孫曉峰，陽松威，賀又舜，陳 聰，龔力民，羅 令（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，長沙 4008；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 4008；3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院骨科，長沙 4003）

左歸丸對化療性卵巢早衰小鼠卵巢組織中縫隙連接蛋白43表達(dá)的影響Δ

孫曉峰1＊，陽松威2，賀又舜1，陳 聰1，龔力民2，羅 令3#（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208；3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院骨科，長沙 410013）

目的：研究左歸丸對環(huán)磷酰胺（CTX）致卵巢早衰（POF）小鼠卵巢組織中縫隙連接蛋白43（Cx43）表達(dá)的影響，探討左歸丸治療化療性POF的作用機(jī)制。方法：將72只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、戊酸雌二醇片組（陽性對照，0.000 13 g/kg）和左歸丸低、中、高劑量組（13.65、40.95、122.85 g/kg），每組10只。除空白組外，其余各組小鼠均ip CTX復(fù)制POF模型，每天1次，連續(xù)20 d；并同時(shí)ig相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)30 d。末次給藥2 h后，分別采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法和Western blot法檢測卵巢組織中Cx43 mRNA和蛋白表達(dá)；并采用免疫組化法檢測卵巢組織中Cx43蛋白的分布。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯減弱，卵泡與顆粒細(xì)胞中Cx43蛋白的分布明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，戊酸雌二醇片組和左歸丸中、高劑量組小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增強(qiáng)，卵泡與顆粒細(xì)胞中Cx43蛋白的分布明顯增加（P＜0.01）。結(jié)論：左歸丸可上調(diào)CTX致POF小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)，增加Cx43在卵泡及顆粒細(xì)胞間的分布，改善縫隙連接功能，這可能是其治療POF的作用機(jī)制之一。

左歸丸；卵巢早衰；卵巢；縫隙連接蛋白43；小鼠

卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）是指女性在40歲之前出現(xiàn)的以卵巢功能衰退為主的婦科內(nèi)分泌性疾病，其可引發(fā)心腦血管及神經(jīng)系統(tǒng)病變，嚴(yán)重危害青年婦女的身心健康[1-3]。POF病因復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)POF的發(fā)生與遺傳、染色體異常、自身免疫、醫(yī)源性損傷及顆粒細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)[3-4]。其中，醫(yī)源性因素主要指化療因素，而環(huán)磷酰胺（CTX）是常用的化療藥，但其在治療惡性腫瘤的同時(shí)還會(huì)對卵巢造成損傷，會(huì)加速卵泡閉鎖，使卵巢組織纖維化，從而誘導(dǎo)POF的發(fā)生[5-6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：“腎藏精，主生殖”。早在《素問·上古天真論》中就明確指出了腎中精氣的盛衰決定著機(jī)體的生、長、壯、老、已。中醫(yī)在防治生殖功能衰退方面已有幾千年的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，現(xiàn)代研究顯示補(bǔ)腎填精中藥具有增強(qiáng)生殖機(jī)能、抗衰老的作用，補(bǔ)腎填精法代表方劑左歸丸在臨床上就常用于卵巢早衰、圍絕經(jīng)期綜合征、老年骨質(zhì)疏松癥等的治療[7]。

間隙連接細(xì)胞間通訊（Gap junction intercellular communication，GJIC）又稱縫隙連接（Gap junction，GJ），是組織細(xì)胞間通過連接蛋白（Connexin，Cx）介導(dǎo)從而調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝、增殖分化以及機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要方式[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，GJ廣泛存在于卵泡各種細(xì)胞間，在顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞及膜細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)Cx的表達(dá)，其中Cx37與Cx43是與卵泡及顆粒細(xì)胞生理功能關(guān)系密切的兩種Cx。前期研究已證實(shí)，左歸丸可調(diào)節(jié)CTX致POF模型小鼠卵巢組織中Cx37 mRNA及蛋白表達(dá)[10-11]。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者將通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法、Western blot法及免疫組化法等技術(shù)研究左歸丸對CTX致POF模型小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)的影響，探討左歸丸治療化療損傷性POF的作用機(jī)制，為補(bǔ)腎填精法的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Piko Real 96熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）；Motic B5顯微攝像圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）；164-5050電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Olympus BX43雙目生物攝像顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；TGL-16臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

左歸丸（由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供，批號：151012，規(guī)格：每1 g浸膏含左歸丸生藥1 g）；戊酸雌二醇片（德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：113A，規(guī)格：1 mg/片）；注射用CTX（通化茂祥制藥有限公司，批號：131201，規(guī)格：0.2 g/瓶）；兔抗Cx43抗體（北京博奧森公司）；羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）/辣根過氧化酶（HRP）抗體（美國Santa Cruz公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（北京碧云天生物研究所，批號：P0010S）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號：15596-026）；第一鏈cDNA合成試劑盒（立陶宛Fermentas公司，批號：K1631）；免疫組化檢測試劑盒（北京金杉中橋公司，批號：K126816B）。

1.3 動(dòng)物

KM小鼠72只，SPF級，♀，體質(zhì)量（18±2）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號：SCK（湘）2011-0003。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將72只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、戊酸雌二醇片組（陽性對照，0.000 13 g/kg，根據(jù)人臨床用量的等效劑量換算而得，蒸餾水溶解）和左歸丸低、中、高劑量組（13.65、40.95、122.85 g/kg，根據(jù)臨床用量的1、3、9倍換算而得），每組12只?？瞻捉M小鼠ip等體積生理鹽水，其余各組小鼠ip CTX 30 mg/kg復(fù)制POF模型，注射體積均為20 mL/kg（生理鹽水溶解），每天1次，連續(xù)20 d。造模同時(shí)，各給藥組小鼠ig相應(yīng)藥物，空白組和模型組小鼠ig等體積蒸餾水，20 mL/kg，每天1次，連續(xù)30 d。

2.2RT-PCR法檢測小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA表達(dá)

末次給藥2 h后脫頸處死小鼠，剖開腹腔，摘取位于子宮末端的卵巢組織，剔除周圍附著的脂肪與結(jié)締組織。Trizol試劑提取卵巢組織總RNA，檢測RNA純度及濃度后，瓊脂糖電泳法檢測RNA完整性。然后參照試劑盒操作說明，將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增。Cx43上游引物序列：5′-TGGTGTCCTTGGTGTCTCTC-3′，下游引物序列：5′-CAGGAGGAGACATAGGCGAG-3′，擴(kuò)增片段大?。?10 bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物序列：5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，下游引物序列：5′-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3′，擴(kuò)增片段大?。?55 bp。反應(yīng)條件：94℃、3 min，94℃、30 s，59℃、30 s，72℃、45 s，共40個(gè)循環(huán)。參照文獻(xiàn)[12]方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以2－ΔΔct法（ct表示基本循環(huán)值）測定Cx43 mRNA基因相對表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 Western blot法檢測小鼠卵巢組織中Cx43蛋白表達(dá)

取部分小鼠卵巢組織，勻漿后以RIPA裂解液提取卵巢總蛋白，BCA法測定組織中總蛋白含量，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（NC）膜上，以5%脫脂奶粉于37℃脫色搖床中封閉2 h，TBST緩沖液漂洗3次；加入Cx43抗體（1∶300），37℃脫色搖床中孵育2 h，TBST緩沖液漂洗3次；加入二抗（1∶40 000），37℃脫色搖床中孵育1 h；TBST緩沖液漂洗3次后將膜貼于玻璃紙上，以化學(xué)發(fā)光液（ECL）覆蓋后曝光，得到膠片，采用Gel Pro 4.0凝膠光密度（OD）分析軟件進(jìn)行OD值分析。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 免疫組化法檢測小鼠卵巢組織中Cx43分布

4%多聚甲醛浸泡固定卵巢組織樣本，石蠟包埋連續(xù)切片。采用PV-9000免疫組化二步法，將卵巢切片常規(guī)脫蠟入水，以3%過氧化氫（H2O2）孵育，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次后滴加一抗（1∶100），于4℃下孵育過夜，PBS沖洗3次。滴加檢測試劑1，于37℃下孵育30 min，PBS沖洗3次；再滴加檢測試劑2，于37℃下孵育30 min，PBS沖洗3次，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液顯色；經(jīng)自來水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片等步驟后，采用Motic B5顯微圖像分析系統(tǒng)觀察Cx43蛋白的分布并進(jìn)行OD值分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)的測定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯減弱（P＜0.01）；與模型組比較，戊酸雌二醇片組和左歸丸中、高劑量組小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。各組小鼠卵巢組織中Cx43蛋白表達(dá)的電泳圖見圖1，Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)測定結(jié)果見表1。

圖1 各組小鼠卵巢組織中Cx43蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 1 Electrophoresis charts of Cx43 protein expression in ovarian tissue of mice in each group

表1 各組小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of Cx43 mRNA and protein expressions in ovarian tissue of mice in each group（±s，n＝3）

表1 各組小鼠卵巢組織中Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of Cx43 mRNA and protein expressions in ovarian tissue of mice in each group（±s，n＝3）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

組別空白組模型組戊酸雌二醇片組左歸丸低劑量組左歸丸中劑量組左歸丸高劑量組Cx43蛋白表達(dá)量0.990±0.087 0.442±0.185＊＊0.753±0.052##0.518±0.025 0.686±0.036##0.753±0.033##劑量，g/kg 0.000 13 13.65 40.95 122.85 Cx43 mRNA表達(dá)量11.858±0.029 1.095±0.047＊＊8.431±0.664##2.050±0.700 4.216±1.105##6.381±0.302##

3.2 各組小鼠卵巢組織中Cx43蛋白分布觀察及OD值的測定結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，空白組小鼠卵巢組織中Cx43蛋白的分布范圍較廣，不僅在成熟卵泡中大量分布，在顆粒細(xì)胞以及卵母細(xì)胞間也有分布；模型組小鼠卵巢組織中Cx43蛋白分布范圍明顯減小，視野范圍內(nèi)基本未見Cx43蛋白的陽性信號；左歸丸低、中、高劑量組小鼠卵巢組織中Cx43分布范圍逐步增大，在顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞中分布差異尤為明顯，其分布范圍呈明顯量-效關(guān)系。OD值分析顯示，與空白組（0.309±0.079）比較，模型組小鼠卵巢Cx43陽性表達(dá)（0.178±0.052）明顯減弱（P＜0.01）；與模型組比較，戊酸雌二醇片組和左歸丸中、高劑量組小鼠卵巢組織中Cx43陽性表達(dá)（依次為0.246±0.074、0.255±0.098、0.273±0.050）均明顯增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），左歸丸低劑量組小鼠卵巢組織中Cx43陽性表達(dá)（0.229±0.072）增強(qiáng)不明顯（P＞0.05），該結(jié)果與顯微觀察的Cx43蛋白分布結(jié)果一致。免疫組化圖見圖2。

圖2 各組小鼠卵巢組織中Cx43蛋白分布的免疫組化圖（×400）Fig 2 Immunohistochemistry of Cx43 protein distribution in ovarian tissue of mice in each group（× 400）

4 討論

哺乳動(dòng)物的細(xì)胞間通訊有3種形式：（1）遠(yuǎn)程通訊，是以激素為信息傳遞者，細(xì)胞分泌物經(jīng)血液或淋巴遠(yuǎn)距離運(yùn)送到靶細(xì)胞；（2）短程通訊，即細(xì)胞間經(jīng)狹窄的間隙傳遞信息，如化學(xué)性突觸等；（3）直接通訊，GJ就是細(xì)胞間直接通訊的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，兩相鄰細(xì)胞胞膜上的蛋白顆粒彼此相連形成孔對孔的直接交通管道，細(xì)胞間可借GJ進(jìn)行某些小分子物質(zhì)的交換和離子交換[13]。哺乳動(dòng)物的卵泡由卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞及卵泡基膜構(gòu)成，顆粒細(xì)胞包圍著卵母細(xì)胞，基膜包被著顆粒細(xì)胞且是唯一與卵巢內(nèi)毛細(xì)血管接觸的結(jié)構(gòu)，同時(shí)卵丘細(xì)胞通過突出物與卵母細(xì)胞表面突起接觸，形成GJ，構(gòu)成顆粒細(xì)胞-顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞-顆粒細(xì)胞之間的通訊途徑，且均由GJ介導(dǎo)，對卵泡的生長發(fā)育及與卵巢內(nèi)外環(huán)境進(jìn)行信息傳遞起著重要的作用[14]。Cx作為GJ的基本結(jié)構(gòu)單位，其構(gòu)型的改變決定縫隙通道的開啟或關(guān)閉，又受到激素、鈣離子等因素的調(diào)控。其中Cx43是卵巢組織中表達(dá)最為豐富的Cx，主要表達(dá)于卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞中，隨著卵泡發(fā)育逐漸增多，對于顆粒細(xì)胞的增殖及分層、維持卵泡的正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用[15-16]。

化療藥物（如CTX等）在殺傷病變細(xì)胞的同時(shí)對正常組織和細(xì)胞也具有較強(qiáng)的毒副作用，卵巢對化療藥物尤為敏感，化療時(shí)可損害正常細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)錄及蛋白合成，最終引起卵巢過早萎縮老化[17]。Cx43影響卵泡發(fā)育的主要途徑有以下幾種[18-19]：（1）影響原始生殖細(xì)胞遷移及胚胎卵巢發(fā)育；（2）維持顆粒細(xì)胞正常增殖及分層；（3）抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡；（4）調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程；（5）調(diào)節(jié)卵巢重塑時(shí)期排卵、黃體形成、分化及退化過程；（6）調(diào)節(jié)激素或細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄、翻譯及表達(dá)過程。Cx43的缺失可導(dǎo)致卵泡發(fā)育、排卵及早期胚胎發(fā)育嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)而引發(fā)POF。

目前臨床上對于POF的治療多采取外源性雌激素替代療法、誘導(dǎo)排卵、免疫抑制劑及贈(zèng)卵治療等。戊酸雌二醇片為臨床常用的雌激素替代藥，主要用于卵巢早衰、更年期綜合征的治療，可改善卵巢功能衰退引發(fā)的性激素分泌失調(diào)、下丘腦-垂體-卵巢軸功能紊亂等癥狀[20-22]。但此類藥物長期應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生明顯副作用，不易為患者接受。中醫(yī)認(rèn)為，POF發(fā)生的根本原因是天癸耗竭、沖任虧虛，腎-天癸-沖任-胞宮軸功能衰退，可將其歸類為“閉經(jīng)”“年未老而經(jīng)水?dāng)唷薄鞍缀喜　钡确懂?，臨床多以補(bǔ)腎填精為治療原則。左歸丸為補(bǔ)腎填精代表方，常用于治療卵巢早衰、圍絕經(jīng)期綜合征及老年骨質(zhì)疏松等疾病，療效確切[7]。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，左歸丸可有效改善CTX致POF小鼠卵巢的儲(chǔ)備功能、顆粒細(xì)胞凋亡及卵巢組織中Cx37蛋白表達(dá)，促進(jìn)小鼠未成熟卵母細(xì)胞發(fā)育[11，23-24]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CTX主要破壞顆粒細(xì)胞間、卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞間GJ，表現(xiàn)為Cx43及mRNA表達(dá)量呈明顯下降趨勢，與卵泡閉鎖相關(guān)。而左歸丸可有效改善CTX導(dǎo)致的上述變化，增強(qiáng)顆粒細(xì)胞間、卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞間聯(lián)系，促進(jìn)卵泡的正常發(fā)育，這可能是其治療化療性POF的機(jī)制之一。

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Effect of Zuogui Pill on the Expression of Gap Junction Protein 43 in Ovarian Tissue of Mice with Chemotherapy-induced Premature Ovarian Failure

SUN Xiaofeng1，YANG Songwei2，HE Youshun1，CHEN Cong1，GONG Limin2，LUO Ling3（1.College of TCM，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2.College of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；3.Dept.of Orthopedics，the Third Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410013，China）

OBJECTIVE：To study the effect of Zuogui pill on the expression of gap junction protein 43（Cx43）in ovarian tissue of mice with premature ovarian failure（POF）induced by intraperitoneal injection of cyclophosphamide（CTX），and explore its mechanism in the treatment of chemotherapy-induced POF.METHODS：72 mice were randomly divided into blank group，model group，Estradiol valerate tablet group（positive control，0.000 13 g/kg），Zuogui pill low-dose，medium-dose，high-dose groups（13.65，40.95，122.85 g/kg）by body mass，10 in each group.Except for blank group，other groups were reduce POF model by ip CTX，once a day，for 20 d.Meanwhile，the mice were intragastrically administrated related medicines，once a day，for 30 d.After 2 h of last administration，reverse transcription-polymerase chain reaction method and Western blot method were used to detect the Cx43 mRNA and protein expressions in ovarian tissue respectively，and immunohistochemistry method was adopted to detect the distribution of Cx43 protein in ovarian tissue.RESULTS：Compared with blank group，Cx43 mRNA and protein expressions in ovarian tissue of mice in model group were obviously weakened，and the distribution of Cx43 protein in follicle and granulocytes were obviously reduced（P＜0.01）.Compared with model group，Cx43 mRNA and protein expressions in ovarian tissue of mice in Estradiol valerate tablet group and Zuogui pill medium-dose，high-dose groups were obviously strengthened，and the distribution of Cx43 protein in follicle and granulocytes were obviously increased（P＜0.01）.CONCLUSIONS：Zuogui pill can increase the Cx43 mRNA and protein expressions in ovarian tissue of CTX-induced POF mice，increase the distribution of Cx43 in follicle and granulocytes and gap junction function，which may be one of the treatment mechanism of POF.

Zuogui pill；Premature ovarian failure；Ovarian；Gap junction protein 43；Mice

R285

A

1001-0408（2017）22-3044-04

2016-12-09

2017-02-19）

（編輯：林 靜）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81303004）；湖南省科技廳資助項(xiàng)目（No.2009RS3018）；湖南省教育廳資助項(xiàng)目（No. 09C727）

＊副教授，博士。研究方向：中醫(yī)藥對女性生殖的影響。E-mail：2642724115@qq.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：骨質(zhì)疏松性骨折防治。E-mail：307068826@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.06