水煮、水提醇沉法，這些傳統(tǒng)的提取方法時間長、效率低。而酶輔助提取法具有時間短、效率高、能耗低等優(yōu)點，克服了傳統(tǒng)提取法的一些缺點。本研究基于酶法在提取中藥時的優(yōu)點，通過單因素和響應面法討論了淫羊藿多糖的提取工藝條件，以期達到高效從淫羊藿中提取多糖的目的。

圖5 兩因素之間交互作用對淫羊藿多糖提取率影響的響應面三維立體圖Fig 5 Response surface three dimensional showing the effects of two factors interaction on the extraction rate of polysaccharide from Epimedium

圖6 兩因素之間交互作用對淫羊藿多糖提取率影響的響應面等高線圖Fig 6 Response surface contour map showing the effects of two factors interaction on the extraction rate of polysaccharide from Epimedium

在單因素試驗中，就酶濃度而言，淫羊藿多糖的提取率隨著酶濃度的增加而增大，但酶濃度在90～110 U/μL之間增長趨勢變緩，這是由于隨著酶濃度的增加，促進了酶對淫羊藿植物細胞壁的降解，增加了多糖的溶出量，當酶濃度超過90 U/μL后，纖維素酶與底物的作用點達到飽和；就酶提溫度而言，淫羊藿多糖提取率隨溫度的升高而增加，當溫度超過50 ℃時，總多糖提取率隨溫度的升高而程下降趨勢，這是由于酶屬于蛋白質，其活性受溫度的影響，溫度升高可促進酶活性的增強，當超過最適溫度時可導致酶蛋白質變性失活，從而降低酶的活性，影響多糖提取率；就酶提時間而言，隨著酶提時間的增加多糖提取率升高，超過80 min時，多糖提取率程下降趨勢，這可能是酶解過程中細胞透性不斷增加，隨著酶解的不斷進行，一些非多糖類可溶性物質不斷析出，干擾多糖的測定，導致多糖提取率降低。

通過響應面試驗設計，利用Design-Expert軟件建立了淫羊藿多糖提取率與纖維素酶濃度、酶提溫度及酶提時間的二次多項回歸模型，驗證結果表明該模型合理可靠，能較好的預測淫羊藿多糖的提取率。優(yōu)化出淫羊藿多糖酶輔助提取的最佳工藝參數為：纖維素酶濃度110 U/μL，酶提溫度60 ℃，酶提時間100 min，淫羊藿多糖的提取率為10.06%，與預測值10.199%非常接近，可達預測值的98.6%。據有關文獻報道，劉曉鵬等[13]用微波輔助法提取淫羊藿多糖，多糖得率為1.8%；姜虹等[14]報道，用響應面法優(yōu)化淫羊藿多糖超聲提取提取工藝，其多糖提取率為5.62%。與微波輔助法及超聲提取法相比，本研究相對省時，且淫羊藿多糖提取率較高。試驗結果表明該回歸方程可以較好的預測實驗結果。因此，選擇響應面法來優(yōu)化淫羊藿多糖的提取工藝是可行的。

該提取工藝中的試驗條件具有容易控制、安全環(huán)保，且提取效率高、時間短等優(yōu)點，彌補了傳統(tǒng)提取工藝的缺點，可為淫羊藿多糖的工業(yè)化大生產提供參考。

[1] 李時珍. 本草綱目[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社,1977:750.

Li S Z. Compendium of materia medica[M]. Beijing: People's Medical Publishing House, 1977:750.

[2] Cao H, Fan Y, Wang D,etal. Optimization on preparation condition ofEpimediumpolysaccharide liposome and evaluation of its adjuvant activity [J]. Int J Biol Macromol, 2012, 50(1): 207-213.

[3] 王程成,蘇嘉炎,蔡繼炎,等.響應面優(yōu)化朝鮮淫羊藿多糖提取條件及腫瘤免疫活性研究[J].藥學學報,2016,51(9):1464-1471.

Wang C C, Su J Y, Cai J Y,etal. Response surface analysis for the optimization of extraction condition for polysaccharides fromEpimediumpolysaccharides and studies on its tumor immune activities[J]. Acta Pharm Sin, 2016,51(9):1464-1471.

[4] 李得鑫,陳偉毅,周霄楠,等.淫羊藿對動物機體免疫功能的研究進展[J].中獸醫(yī)學雜志,2015,5:68-70.

Li D X, Chen W Y, Zhou X N,etal. Research progress ofEpimediumon immune function in animals[J]. Chinese Journal of Traditional Veterinary Science, 2015,5:68-70.

[5] 付亮,袁璟亞,周永紅,等. 淫羊藿多糖的研究進展及開發(fā)前景[J].食品科學,2012,33(03):261-266.

Fu L, Yuan J Y, Zhou Y H,etal. Research progress and development prospect ofEpimediumpolysaccharides[J]. Food Science, 2012,33(03):261-266.

[6] 李秋瑩,陳守哲,李波,等. 淫羊藿多糖抗氧化性研究[J].亞太傳統(tǒng)中藥,2016,12(18):24-26.

Li Q Y, Chen S Z, Li B,etal. Research on oxidation-resistance activity ofEpimediumpolysaccharides[J]. Asia-Pacific Traditional Medicine,2016,12(18):24-26.

[7] 任宇皓,胡元亮,劉家國,等. 黃芪多糖、淫羊藿多糖和淫羊藿總黃酮對新城疫病毒感染細胞的影響[J].南京農業(yè)大學學報,2001,24(2):102-105.

Ren H Y, Hu Y L, Liu J G,etal. The effects of astragalus polysaccharide,Epimediumpolysaccharide andEpimediumflavone on cell-infecting of NDV[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2001,24(2):102-105.

[8] 胡元亮,任宇皓,宋大魯,等. 黃芪多糖和淫羊藿多糖對培養(yǎng)細胞增殖和衰老的影響[J].中國獸醫(yī)學報, 2005, 25(3):304-306.

Hu Y L, Ren Y H, Song D L,etal. Effects of astragalus polysaccharide andEpimediumpolysaccharide on proliferation and decrepitude of CEF[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2005,25(3):304-306.

[9] Hromadkova, Z, Ebringerova, A, Valachovic, P. Ultrasound-assisted extraction of water-soluble polysaccharides from the roots of valerian(ValerianaofficinalisL)[J]. Ultrason Sonochem, 2002, 9(1): 37-42.

[10]于紅梅,陳芬芳,王瑞,等. 正交設計法優(yōu)化淫羊藿多糖的提取工藝[J].動物醫(yī)學進展,2015,36(3):64-67.

Yu H M, Chen F F, Wang R,etal. Extraction technology optimization of polysaccharides fromEpimediumbrevicornumUsing Orthogonal Design[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2015, 36(3):64-67.

[11]楊瑞花,張玥莉. 響應面法優(yōu)化纖維素酶提取丹參多糖工藝[J].中國藥師,2016,19(1):43-46.

Yang R H, Zhang Y L. Optimization of cellulase extraction process for polysaccharide by response surface analysis[J]. China Pharmacist, 2016,19(1):43-46.

[12]于瑞詩,朱鵬程,陶燕鐸,等.苯酚硫酸法測定迷果芹多糖的含量[J].分析試驗室,2008, 27(S):222-224.

Yu R S, Zhu P C, Tao Y D,etal. Determination of polysaccharides in pistachios sulfuric acid method[J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2008,27(S):222-224.

[13]劉曉鵬,姜寧,劉志彪,等. 微波輔助提取淫羊藿多糖研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2014,10(16):16-18.

Liu X P, Jiang N, Liu Z B,etal. A Study on the microwave extraction for polysaccharides fromEpimediumsagittatum(Sieb. Et Zucc.)Maxim[J]. Asia-Pacific Traditional Medicine,2014,10(16):16-18.

[14]姜虹,李新龍,李海平,等. 響應面法優(yōu)化淫羊藿多糖超聲提取工藝的研究[J].長春師范學院學報,2013,32(1):59-64.

Jiang H, Li X L, Li H P,etal. Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from driedEpimediumleaves using response surface methodology[J]. Journal of Changchun Normal University(Natural Science), 2013,32(1):59-64.

(編輯：李文平)

Optimization ofEpimediumPolysaccharide by Response Surface Methodology

GU Huan-huan, CHU Xiu-ling*, SU Jian-qing

(College of Agriculture, Liaocheng University, Liaocheng Shandong 252059)

CHU Xiu-ling, E-mail: chuxiul@163.com

To optimize the extraction technology ofEpimediumpolysaccharide from HerbaEpimedii. The extraction technology was used by using ultrasonic-assisted extraction technology and hot water extraction technology. On the basis of single factor test results, enzyme concentration, enzyme extraction temperature, enzyme extraction time were selected as independent variables. Three factors and three levels of the Box-Behnken response surface design was used to that of optimizing extraction ofEpimediumpolysaccharide. The results showed that the optimum parameters for extractingEpimediumpolysaccharide, enzyme concentration was 110 U/μL, temprature of enzyme extraction is 60 ℃, enzyme extraction time is 10 minutes. The enzyme extraction temperature had the greatest effect on the extraction rate of polysaccharide. Under the optimum conditions, the extraction rate of polysaccharide was 10.06%, which closes to the maximum expected value of extraction(10.199%)of the model. The experiment had provided the basis for the clinical application ofEpimediumpolysaccharide.

Epidmedium; polysaccharide; enzyme assistant method; response surface methodology

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.09

山東省自然科學基金(ZR2013CL010)

顧歡歡，碩士研究生，從事動物疫病發(fā)生機理及防控研究。

褚秀玲。E-mail:chuxiul@163.com

2017-03-04

A

1002-1280 (2017) 08-0052-07

S853.7