江穎娟， 蔣作鋒， 吳小蘭， 黃 珮， 吳文法， 余慧文

(暨南大學醫(yī)學院附屬廣州紅十字會醫(yī)院全科醫(yī)學科， 廣東 廣州 510220)

西格列汀對AGEs作用下系膜細胞自噬的影響*

江穎娟， 蔣作鋒， 吳小蘭， 黃 珮， 吳文法， 余慧文△

(暨南大學醫(yī)學院附屬廣州紅十字會醫(yī)院全科醫(yī)學科， 廣東 廣州 510220)

目的： 探討西格列汀對晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)作用下系膜細胞細胞外基質(zhì)和自噬相關(guān)蛋白表達的影響。方法: 培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞，共分5組，分別為正常對照(control)組、AGE組和不同濃度(5 、10和20 μmol/L)西格列汀組。培養(yǎng)48 h后采用MTT法測定細胞活力，采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清膠原蛋白Ⅳ(collagen IV， Col IV)含量的變化。采用Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白beclin-1、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、 p-AMPK、p70S6K和p-p70S6K的蛋白水平。結(jié)果: 與control組比較，AGEs可明顯引起系膜細胞活力和Col IV表達增加，不同濃度的西格列汀均可明顯抑制AGEs誘導的系膜細胞活力和Col IV表達的增加；與control組比較，AGEs可引起系膜細胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1表達和AMPK磷酸化水平下降，p70S6K磷酸化水平增加；不同濃度的西格列汀均可促進系膜細胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1表達及AMPK磷酸化，抑制p70S6K磷酸化，并呈一定的濃度依賴性。結(jié)論: 西格列汀可能通過引起系膜細胞的自噬發(fā)揮腎臟保護作用。

西格列??； 自噬； 系膜細胞； 糖尿病腎?。?Beclin-1； 腺苷酸活化蛋白激酶

糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，其發(fā)病率逐年上升，是終末腎病的主要病因，已經(jīng)嚴重威脅人類健康，但目前尚無有效的治療方法，因此迫切需要對糖尿病腎病發(fā)病機制進行深入的研究，尋求新的治療糖尿病腎病的藥物。有研究表明，自噬在糖尿病腎病的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用[1]，因此自噬有望成為糖尿病腎病治療新的藥理作用靶點。

西格列汀(sitagliptin)是一種二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP-4)抑制劑，能夠迅速滅活腸促胰島素胰高血糖素樣肽1和糖依賴性胰島素釋放肽等多種激素，增強人體自身的控制血糖能力，是目前臨床治療2型糖尿病的常用藥物之一[2]。但研究發(fā)現(xiàn)西格列汀除了控制血糖等生理作用外，還可減少糖尿病大鼠腎臟的氧化應激及TNF-α、TGF-β的分泌，抑制結(jié)締組織生長因子的表達，減少尿蛋白的產(chǎn)生[3-4]。以上研究表明，西格列汀可能還對腎臟具有一定的保護作用，但具體機制尚不清楚。近期有研究表明DPP-4抑制劑可通過誘導細胞發(fā)生自噬而保護心肌的功能及減輕動脈粥樣硬化的程度[5-6]，但西格列汀是否通過自噬發(fā)揮腎臟保護作用，目前少見報道。因此，本研究以系膜細胞為模型，初步探討了西格列汀對晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)作用下大鼠系膜細胞細胞自噬相關(guān)指標的影響，為西格列汀臨床治療糖尿病腎病提供理論基礎(chǔ)及依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 試劑和儀器

西格列汀、DMSO、MTT和大鼠TNF-α購自Sigma-Aldrich；胎牛血清購自PPA；DMEM低糖培養(yǎng)基和青、鏈霉素溶液(100×)購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胰蛋白酶購自廣州威佳科技有限公司；PBS粉劑購自武漢博士德生物工程有限公司；MTT試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；IV型膠原(collagen Ⅳ，Col Ⅳ)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；抗beclin-1、p70S6K和p-p70S6K抗體購自Abcam；小鼠抗大鼠腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、p-AMPK、β-actin 單克隆抗體和羊抗小鼠 IgG購自凱基公司；ECL 顯色劑購自Pierce；細胞培養(yǎng)瓶、離心管和細胞培養(yǎng)板均購自Corning。3K15低溫離心機購自Sigma；TDL-50B低速臺式離心機購自上海安亭科學儀器廠。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) HBZY-1細胞購自上海艾研科技有限公司。將HBZY-1細胞接種于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 實驗分組 實驗分為以下5組：對照(control)組：普通DMEM(含糖5.6 mmol/L)完全培養(yǎng)基；AGEs(5%的牛血清白蛋白和0.5%葡萄糖一起溶解于0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中，過濾除菌后置于37 ℃的培養(yǎng)箱中8周，最后用透析方法析出AGEs，除菌后備用)處理組：采用0.25 g/L AGEs處理細胞，簡稱AGE組；藥物處理組：在加AGEs處理的系膜細胞中，分別用不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的西格列汀處理(簡稱AGE+S5組、AGE+S10組和AGE+S20組)。

2.3 MTT法檢測細胞活力 收集對數(shù)期細胞，置于96孔板，每孔5 000個細胞，37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)使細胞貼壁，培養(yǎng)6～24 h。采用無血清培養(yǎng)基同步化24 h，然后按照細胞分組加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸去上清，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸掉上清，每孔加入110 μL二甲基亞砜，振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值。每組設(shè)定6個復孔。

2.4 ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清Col IV的含量 從冰箱取出試劑盒，室溫復溫平衡30 min。配置標準品加標準品和待測樣本，37 ℃恒溫箱溫育120 min。棄去液體，洗滌液洗板4次。加入工作液100 μL，37 ℃恒溫箱溫育60 min。洗板5次。依序每孔加入底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應。用450 nm波長測量各孔的吸光值。

2.5 Western blot 檢測 beclin-1、AMPK、p-AMPK、p70S6K和p-p70S6K的蛋白水平 細胞加 200 μL預冷的 RIPA 裂解液(含50 mmol/L Tris， pH 7.5， 150 mmol/L NaCl， 1% NP-40， 0.1% SDS， 10 mmol/L EDTA， 1 mmol/L PMSF， 2 mg/L aprotinin, 2 mg/L leupeptin)，4 ℃ 12 000 r/min 離心 25 min， 吸取上層液體經(jīng)BCA 蛋白定量試劑盒測蛋白濃度。調(diào)整蛋白濃度后，取 150 μg 細胞總蛋白進行10%SDS-PAGE 分離，蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉 4 h， 加I 抗 4 ℃過夜， 加II 抗室溫孵育 1 h，TBST 清洗后用Odyssey 凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，所得結(jié)果以 β-actin 為內(nèi)參照。各組實驗至少重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計分析采用SPSS 16.0軟件。計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 西格列汀 對AGEs作用下大鼠系膜細胞活力的影響

培養(yǎng)48 h，AGE組系膜細胞活力明顯高于control組(P<0.01)。不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的西格列汀均可明顯抑制AGEs誘導的系膜細胞的活力(P<0.01)，并呈一定的濃度依賴性，見圖1。

Figure 1.The changes of the viability of the mesangial cells with different treatments. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L).

圖1 各組系膜細胞活力的比較

2 西格列汀對AGEs作用下系膜細胞培養(yǎng)上清液Col IV含量的影響

與control組比較，AGE組系膜細胞上清液中Col IV的含量明顯增加(P<0.01)，不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的西格列汀可明顯降低AGEs誘導下系膜細胞上清液中Col IV的含量，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The effects of sitagliptin (SIT) on the content of Col IV in the cell culture supernatant induced by AGEs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△P<0.05vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L);▲P<0.05vsAGE+SIT (10 μmol/L).

圖2 西格列汀對AGEs條件下系膜細胞分泌Col IV的影響

3 西格列汀對AGEs作用下大鼠系膜細胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1表達的影響

與對照組相比，AGEs可抑制系膜細胞beclin-1的表達(P<0.01)；與AGE組相比，不同濃度(5 μmol/L、10 μnmol/L和20 μmol/L)的西格列汀均可明顯促進AGEs條件下系膜細胞beclin-1的表達(P<0.01)，且隨著西格列汀濃度的增加，其促進系膜細胞beclin-1的表達作用增強，呈一定的濃度依賴性，見圖3。

Figure 3.The effects of sitagliptin (SIT) on the protein expression of beclin-1 in the mesangial cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L).

圖3 西格列汀對AGEs條件下大鼠系膜細胞beclin-1表達的影響

4 西格列汀對AGEs作用下大鼠系膜細胞TORC1活性的影響

p70S6K 是已知的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)的底物蛋白，其磷酸化水平反映mTORC1的活性。培養(yǎng)48 h，與對照組相比，AGEs可明顯促進系膜細胞p70S6K的磷酸化(P<0.01)，不同濃度(5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L)的西格列汀可明顯抑制AGEs作用下系膜細胞p70S6K的磷酸化(P<0.01)，且隨著西格列汀濃度的增加，其抑制p70S6K磷酸化的作用更加明顯，具有一定的濃度依賴性，見圖4。

5 西格列汀對AGEs作用下大鼠系膜細胞AMPK磷酸化的影響

與對照組相比，AGEs可明顯抑制系膜細胞AMPK的磷酸化(P<0.01)；與AGE組相比，不同濃度(5 μmol/L、10 μnmol/L和20 μmol/L)的西格列汀可明顯增加AGEs作用下系膜細胞AMPK的磷酸化(P<0.01)，且隨著西格列汀濃度的增加，其促進系膜細胞AMPK磷酸化的作用增加，呈一定的濃度依賴性，見圖5。

Figure 4.The effects of sitagliptin (SIT) on the expression of p-p70S6K in mesangial cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L).

圖4 西格列汀對AGEs條件下大鼠系膜細胞p70S6K磷酸化的影響

Figure 5.The effects of sitagliptin (SIT) on the protein level of p-AMPK in the mesangial cells induced by AGEs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsAGE;#P<0.05vsAGE+SIT (5 μmol/L).

圖5 西格列汀對AGEs條件下大鼠系膜細胞AMPK磷酸化的影響

討 論

自噬是胞漿大分子物質(zhì)和細胞器在膜包囊泡中降解的生物學過程，主要通過對受損細胞器和老化蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進行降解，為合成新的蛋白質(zhì)和更新細胞器提供所需的原料，維持蛋白代謝平衡及細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[7]。自噬異常能導致腫瘤、神經(jīng)退變、糖尿病等多種疾病的發(fā)生。糖尿病腎病進展過程的腎小球基底膜增厚、系膜及基質(zhì)增生聚集、蛋白尿等一系列病理過程與自噬關(guān)系密切[8]。研究表明抑制自噬可引起糖尿病腎病患者腎小球濾過率下降，增加TGF-β1和結(jié)締組織生長因子的表達[9]。此外，Munehiro等[10]研究發(fā)現(xiàn)，恢復了腎小管的自噬，可改善了糖尿病腎病腎臟的損傷。還有研究指出適度的自噬對糖尿病腎病具有保護作用，能夠抑制糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展[11]。因此，我們推測通過干預自噬可能可以達到保護腎臟、延緩腎臟疾病進展的目的。

Beclin-1是酵母自噬基因在哺乳細胞中的同源蛋白，參與自噬體的形成，其表達強度與自噬活性緊密相關(guān)[7]。本研究證實西格列汀能夠抑制AGEs作用下大鼠系膜細胞的活力以及細胞外基質(zhì)的分泌，初步證實了西格列汀可能具有一定的腎臟保護作用，這與以往的研究具有一致性。同時本研究還證實AGEs可明顯抑制系膜細胞beclin-1的表達，這一結(jié)果初步表明AGEs可能通過抑制細胞自噬引起糖尿病腎病的發(fā)生，而西格列汀可能通過誘導自噬的發(fā)生發(fā)揮腎臟保護作用。

mTORC1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與自噬小體的誘導及形成，負性調(diào)控細胞自噬。有研究指出，抑制mTORC1信號通路可以起到保護腎臟的作用，并減緩糖尿病腎病的發(fā)展[12-13]。AMPK是一種異源三聚體蛋白，由α、β和γ亞單位組成，對分解代謝起到關(guān)鍵的作用，是機體能量代謝平衡的總開關(guān)。有研究指出糖尿病腎病中激活AMPK不僅可以通過對mTORC1的抑制達到對自噬作用的調(diào)控，且可以通過對ULK1激酶調(diào)節(jié)beclin-1的表達實現(xiàn)對自噬的直接調(diào)控作用，減輕細胞外基質(zhì)的分泌和腎臟的纖維化[14-15]。因此推測AMPK對腎臟的保護作用可能是通過對自噬作用的激活實現(xiàn)的。本研究證實西格列汀可抑制AGEs條件下系膜細胞mTORC1底物蛋白p70S6K的磷酸化，顯示西格列汀可抑制AGEs條件下系膜細胞mTORC1的活性。此外，西格列汀還可促進AGEs條件下系膜細胞AMPK的磷酸化。由此可推測西格列汀可能通過促進AMPK的磷酸化及抑制mTORC1的活性進而上調(diào)自噬相關(guān)蛋白beclin-1表達，從而誘導細胞自噬的發(fā)生，發(fā)揮腎臟保護作用，但其具體機制仍需進一步研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of sitagliptin on autopaghy in mesangial cells induced by AGEs

JIANG Ying-juan, JIANG Zuo-feng, WU Xiao-lan, HUANG Pei, WU Weng-fa, Yu Hui-wen

(DepartmentofGeneralMedicine,GuangzhouRedCrossHospital,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510220,China.E-mail:yuhwgz@163.com)

AIM: To investigate the effect of sitagliptin on the autopaghy and the expression of extracellular matrix in mesangial cells induced by advanced glycation end products (AGEs). METHODS: The cells were divided into 5 groups: control group, AGE group, and sitagliptin (5, 10 and 20 μmol/L) groups. After 48 h, the cell viability was measured by MTT assay, and the content of collagen (Col) Ⅳ in the supernatant of the cell culture was detected by ELISA. The protein levels of beclin-1, adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)， p-AMPK， p70S6K and p-p70S6K were determined by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the viability and the expression of Col IV induced by AGEs in the cultured mesangial cells were significantly increased (P<0.01). Sitagliptin decreased the viability and the expression of Col IV induced by AGEs in the mesangial cells in a dose-dependent manner. AGEs significantly inhibited the protein levels of beclin-1 and p-AMPK, but significantly increased the protein level of p-p70S6K. Compared with AGE group, sitagliptin significantly reversed the above results in a dose-dependent manner. CONCLUSION: Autophagy may mediate the protective effect of sitagliptin on mesangial cells induced by AGEs.

Sitagliptin; Autophagy; Mesangial cells; Diabetic nephropathy; Beclin-1; Adenosine monophosphate-activated protein kinase

1000- 4718(2017)08- 1455- 05

2017- 01- 19

2017- 05- 17

廣州市衛(wèi)生和計劃生育科技一般引導項目(No. 20161A011020)

R363.2+1； R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.018

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