黃宇翔，張軍，李洪彬，鄒 躍，楊旭東，王志強(qiáng)，劉力威

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161005)

雛鵝大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

黃宇翔，張軍，李洪彬，鄒 躍，楊旭東，王志強(qiáng)，劉力威

(黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾 161005)

為有效防治雛鵝大腸桿菌病，無菌采集疑似大腸桿菌病例雛鵝的肝、脾等組織，進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，經(jīng)過培養(yǎng)特性、形態(tài)染色、生化特性以及致病性試驗(yàn)，鑒定為大腸桿菌。選用7種臨床常用抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株對慶大霉素、阿莫西林、氧氟沙星、頭孢唑啉產(chǎn)生耐藥性，對丁安卡娜高度敏感。

雛鵝；大腸桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

鵝大腸桿菌病(gooseE.colidisease, GED)是由致病性大腸桿菌所引起的局部或全身性感染的細(xì)菌性疾病，各種年齡的鵝均可感染，感染率達(dá)5%～30%，病死率在90%以上，主要危害產(chǎn)蛋鵝群和幼齡鵝群。產(chǎn)蛋鵝群發(fā)病常表現(xiàn)為拉灰白色稀糞，產(chǎn)蛋率下降；剖檢發(fā)現(xiàn)卵黃性腹膜炎病變；幼鵝發(fā)病多成敗血性傳染，剖檢病變主要表現(xiàn)為心包炎、肝周炎和氣囊炎等癥狀，嚴(yán)重的引起大量死亡[1]。近年來，雛鵝的發(fā)病率和死亡率有上升趨勢，危害極大，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。本研究結(jié)果以期為臨床中鵝大腸桿菌的預(yù)防和治療以及制備鵝大腸桿菌滅活苗提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來源于黑龍江地區(qū)某鵝場專業(yè)戶送檢30日齡病鵝，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹，跛行，排黃白色稀糞，零星死亡，剖解有心包炎、肝周炎等病變的鵝肝臟、脾。

1.1.2 試劑 尿素酶、VP、MR、吲哚、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、麥康凱、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基等。生化試劑購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。藥敏片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動物 20日齡小白鼠10只，體重18～20 g，購自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院；10日齡左右雛鵝10只由齊富區(qū)某養(yǎng)殖場提供。

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養(yǎng) 取病死雛鵝的肝臟、脾臟，接種于營養(yǎng)瓊脂麥康凱和伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的培養(yǎng)特性，并進(jìn)行涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察其形態(tài)。再挑取單個典型菌接種普通肉湯4 ℃保存。

1.2.2 分離菌株鑒定 鏡檢：將無菌采取的病料直接觸片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。生化試驗(yàn)：糖發(fā)酵試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)。

1.2.3 致病性試驗(yàn) 小白鼠致病性試驗(yàn)：取健康小白鼠10只，隨機(jī)分成2組，每組5只，試驗(yàn)組分別用鑒定的24 h試驗(yàn)菌株靜置肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行腹腔注射，0.1mL/只(大腸桿菌濃度為2.5×109CFU/mL)，對照組注射相同劑量的滅菌生理鹽水，接種后觀察，記錄發(fā)病情況及死亡時間，并取接種鼠的肝臟及心血進(jìn)行病原的再分離。雛鵝致病性試驗(yàn)：分組和細(xì)菌準(zhǔn)備同小白鼠，每只雛鵝皮下接種上述細(xì)菌0.3 mL(大腸桿菌濃度為2.5×109CFU/mL)，對照組每只接種生理鹽水0.3 mL，觀察細(xì)菌致病性方法同上。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 將稀釋好的菌液每個平板接種0.1 mL，用滅菌玻璃棒涂勻整個平板表面，用無菌鑷子取各種藥敏紙片貼于平板上，每個平板貼3～5張紙片，相隔不少于3 cm，將上述平板置37 ℃溫箱內(nèi)，24 h后觀察結(jié)果并測量各紙片周圍抑菌圈直徑[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)特性 在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上均呈亮紅色、光滑濕潤、邊緣整齊的菌落；在普通瓊脂培養(yǎng)基上呈灰白色、圓形、整齊、隆起、光滑濕潤的菌落。

2.2 染色鏡檢 分離菌株革蘭氏染色為陰性小桿菌，兩端鈍圓，多單個存在，與大腸桿菌染色特性相符。

2.3 生化試驗(yàn)鑒定 分離菌株能發(fā)酵乳糖，約半數(shù)細(xì)菌不分解蔗糖，大多數(shù)菌株能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵麥芽糖、甘露醇，吲哚試驗(yàn)為陽性，VP試驗(yàn)為陰性，尿素酶陰性，MR試驗(yàn)陽性，與大腸桿菌生化特性相符(表1)。

表1 分離細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 The results of bacterial biochemical separation

“+”表示陽性，“-”表示陰性，“⊕”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣

"+" means positive, "-" means negative, "⊕" means acid producing gas

2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 小鼠致病性試驗(yàn) 小白鼠在細(xì)菌接種后12 h左右開始出現(xiàn)不同程度的癥狀，表現(xiàn)為精神沉郁，腹圍增大，48 h內(nèi)死亡2只，剖檢死亡小白鼠發(fā)現(xiàn)腹腔有黃色纖維素性滲出物，心外膜出血，肝腫脹、發(fā)黑或出血。

2.4.2 雛鵝致病性試驗(yàn) 雛鵝接種后12 h全部開始發(fā)病，出現(xiàn)腹瀉癥狀，肝門周圍有污穢物，48 h內(nèi)全部死亡。對死亡的雛鵝立即進(jìn)行剖解，發(fā)現(xiàn)雛鵝心包積液，腹腔有纖維素性滲出物；肝臟腫脹，有出血點(diǎn)及出血斑，質(zhì)地變脆；心包積液，心臟表面有出血點(diǎn)；腺胃乳頭出血；腸道充血，尤其是十二指腸更嚴(yán)重。從死亡小白鼠和雛鵝的肝臟和心血中，均分離到了所接種的細(xì)菌；而對照組無異常表現(xiàn)。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 對已鑒定出的大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表2。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，本次分離鑒定出的大腸桿菌對丁安卡娜敏感性較高，多粘菌素次之。

3 討論與小結(jié)

細(xì)菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)特征、生化試驗(yàn)證明，從鵝場的病仔鵝中分離到的菌株為大腸桿菌，通過動物試驗(yàn)，證明該菌具有致病性。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出，丁安卡娜、多粘菌素對該鵝場大腸桿菌有效強(qiáng)的抑制作用，而該鵝場大腸桿菌對慶大霉素、阿莫西林、氧氟沙星、頭孢唑啉、紅霉素這些臨床上常用藥已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性，這為該病的預(yù)防和治療提供了理論依據(jù)。大腸桿菌對抗菌素產(chǎn)生耐藥性是隨著臨床藥物的廣泛應(yīng)用而產(chǎn)生的，并能通過耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移而使耐藥菌株不斷蔓延擴(kuò)大，致使一些鵝場從未使用過的某些藥物也失去效用[4]，因此，臨床施藥前必須進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，從而提高治療效果，降低由施用無效藥物所造成的鵝業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The results of isolated strains susceptibility test

大腸桿菌是鵝腸道內(nèi)的常在細(xì)菌，正常鵝體內(nèi)的大腸桿菌是潛在的致病性大腸桿菌，在正常情況下，健康禽類具有完整的防御系統(tǒng)，足以抵抗大腸桿菌甚至致病性菌株的自然感染。當(dāng)鵝的皮膚或黏膜的防御屏障遭到破壞時，就很容易被感染。凡能引起機(jī)體抵抗力降低的各種因素，都可以誘發(fā)大腸桿菌病。因此，大腸桿菌病應(yīng)以預(yù)防為主，加強(qiáng)鵝場的飼養(yǎng)管理和飲水衛(wèi)生，有發(fā)病史的鵝場，可以根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查和藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用相應(yīng)的疫苗[5]及藥物預(yù)防本?。徽诎l(fā)病的鵝場，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用高敏藥物進(jìn)行治療，基本控制病情后，改用中藥方劑[6-7]維持藥效和提高鵝體抵抗力，切記不可長期使用一種藥物，以防止耐藥菌株的出現(xiàn)[8-9]。由于大多數(shù)大腸桿菌病多繼發(fā)于其他因素[10-11]，所以必須控制促發(fā)因素才能使疾病得到有效的控制。

[1] 嚴(yán)玉霖，雷 華，楊尚斌，等.鵝大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn) [J] 中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(10)：160-162.

Yan Y L, Lei H, Yang S B,etal. Separation,Identification and Drug Sensitive Test ofEscherichiacolifrom Goose[J].China Aanimal Husbandry & Veterinary Medicine，2011，38(10)：160-162.

[2] 謝永平，楊 威.雛鵝大腸桿菌病的診治 [J] 廣西畜牧獸醫(yī)，2009，(2)：21-22.

Xie Y P, Yang W. Diagnosis and treatment of ghetto colibacillosis [J]. Guangxi Animal Science And Veterinary Medicine，2009，(2)：21-22.

[3] 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：33-41.

Yao H C.Veterinary Microbiology Experimental Guidance [M]. Beijing: China agriculture press，2002：33-41.

[4] 王 影，李欣南，韓鐫竹，等.大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生與傳播機(jī)制的研究現(xiàn)狀[J].中國畜牧獸醫(yī)，2016，(1)：32-34.

Wang Y, Li X N, Han X Z，etal. Research on the Generating and Spreading mechanism of Drug Resistance ofEscherichiacoli[J]. China Aanimal Husbandry & Veterinary Medicine，2016，(1)：32-34.

[5] 馬興樹.禽大腸桿菌病疫苗研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2015，42(1)：234-244.

Mang X S. Research Progress on Vaccines of Avian Colibacillosis [J]. China Aanimal Husbandry & Veterinary Medicine，2015，42(1)：234-244.

[6] 毛偉斌，劉長忠，姜金慶，等.中藥組方治療大腸桿菌病 [J] 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016，(9下)：166-168.

Mao W B, Liu C Z, Jiang J Q,etal. Treatment ofEscherichiacoliDisease by Traditional Chinese Medicine [J]. Heilingjiang Animal Science And Veterinary Medicine，2016，(9 Down)：166-168.

[7] 葛 冰，劉 瀾，李復(fù)煌，等.復(fù)方白頭翁顆粒對人工感染雞大腸桿菌療效試驗(yàn)[J] 中國獸醫(yī)雜志，2016：52(7)：111-113.

Ge B, Liu L, Li F H,etal. Effect of CPCG on artificial infected chickenEscherichiacolidisease [J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine，2016：52(7)：111-113.

[8] 植嬋萍，賀 丹，陳孝生.種鵝大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41(9)：245-248.

Zhi C P, He D, Chen X S. Isolation, Identification and Antibiotic Resistance Analysis ofEscherichiacolifrom Breeding Geese[J]. China Aanimal Husbandry & Veterinary Medicine，2014，41(9)：245-248.

[9] 趙 陽.黑龍江省部分地區(qū)鵝大腸桿菌的分離鑒定 [D] 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

Zhao Y. Isolation and Identification of GooseEscherichiacoliin some Areas of Heilongjiang Province [D]. Harbin：Northeast Agricultural University，2011.

[10]李偉娟，王 丹，熊向前.朗德鵝副黏病毒及大腸桿菌病混合感染的診治[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014，(5)：84-86.

Li W J, Wang D, Xiong X Q. Diagnosis and treatment of mixed infection of Langer 's goose paramyxovirus andEscherichiacoli[J]. Heilingjiang Animal Science And Veterinary Medicine，2014，(5)：84-86.

[11]王永豐，曾獻(xiàn)濤，薛春霞.鵝大腸桿菌與曲霉菌混合感染的診治[J] 中國畜牧獸醫(yī)文摘，2013，29(1)：206-207.

Wang Y F, Zeng X T, Xue C X. Diagnosis and treatment of mixed infection of goose and Aspergillus [J]. Chinese Abstracts of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2013，29(1)：206-207.

(編輯：侯向輝)

Isolation, Identification and Drug Sensitivity Test ofEscherichiacolifrom Gosling

HUANG Yu-xiang, ZHANG Jun, LI Hong-bin, ZOU Yue, YANG Xu-dong, WANG Zhi-qiang, LIU Li-wei

(Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar，Heilongjiang 161005，China)

In order to effective prevent and control colibacillosis of gosling, sterile collection of gosling of suspectedE.coliliver and spleen tissues were bacteria isolated and cultured. The strain was identified based on culture characteristics dyeing and biochemical characteristics of morphology and pathogenicity test. The results showed that there wasE.colistrain. Choose seven kinds of clinical commonly used antimicrobial susceptibility test. Drug-sensitivity tests showed that isolated strain developed resistance to gentamicin，amoxicillin，ofloxacin and cefazolin，But the isolated strain was highly sensitive to amikacin. Test results provided the basis for clinical treatment.

gosling；E.coli；separation and identification；drug sensitive test

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.8.04

黃宇翔，高級獸醫(yī)師，從事畜禽傳染病防治的研究。E-mail：huangyuxiang-2007@163.com

2017-01-05

A

1002-1280 (2017) 08-0022-04

S858.3