翁 平， 張曉彤， 陳 煒， 田文芳， 陳俊良， 苑佳佳， 陳新杰， 龐慶豐△

(1江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫 214122； 2無(wú)錫市第三人民醫(yī)院急救中心， 江蘇 無(wú)錫 214041)

小窩蛋白1腳手架區(qū)多肽減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷*

翁 平1， 張曉彤1， 陳 煒2， 田文芳1， 陳俊良1， 苑佳佳1， 陳新杰1， 龐慶豐1△

(1江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫 214122；2無(wú)錫市第三人民醫(yī)院急救中心， 江蘇 無(wú)錫 214041)

目的： 探究人工合成的小窩蛋白1 (caveolin-1，Cav-1)腳手架區(qū)多肽cavtratin對(duì)血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)活性及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的作用。方法: 成年雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組，每組8～10只，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照(control)組、觸足肽內(nèi)化序列(Antennapedia internalization sequence，AP)組、LPS組、LPS+血晶素(hemin)組、LPS+hemin+cavtratin組和LPS+hemin+cavtratin+鋅原卟啉(zinc protoporphyrin IX，ZnPP)組。小鼠氣管滴注LPS 24 h后，蘇木素-伊紅染色觀察肺組織病理形態(tài)變化；檢測(cè)肺組織濕/干重比、肺泡灌洗液中細(xì)胞數(shù)和血清中乳酸脫氫酶活性。免疫熒光觀察HO-1和Cav-1的結(jié)合情況并檢測(cè)HO-1活性；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和iNOS)的mRNA水平。結(jié)果: 組織免疫熒光以及HO-1活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與LPS組比較，LPS+hemin+cavtratin組HO-1與細(xì)胞膜Cav-1的結(jié)合減少，HO-1的活性增高(P<0.05)； 與LPS組比較，LPS+hemin+cavtratin組肺組織受損程度明顯減輕，肺濕/干重比、肺泡灌洗液細(xì)胞數(shù)和血清中乳酸脫氫酶活性顯著降低(P<0.05)； 與LPS組比較，LPS+hemin+cavtratin組炎癥因子的mRNA表達(dá)降低(P<0.05)； HO-1活性抑制劑ZnPP可以消除cavtratin的保護(hù)作用。結(jié)論: Cavtratin可以通過(guò)減少HO-1與細(xì)胞膜Cav-1的結(jié)合使得HO-1活性增加，進(jìn)而減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。

小窩蛋白1; 血紅素加氧酶1; 急性肺損傷; 脂多糖

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜而且目前臨床上尚無(wú)有效的治療藥物。小窩蛋白1(caveolin-1，Cav-1)是細(xì)胞膜小窩的重要組成蛋白，其第82～101位氨基酸被稱為小窩蛋白1腳手架區(qū)(caveolin-1 scaffolding domain，CSD)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[1-2]。最近研究發(fā)現(xiàn)，CSD能夠與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制這些蛋白質(zhì)的生物活性[3-4]。血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)就是能夠被CSD結(jié)合且生物活性被抑制的典型蛋白質(zhì)[5-6]。HO-1是血紅素分解代謝的限速酶，催化血紅素分解產(chǎn)生的Fe2+、一氧化碳和膽綠素。HO-1、一氧化碳和膽綠素具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化及抗凋亡作用，對(duì)多種炎癥相關(guān)疾病具有抑制作用[7]。

本課題前期的研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞HO-1表達(dá)可以增加脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激的肺泡巨噬細(xì)胞精氨酸酶活性和吞噬能力[8]；但CSD對(duì)HO-1活性內(nèi)源性抑制的難題限制其對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI的保護(hù)效果。本研究擬采用CSD多肽cavtratin干擾HO-1與細(xì)胞膜Cav-1的結(jié)合, 增加HO-1活性，在此基礎(chǔ)上觀察cavtratin對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI的保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性BALB/c小鼠(體重19～23 g， 8～10周齡)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(滬)2012-0002。所有動(dòng)物至少適應(yīng)相應(yīng)的飼養(yǎng)環(huán)境1周。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照有關(guān)法律法規(guī)的指導(dǎo)方針進(jìn)行，并獲得江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 主要試劑

實(shí)驗(yàn)用cavtratin為全長(zhǎng)CSD(Cav-1第82～101位氨基酸序列為DGIWKASFTTFTVTKYWFYR)結(jié)構(gòu)，其C末端連有黑腹果蠅觸足肽內(nèi)化序列(Antennapedia internalization sequence，AP；RQIKIWFQNRRMKWKK；使其能進(jìn)入細(xì)胞中)，由強(qiáng)耀生物技術(shù)有限公司合成。LPS(血清型O111:B4)、血晶素(hemin)、鋅原卟啉(zinc protoporphyrin IX，ZnPP)以及HO-1活性檢測(cè)所用試劑均購(gòu)自Sigma；Cav-1兔單克隆抗體以及HO-1鼠多克隆抗體購(gòu)自Abcam；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔及山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自博士德生物有限公司；FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG以及TR標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Santa Cruz；本實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生工有限公司根據(jù)合成，具體引物序列見(jiàn)表1；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

3 主要方法

3.1 動(dòng)物模型及給藥處理 小鼠隨機(jī)分為6組，每組8～10只。正常對(duì)照(control)組，小鼠腹腔注射300 μL生理鹽水；AP組，腹腔注射4 mg/kg AP；LPS組，小鼠氣管滴注5 mg/kg LPS溶液；LPS+hemin組，小鼠腹腔注射50 μmol/kg hemin溶液，24 h后氣管滴注5 mg/kg LPS溶液；LPS+hemin+cavtratin組，小鼠腹腔注射50 μmol/kg hemin和4 mg/kg cavtratin[9]，24 h后氣管滴注5 mg/kg LPS溶液；LPS+hemin+cavtratin+ZnPP組，小鼠腹腔注射50 μmol/kg hemin和4 mg/kg cavtratin多肽，24 h后氣管滴注5 mg/kg LPS，氣管滴注前2 h腹腔注射50 μmol/kg ZnPP。

氣管滴注LPS 24 h后，麻醉動(dòng)物，眼球取血分離血清，收集右肺組織做生化檢測(cè)和濕/干重比的檢測(cè)，左肺組織用4%的多聚甲醛固定后做組織學(xué)分析；另外，每組3只小鼠進(jìn)行肺泡灌洗液分析。

3.2 肺組織病理學(xué)觀察 肺組織4 %多聚甲醛固定48 h后，經(jīng)過(guò)系列的脫水包埋等過(guò)程后將組織切為4 μm的切片，并且經(jīng)過(guò)蘇木素和伊紅染色后顯微鏡下觀察拍照。

3.3 肺濕/干重比檢測(cè) 分離小鼠肺組織后，肺組織稱濕重(wet weight)后置于60 ℃溫箱，72 h后至恒重后再記錄肺組織干重(dry weight)，計(jì)算濕/干重比(W/D)。

3.4 肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量的測(cè)定 對(duì)小鼠進(jìn)行肺泡灌洗，吸取20 μL肺泡灌洗液在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)細(xì)胞總數(shù)；收集小鼠血清，乳酸脫氫酶試劑盒檢測(cè)小鼠血清LDH的含量。

3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 稱取20 mg小鼠的肺組織，采用天根組織RNA提取試劑盒分離純化各組組織中的總RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算RNA純度及濃度。參照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。上樣采用TaKaRa SYBR Green熒光定量PCR試劑盒，反應(yīng)體積為20 μL，其中2× SYBR Premix Ex Taq Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。按照熒光定量反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書于LightCycler 480 PCR儀(Roche)內(nèi)實(shí)施PCR循環(huán)。采用GAPDH作為內(nèi)參照，結(jié)果分析采用2-ΔΔCt法，將control組作為1比較各組表達(dá)的變化倍數(shù)。

3.7 組織切片免疫熒光染色 將HO-1和Cav-1分別用特異性熒光素標(biāo)記使得綠色熒光標(biāo)記HO-1蛋白，紅色熒光標(biāo)記Cav-1蛋白，若兩者有結(jié)合那重疊后即顯示黃色熒光。主要步驟如下：石蠟切片通過(guò)梯度脫水后，抗原修復(fù)用pH為6.0的 0.1 mol/L檸檬酸溶液95 ℃水浴20 min，PBS 洗滌3次，每次5 min；5 %牛血清白蛋白室溫封閉30 min；擦去封閉液，孵育Cav-1和HO-1的抗體混合稀釋液，4 ℃過(guò)夜孵育；PBS洗滌后，孵育熒光 II 抗，室溫避光孵育1 h；洗滌后，封片液封片；熒光顯微鏡下觀察拍照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較選用SNK-q法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Cavtratin對(duì)肺形態(tài)學(xué)及生化指標(biāo)的影響

如圖1所示，control組及AP組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而LPS組小鼠肺部可以觀察到炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚，大量紅細(xì)胞滲出，肺泡斷裂，肺泡腔萎縮不張；LPS+hemin+cavtratin組肺組織損傷明顯減輕，LPS+hemin+cavtratin+ZnPP組出現(xiàn)嚴(yán)重的肺結(jié)構(gòu)破壞情況。LPS組與control組相比，W/D、灌洗液細(xì)胞數(shù)和血清LDH活性升高(P<0.05)；與LPS組相比，LPS+hemin+cavtratin組W/D和灌洗液細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)；與LPS+hemin+cavtratin組相比，LPS+hemin+cavtratin+ ZnPP組上述檢測(cè)指標(biāo)顯著增高(P<0.05)。

2 Cavtratin預(yù)處理對(duì)HO-1與Cav-1結(jié)合的影響

與control組比較，LPS和LPS+hemin組HO-1和肺組織Cav-1之間的結(jié)合增多；而與LPS+hemin組比較，LPS+hemin+cavtratin組HO-1和肺組織Cav-1之間的結(jié)合減少，見(jiàn)圖2。

3 Cavtratin預(yù)處理對(duì)HO-1活性的影響

如圖3所示，與LPS組和LPS+hemin組比較，LPS+hemin+cavtratin組HO-1的活性明顯增加(P<0.05)；而LPS+hemin+cavtratin+ZnPP組HO-1活性則降低(P<0.05)。該結(jié)果提示：cavtratin可以有效干擾HO-1與Cav-1之間的結(jié)合，從而增加HO-1活性。

Figure 1.The pathomorphology and biochemical indexes in the lung tissues， bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and the serum. A: hematoxylin and eosin-stained lung sections (scale bar=50 μm). B: the effect of cavtratin on LPS-induced pulmonary edema. Mean±SD.n= 5～7. C: the total cell numbers in BALF. Mean±SD.n=3. D: the levels of LDH activity in the serum. Mean±SD.n=8～10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;▲P<0.05vsLPS+hemin group;△P<0.05vsLPS+hemin+cavtratin group.

圖1 肺組織病理學(xué)以及肺損傷生化指標(biāo)變化情況

4 Cavtratin對(duì)肺組織促炎因子表達(dá)的影響

如圖4所示，與control組比較，LPS組肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和iNOS等炎癥因子的mRNA表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)；而與LPS組相比，LPS+hemin+cavtratin組上述炎癥因子的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與LPS+hemin+cavtratin組相比，LPS+hemin+cavtratin+ZnPP組肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1和iNOS等炎癥因子的mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05)。

討 論

HO-1活性被CSD內(nèi)源性抑制的問(wèn)題制約了其對(duì)ALI的保護(hù)效果。本研究觀察小窩蛋白-1腳手架區(qū)多肽cavtratin對(duì)HO-1的活性的影響及對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI的保護(hù)作用，獲得如下主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：cavtratin能夠減少HO-1與肺組織中Cav-1結(jié)合量，增加HO-1活性進(jìn)而降低炎癥因子的表達(dá)和肺W/D，減少肺泡灌洗液細(xì)胞數(shù)量，改善病理形態(tài)，有效保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI。

Cav-1廣泛存在于I型及II型肺泡上皮細(xì)胞、Clara 細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞中，其氨基酸序列的N端和C端都位于細(xì)胞質(zhì)中，肽鏈中間是由疏水性氨基酸(102～134)形成的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，為Cav-1跨膜區(qū)；N端第82～101位氨基酸殘基被稱之為CSD，其氨基酸序列為DGIWKASFTTFTVTKYWFYR。CSD可通過(guò)氫鍵、π-π鍵等非共價(jià)鍵形式、可逆性結(jié)合多種類型的蛋白質(zhì)，如酪氨酸激酶類膜受體及其下游靶分子、非受體類酪氨酸激酶、絲/蘇氨酸激酶類膜受體、G蛋白偶聯(lián)受體及下游信號(hào)分子、類固醇激素受體及內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶等。CSD結(jié)合這些靶蛋白并抑制其功能。

為解決Cav-1對(duì)結(jié)合的靶蛋白活性內(nèi)源性抑制的科學(xué)問(wèn)題，Xia等[11]利用丙氨酸替代的F92A-CSD多肽能與競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合內(nèi)皮型一氧化氮合酶，有效提高內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性。靜脈注射F92A Cav-1 CSD可使小鼠體內(nèi)內(nèi)皮型一氧化氮合酶與野生型Cav-1結(jié)合數(shù)量減少，一氧化氮合酶活性增高，一氧化氮含量增高，血壓下降[12]。本研究發(fā)現(xiàn)首次發(fā)現(xiàn)未突變的野生型CSD多肽可以有效地干擾Cav-1與HO-1之間的結(jié)合，進(jìn)而解除Cav-1對(duì)HO-1的活性抑制作用。主要依據(jù)是cavtratin可增加HO-1活性，抑制肺組織中多種促炎因子的表達(dá)，降低炎癥因子IL-1β、IL-6、 TNF-α、MCP-1及iNOS的表達(dá)，減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI。

Figure 2.Cavtratin decreased the interaction between HO-1 and Cav-1. The paraffin sections of the lung tissues were immunostained with anti-HO-1 (green) and anti-caveolin-1 (red) and observed under fluorescence microscopy. The merged images were also shown (right). The scale bar=20 μm.

圖2 Cavtratin對(duì)HO-1與Cav-1之間結(jié)合的影響

Figure 3.Cavtratin increased the HO-1 activity in the mouse lung tissues. HO-1 activity were determined in the protein extracts from the lung tissues. Mean±SD.n=5.#P<0.05vsLPS group;▲P<0.05vsLPS+hemin group;△P<0.05vsLPS+hemin+cavtratin group.

圖3 Cavtratin增加小鼠肺組織HO-1活性

促炎因子大量表達(dá)是各種感染性疾病導(dǎo)致的ALI的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[13]。有效抑制炎癥反應(yīng)可以明顯降低肺損傷的程度。研究表明HO-1及其代謝產(chǎn)物尤其是膽綠素具有較強(qiáng)的抗炎作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)cavtratin可以抑制肺組織中多種促炎因子的表達(dá)，這個(gè)研究結(jié)果提示cavtratin的肺保護(hù)作用與HO-1的抗炎作用有關(guān)，同時(shí)，本研究使用HO-1活性阻斷劑ZnPP能夠消除cavtratin對(duì)ALI的保護(hù)效果，也進(jìn)一步提示cavtratin的保護(hù)作用是HO-1依賴的。

Figure 4.The anti-inflammatory effect of cavtratin on LPS-induced ALI in the mice. Total RNA was extracted from mice lung tissues and reverse transcription was performed to generate cDNA for real-time PCR. The expression level in control group was normalized to 1. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;▲P<0.05vsLPS+hemin group;△P<0.05vsLPS+hemin+cavtratin group.

圖4 Cavtratin對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織促炎因子表達(dá)的影響

總之，本研究發(fā)現(xiàn)cavtratin可以通過(guò)影響HO-1與Cav-1的結(jié)合使得HO-1活性增加，進(jìn)而對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI產(chǎn)生保護(hù)作用。Cavtratin和血晶素聯(lián)合用藥有可能成為臨床治療LPS誘導(dǎo)的ALI的新方法。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of caveolin-1 scaffolding domain peptide on LPS-induced acute lung injury in mice

WENG Ping1, ZHANG Xiao-tong1, CHEN Wei2, TIAN Wen-fang1, CHEN Jun-liang1, YUAN Jia-jia1, CHEN Xin-jie1, PANG Qing-feng1

(1WuxiMedicalSchool,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China;2DepartmentofEmergency,TheThirdPeople’sHospitalofWuxiCity,Wuxi214041,China.E-mail:qfpang@jiangnan.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of caveolin-1 (Cav-1) scaffolding domain peptide， cavtratin, on lipopolysaccharide (LPS)-induced mouse acute lung injury and heme oxygenase-1 (HO-1) activity. METHODS: Adult male BALB/c mice were randomly divided into 6 groups (n=8 to 10)： control, Antennapedia internalization sequence (AP), LPS, LPS+hemin, LPS+ hemin+cavtratin and LPS+hemin+cavtratin+zinc protoporphyrin IX (ZnPP) groups. After LPS administration for 24 h, the lung pathological changes， the wet/dry weight (W/D) ratio of lung tissues, total cell number in bronchoalveolar lavage fluid and serum lactate dehydrogenase activity were measured. The co-localization of HO-1 and Cav-1 was displayed by immunofluorescence， and the HO-1 activity were detected. The mRNA expression of pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP-1 and iNOS was detected by real-time PCR. RESULTS: The mice in LPS+hemin+cavtratin group had the decreased interaction between HO-1 and Cav-1, and the increased HO-1 activity compare with LPS group (P<0.05). Compared with LPS group, the pulmonary damage was attenuated in LPS+hemin+cavtratin group， and the injury indexes， including W/D ratio, total cell number in bronchoalveolar lavage fluid and lactate dehydrogenase activity in the serum, and the mRNA expression of inflammatory cytokines all decreased (P<0.05). HO-1 activity inhibitor ZnPP abolished the above protective effect of cavtratin on the lung tissues with LPS-induced acute lung injury. CONCLUSION: Cavtratin has beneficial effects on the lung with LPS-induced acute injury by restoring the HO-1 activity.

Caveolin-1; Heme oxygenase-1; Acute lung injury; Lipopolysaccharide

1000- 4718(2017)08- 1475- 06

2016- 10- 25

2017- 03- 24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270126)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(No. JUSRP51412B)；江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程項(xiàng)目(No. KYZZ16_0312； No. KYLX15_1196)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No. 201610295074)；江蘇省醫(yī)學(xué)會(huì)/康緣藥業(yè)臨床醫(yī)學(xué)科研專項(xiàng)基金(No. 2015JZKY07)

R563; R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.021

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