韓鵬黎，程曉丹，劉建華，劉新葉，池豪，曹巍，楊東偉

血清肝素結(jié)合表皮生長因子 mRNA水平與急性冠狀動脈綜合征的關系

韓鵬黎，程曉丹，劉建華，劉新葉，池豪，曹巍，楊東偉

目的：探討血清中肝素結(jié)合表皮生長因子（HB-EGF）信使核糖核酸（mRNA）水平與急性冠狀動脈（冠脈）綜合征的關系。

方法：采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測50例急性冠脈綜合征患者（ACS組）及100例正常對照組（NC組）血清中 HB-EGF mRNA的表達水平，運用Logistic回歸分析評估其與急性冠脈綜合征的關系。

結(jié)果：與NC組相比，ACS組患者的HB-EGF mRNA水平較高（0.22±0.73 vs 0.46±0.14，P＜0.05）。校正高血壓、吸煙、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、體重指數(shù)等單因素分析中有意義的因素后，HB-EGF mRNA水平與急性冠脈綜合征有關（比值比=5.813，95%可信區(qū)間：2.342～14.426，P＜0.001），即HB-EGF mRNA每增加0.1個灰度值，急性冠脈綜合征風險增加4.813倍。

結(jié)論：血清中HB-EGF mRNA水平升高與急性冠脈綜合征有關。

肝素結(jié)合表皮生長因子；RNA，信使；急性冠狀動脈綜合征

冠心病是一組因冠狀動脈（冠脈）粥樣硬化致使血管腔狹窄、阻塞或功能性改變?nèi)绻诿}痙攣導致心肌缺血、缺氧或壞死而引起的心臟病變，是嚴重危害人類健康的常見病，其病理改變在本質(zhì)上是動脈粥樣硬化。近10年來我國居民冠心病及急性心肌梗死死亡率呈快速上升趨勢。農(nóng)村上升更為明顯[1]。動脈粥樣硬化的發(fā)生是一個十分漫長的過程，是內(nèi)皮細胞功能紊亂和炎性反應的結(jié)果，但目前動脈粥樣硬化的發(fā)病機制尚未完全明確。急性冠脈綜合征（ACS）是冠心病中較嚴重的類型，是以冠脈粥樣硬化斑塊破裂或糜爛，繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎的一組臨床綜合征，易發(fā)生心力衰竭以及猝死等嚴重并發(fā)癥[2]。

近年來，國內(nèi)外相關研究顯示，肝素結(jié)合表皮生長因子（HB-EGF）作為一種內(nèi)皮細胞生長因子，具有廣泛的生物學活性。HB-EGF可以促進平滑肌細胞有絲分裂、增殖及遷移，促進血管內(nèi)膜增生以及血管重構(gòu)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血清HBEGF較高[4]；2010年劉紅旗等[5]發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊組織的平滑肌細胞和巨噬細胞中，HBEGF 表達顯著增高。因此，HB-EGF可能促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術(shù)分析ACS患者血清中HB-EGF 信使核糖核酸（mRNA）的表達情況，分析HB-EGF mRNA水平與ACS的關系，以期為ACS分子基因水平上的防治提供新思路和新途徑。

1 資料與方法

一般資料：從鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院2015～2016年的住院病例中選取入院診斷考慮ACS并通過冠脈造影（CAG）確診的50例患者作為ACS組，以同期經(jīng)冠脈造影排除冠心病診斷的100 例患者作為正常對照組（NC組）。所有入組病例均排除嚴重肝腎腦肺疾病、嚴重瓣膜性心臟病、心肌病、風濕性心臟病、肺原性心臟病、重癥感染、甲狀腺功能亢進癥、活動性結(jié)核、近1個月內(nèi)應用激素或免疫抑制劑、腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病或感染急性期、銀屑病、妊娠、近期皮膚及組織損傷等疾病。

試劑：血液RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒、2×Taq MasterMix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、100bp Ladder Marker 試劑盒（上述試劑均購自北京康為世紀生物公司）；PCR 引物及PCR反應體系mix由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

ACS診斷：ACS包括ST段抬高型心肌梗死和非ST段抬高型ACS， ACS患者診斷參照中華醫(yī)學會心血管病學分會2015年《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》[6,7]、2012年《非ST段抬高ACS診斷和治療指南》[8]中的診斷標準。

基本指標的測量：身高及體重測量：要求選用同一身高體重計測量，所有能站立的對象均于入院后第一個清晨在空腹狀態(tài)下，穿單衣單褲、赤腳，腳跟、骶骨部及兩肩胛間緊靠身高計立柱上；不能站立者采用賽康985型電子病床透析秤測量患者體重，于患者能夠站立時測量身高。所有數(shù)據(jù)均連續(xù)測兩次取其平均值，計算體重指數(shù)（BMI）。

血脂測定：所有患者均于入院后第一個清晨空腹采取外周靜脈血，測定其甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽膽固醇（LDL-C），所有標本使用德國羅氏全自動生化儀測定。

外周血提取 RNA：所有患者均采取外周動脈血（用檸檬酸鹽、 乙二胺四乙酸或肝素等抗凝劑處理過的血液樣品），所取標本按購買試劑盒說明書嚴格執(zhí)行 RNA 提取，提取過程中保持無菌原則，取 1 μl RNA 經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。并予紫外分光光度計準確定量，要求 OD260/OD280 處于1.8～2.2 之間。

RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA：提取 RNA 后立即行逆轉(zhuǎn)錄，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書嚴格執(zhí)行，所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱。

RT-PCR（表 1）：收集所有標本后進行 RT-PCR。PCR 總反應體系為20 μl，其中逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μl、Mix 10 μl、各基因上下游引物分別 1 μl、無核糖核酸酶水6 μl。PCR 儀型號：德國 biometra T-Gradient。HB-EGF擴增條件：94℃預變性5 min（94℃變性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸30 s）循環(huán)34次，72℃延伸7 min，4℃保存；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）擴增條件：94℃預變性5 min（94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s）循環(huán)34次，72℃延伸7 min，4℃保存。

PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析：配制1.5% 瓊脂糖凝膠，取 PCR 目的基因產(chǎn)物及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）各 3 μl點樣后進行電脈，設置恒壓為 90 V，約 30 min 后結(jié)束電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)（型號：美國 alpha3400）觀察結(jié)果，拍照后測定 DNA 擴增帶光密度值，取目的基因光密度值與相應GAPDH光密度值之比作為統(tǒng)計參數(shù)。

統(tǒng)計學方法：應用 SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料用±s表示，用Logistic回歸分析法評估HB-EGF mRNA水平與ACS的關系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應引物設計與合成

2 結(jié)果

2.1 ACS組和NC組患者的臨床資料比較（表2）

ACS 組和NC組患者的臨床資料比較，除年齡、性別組成、糖尿病外，高血壓、吸煙、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C、HB-EGF mRNA等指標在兩組間的差異均有統(tǒng)計學意義。

表2 ACS組與NC組患者的臨床資料（±s）

2.2 單因素Logistic回歸分析結(jié)果（表3）

以是否罹患ACS為應變量（1=是，0=否），將HB-EGF mRNA×10、年齡、性別、高血壓、糖尿病、吸煙、BMI、TC、TG、LDL-C、高血壓等因素作為自變量（性別：1=男，0=女；高血壓：1=是，2=否；糖尿?。?=是，2=否；吸煙：1=是，2=否），進行單因素Logistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HB-EGF mRNA水平與ACS有關[比值比（OR）=4.810，95%可信區(qū)間（CI）：3.080～7.514，P＜0.001]；PCR擴增條帶也提示，ACS組患者的HB-EGF mRNA水平高于NC組（圖1）。另外，單因素分析顯示，高血壓、吸煙、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C等因素均與ACS有關。

2.3 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

多因素回歸分析校正了高血壓、吸煙、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C等在單因素分析中有意義的指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HB-EGF mRNA×10仍然與是否罹患ACS有關（OR=5.813，95%CI：2.342～14.426，P＜0.001），即HB-EGF mRNA水平每增加0.1個灰度值，ACS風險增加4.813倍。

圖1 ACS組和NC組患者血清HB-EGF信使核糖核酸的表達情況

表3 單因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

HB-EGF 是表皮生長因子家族成員之一，是多種類型細胞有絲分裂原，亦涉及許多生理和病理過程，包括心臟發(fā)育及心肌修復、心肌肥大、皮膚傷口愈合、眼瞼形成、腎集合管生成、胚泡著床、肺動脈高壓、腫瘤形成等。HB-EGF 在動脈粥樣硬化、平滑肌細胞增生中有重要作用[9]。HB-EGF 與胞膜上表皮生長因子受體（EGFR）、硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）緊密結(jié)合，通過蛋白激酶 C 和 Ca2+等信號途徑發(fā)揮作用，促進平滑肌細胞、上皮細胞、系膜細胞、纖維細胞等多種細胞增生[10]。

Matsumoto等[4]發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊組織中，HB-EGF在血管平滑肌細胞和巨噬細胞的表達顯著提高，促進動脈硬化，而在非動脈粥樣硬化成人動脈中，內(nèi)膜平滑肌細胞 HB-EGF呈均勻分布，且隨著年齡的增加而緩慢增加。Reape等[11]在動脈粥樣硬化斑塊組織HB-EGF 的表達和定位的研究中發(fā)現(xiàn)，對比正常和動脈粥樣硬化的血管壁，HB-EGF mRNA 只在動脈粥樣硬化組織和用其培養(yǎng)的血管平滑肌細胞中表達，在巨噬細胞中高表達。兩項關于動脈粥樣硬化免疫組化的最新臨床研究均發(fā)現(xiàn)，HB-EGF在斑塊局部呈陽性表達，證實 HBEGF 能刺激平滑肌細胞細胞的增殖、遷移，從而在動脈粥樣硬化形成的過程中發(fā)揮作用[12,13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，血清中HB-EGF mRNA水平、高血壓、吸煙、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C等因素均與ACS有關，由于本研究旨在分析HB-EGF mRNA水平與ACS的關系，因此進行多因素Logistic回歸分析時校正了高血壓、吸煙、BMI、TG、TC、LDL-C、HDL-C等在單因素分析中有意義的指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HB-EGF mRNA水平仍然與ACS有關（OR=5.813，95%CI：2.342～14.426，P＜0.001），即HB-EGF mRNA每增加0.1個灰度值，ACS風險增加4.813倍。HB-EGF mRNA在ACS的發(fā)生和發(fā)展過程中可能作為一個獨立危險因子存在。本文的研究結(jié)果與上述多項研究結(jié)果相符。

綜上所述，血清中HB-EGF mRNA水平與ACS有關。

[1] 高潤霖. 冠心病疾病負擔—中國出路. 中國循環(huán)雜志, 2017, 32: 1-4.

[2] 黃兆章, 周希敏. 急性冠脈綜合征早期的識別和救治. 實用臨床醫(yī)藥雜志, 2007, 11: 82-84.

[3] 闞振, 袁爭百, 蘇振琪, 等. 血清HB-EGF對冠狀動脈支架內(nèi)再狹窄的影響. 中華全科醫(yī)學, 2012, 10: 398-399.

[4] Matsumoto S, Kishida K, Shimomura I, et al. Increased plasma HBEGF associated with obesity and coronary artery disease. Biochem Bioph Res Co, 2002, 292: 781-786.

[5] 劉紅旗, 談敏. 冠心病患者血清肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子及超敏 C 反應蛋白水平的臨床意義. 安徽醫(yī)科大學學報, 2010, 45: 248-251.

[6] 中華醫(yī)學會心血管病學分會, 中華心血管病雜志編輯委員會. 急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南. 中華心血病雜志, 2015, 43: 380-389.

[7] 饒辰飛, 鄭哲. 2015年《美國心臟協(xié)會冠狀動脈旁路移植術(shù)二級預防共識》解讀. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 936-940.

[8] 中華醫(yī)學會心血管病學分會, 中華心血管病雜志編輯委員會. 非ST段抬高急性冠狀動脈綜合征診斷和治療指南. 中華心血病雜志, 2012, 40: 353-364.

[9] Nakata A, Miyagawa J, Yamashita S, et al. Localization of heparinbinding epidermal growth factor-like growth factor in human coronary arteries. Possible roles of HB-EGF in the formation of coronary atherosclerosis. Circulation, 1996, 94: 2778-2786.

[10] Nishida M, Miyagawa J, Yamashita S, et al. Localization of CD9, an enhancer protein for proheparin-binding epidermal growth factor like growth factor, in human atherosclerotic plaques possible involvement of juxtacrine growth mechanism on smooth muscle cell proliferation. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20: 1236-1243.

[11] Reape TJ, Wilson VJ, Kanczler JM, et al. Detection and cellular localization of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor mRNA and protein in human atherosclerotic tissue. J Mol Cell Cardio, 1997, 29: 1639-1648.

[12] Scuderi R, Travali S, Castrogiovanni P, et al. Immunolocalization of HB-EGF in human atherosclerotic plaques. La Clinica Terapeutica, 2008, 160: 435-439.

[13] Castrogiovanni P, Scuderi R, Travali S, et al. Paracrine activity of heparin-binding EGF-like growth factor in atherogenesis: an immunohistochemical study. Minerva medica, 2013, 104: 85-91.

Relationship Between Serum mRNA Level of Heparin Binding Epidermal Growth Factor and Acute Coronary Syndrome Occurrence

HAN Peng-li, CHENG Xiao-dan, LIU Jian-hua, LIU Xin-ye, CHI Hao, CAO Wei, YANG Dong-wei.
Center of Translational Medicine, Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou (450007), Henan, China

YANG Dong-wei, Email: yangdongwei@126.com

Objective: To evaluate the relationship between serum mRNA level of heparin binding epidermal growth factor (HBEGF) and acute coronary syndrome (ACS) occurrence.

Methods: Our research included in 2 groups: ACS group, n=50 patients and Control group, n=100 normal subjects. Serum HB-EGF mRNA level was examined by RT-PCR and the relationship between HB-EGF mRNA and ACS occurrence was assessed by Logistic regression analysis.

Results: Compared with Control group, the serum HB-EGF mRNA level of ACS group was higher (0.22±0.73) vs (0.46±0.14), P＜0.05. With adjusted meaningful factors of hypertension, smoking, TG, TC, LDL-C, HDL-C and BMI by single factor analysis, multi Logistic regression analysis indicated that serum HB-EGF mRNA was related to ACS occurrence (OR=5.813, 95% CI 2.342-14.426, P＜0.001) which meant that upon 0.1 grey value of HB-EGF mRNA elevation, the risk of ACS occurrence may increase 4.813 folds accordingly.

Conclusion: Serum HB-EGF mRNA level was related to ACS occurrence.

Heparin binding epidermal growth factor; mRNA; Acute coronary syndrome (Chinese Circulation Journal, 2017,32:748.)

book=748,ebook=24

2016-12-04）

（編輯：朱柳媛）

河南省科技廳科技攻關項目（142102310460）

450007 河南省鄭州市，鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心（韓鵬黎、曹?。?，心血管內(nèi)科（程曉丹、劉建華、劉新葉、池豪、楊東偉）

韓鵬黎 藥師 碩士 主要研究方向為藥理學 Email：hanpengli2013@163.com 通訊作者：楊東偉 Email：yangdongwei@126.com

R54

A

1000-3614（2017）08-0748-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.08.005