王招弟，吳好葉，嚴(yán)莉婭，姜玉瑤，牟滕慧，曾智勇＊，代振江

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

某豬場(chǎng)PCV2、PRRSV和附紅細(xì)胞體多重感染的診斷

王招弟，吳好葉，嚴(yán)莉婭，姜玉瑤，牟滕慧，曾智勇＊，代振江

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

2017年4月以來(lái)，貴州某豬場(chǎng)的保育豬陸續(xù)開(kāi)始發(fā)病，發(fā)病率約為30%，病死率約16%。據(jù)述該豬場(chǎng)發(fā)病豬主要癥狀為高燒（41 ℃以上）、氣喘和腹瀉等，將送檢發(fā)病豬解剖后發(fā)現(xiàn)其組織器官中淋巴結(jié)腫大、出血、腎臟有囊腫及黃染現(xiàn)象，白斑腎特征明顯，肺臟出血間質(zhì)性肺炎特征明顯，脾臟有瘀血梗死現(xiàn)象，其他臟器未見(jiàn)明顯眼觀病變。為了對(duì)其進(jìn)行確診，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)上述送檢病料進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，結(jié)果顯示該豬場(chǎng)發(fā)病豬存在豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和附紅細(xì)胞體的多重感染。

1 材料

1.1 病料

系分別采自2頭發(fā)病仔豬的組織病料（肝、腎、肺、淋巴結(jié)和脾臟等臟器）。

1.2 主要試劑

TaKaRa MiniBEST Viral RNA/ DNA Extraction Kit Ver.4.0、Prime-Script One Step PT-PCR Kit VER.2.0、DL2000皆購(gòu)自大連寶生物公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 病料的處理及核酸的提取

對(duì)送檢樣品進(jìn)行剖檢，如圖1所示。分別取適量剖檢病豬的肝、腎、肺臟、淋巴結(jié)和脾臟進(jìn)行碾磨勻漿，反復(fù)凍融3次后，12 000 r/min離心10 min，取上清，用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒進(jìn)行核酸的提取。

圖1 解剖病例觀察結(jié)果

2.2 附紅細(xì)胞體檢測(cè)

采集送檢2頭發(fā)病豬血液，分別涂片、處理后，于400倍鏡下觀察。

2.3 病原核酸檢測(cè)

分別用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的PCV2(上游引物：5’－TCGGAATT C A T G T C T A A C G G T T C T－3’，下游引物為：5’-ACGCTCGAGTTAGACTAAATGAAG－3’。)和PRRSV（上游引物：5′-CCCAAGCTTCCTTTTTATCACTTCGTAATGGTTTT-3′，下游引物：5′-GGTGGATCCACTCAGTAATTTATTTCATATGGA-3′）的特異性引物，以提取的核酸為模板，參照一步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)PCV2、PRRSV進(jìn)行核酸檢測(cè)，其反應(yīng)總體系為50μL：2×1 StepBuffer 25μL，模板7.0μL，上下游引物各1.0μL，Prime-Script 1 Step Enzyme Mix 2μL， RNase Free H2O 14μL；參照PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)PCV2和PRRSV進(jìn)行核酸檢測(cè)，其反應(yīng)總體系為50μL：ddH2O 10μL，2×GC BufferⅠ25μL，dNTP 8.0μL，上下游引物各2.0μL，模板2μL，Taq酶1μL。上述反應(yīng)程序均為：50 ℃ 40 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

3 病原檢測(cè)結(jié)果

3.1 附紅細(xì)胞體檢測(cè)

將送檢的兩份血液分別涂片、處理后，于400倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)a管血紅細(xì)胞表面及血漿中有游動(dòng)的各種形態(tài)的附紅小體，紅細(xì)胞呈星形或不規(guī)則的多邊形；b管血紅細(xì)胞正常，未見(jiàn)有附紅細(xì)胞體，如圖2。

3.2 組織樣品的病原檢測(cè)

根據(jù)檢測(cè)要求，提取混合組織中核酸，應(yīng)用一步法RT-PCR試劑盒，對(duì)PRRSV和PCV2進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，混合組織中PCV2和PRRSV呈陽(yáng)性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 送檢血液樣附紅細(xì)胞體檢測(cè)結(jié)果（400倍鏡下）

圖3 送檢樣本病原檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)果分析及建議

病原檢測(cè)結(jié)果表明，送檢病豬混合組織中PCV2和PRRSV均呈陽(yáng)性，其中一份血液樣品存在附紅細(xì)胞體感染。由于PRRSV、PCV2常常導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制從而繼發(fā)其他病原感染，影響生長(zhǎng)性能，且急性PRRS常引起豬群大規(guī)模死亡。通過(guò)臨床發(fā)病情況及組織病理特征可知，豬群系因免疫豬瘟疫苗引起應(yīng)激，進(jìn)而誘發(fā)豬藍(lán)耳病疫情，其中豬圓環(huán)病毒和豬藍(lán)耳病毒在免疫豬瘟疫苗前應(yīng)該已經(jīng)潛伏感染豬群，并使豬群處于多系統(tǒng)衰竭的亞臨床病癥；同時(shí)部分發(fā)病豬還誘發(fā)附紅細(xì)胞體感染，使本次疫情更加復(fù)雜。故建議結(jié)合豬場(chǎng)實(shí)際情況，加強(qiáng)PRRSV和PCV2的疫苗免疫及日常保健預(yù)防；對(duì)于豬附紅細(xì)胞體病，應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持豬舍、飼養(yǎng)用具衛(wèi)生，減少不良應(yīng)激等是防止該病發(fā)生的關(guān)鍵，夏秋季節(jié)要經(jīng)常噴灑殺蟲(chóng)藥物，防止昆蟲(chóng)叮咬豬群，切斷傳染源，在實(shí)施諸如預(yù)防注射、斷尾、打耳號(hào)、閹割等飼養(yǎng)管理程序時(shí)，均應(yīng)更換器械、嚴(yán)格消毒，購(gòu)入豬只亦可進(jìn)行血液檢查，防止引入病豬或隱性感染豬。

2017-05-24）

貴州大學(xué)SRT項(xiàng)目, 貴大SRT字(2015)093號(hào)

王招弟（1993—），女，在讀學(xué)士，研究方向：動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)。E-mail: 1458316517@qq.com

*通訊作者： 曾智勇（1978—），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)研究。E-mail:zyzeng@gzu.edu.cn