滕加文 梁學振 李梁

骨髓炎兔脛骨動物模型的建立與評價

滕加文 梁學振 李梁

目的 探討脛骨骨髓炎動物模型建立與評估。方法 30只普通級別成年新西蘭大白兔,按隨機數(shù)表法分為對照組與實驗組, 每組15只。實驗組麻醉成功后于右側脛骨髕下內側縱行切口, 顯露脛骨干骺端后, 注入5%魚肝油酸鈉0.3 ml, 靜置5 min后, 注入制備好的金黃色葡萄球菌菌液0.1 ml；對照組注入0.9%生理鹽水0.1 ml, 余操縱步驟同實驗組。14、28 d時分別觀察兩組大體情況、影像學、白細胞、細菌培養(yǎng)及組織學等動物模型制備情況。結果 共30只兔完成實驗, 實驗組14只兔成功建立骨髓炎模型, 成功率為93%。術后3 d兩組兔均萎靡不振, 食欲減退, 跛行；14 d后實驗組14只兔出現(xiàn)右小腿部紅腫, 皮膚隆起；均可擠出黃白色膿液, 細菌培養(yǎng)后均為金黃色葡萄球菌；28 d時實驗組10只兔全部出現(xiàn)竇道并可擠出黃白色膿液；對照組未發(fā)現(xiàn)明顯發(fā)熱、皮膚紅腫、膿液溢出等癥狀。實驗組術后7、14、28 d時體溫均高于對照組, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；實驗組術后14、28 d體重均低于對照組, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。術后14 d, X線提示實驗組14只兔均出現(xiàn)不同程度的骨密度降低, 皮質變薄, 溶解, 個別見死骨；術后28 d, 10只實驗兔均可見死骨、骨缺損及新骨形成, 程度較術后14 d時明顯加深。術后14、28 d時, 實驗組Norden骨髓炎評分均高于對照組, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。術后1、7、14、28 d實驗組白細胞計數(shù)均高于對照組, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。術后14 d時取實驗組竇道分泌物及髓腔內組織, 經細菌培養(yǎng)后14只兔為金黃色葡萄球菌, 術后28 d時培養(yǎng)均為金黃色葡萄球菌；對照組未培養(yǎng)出細菌。實驗組病理學結果為骨髓炎活動性改變。結論 運用金黃色葡萄球菌液直接注入骨髓腔的方法可以穩(wěn)定制成動物骨髓炎模型, 且在14 d時就基本符合骨髓炎診斷標準, 28 d時為穩(wěn)定狀態(tài)可開展進一步研究。

動物骨髓炎模型；金黃色葡萄球菌；Norden骨髓炎評分

骨髓炎是骨科臨床上較為常見的難治性疾病, 是一種伴隨著骨質破壞和進行性炎癥的感染狀態(tài)［1-3］。有報道顯示, 在開放性骨折后的3個月內, 發(fā)生嚴重感染的幾率高達27%［4,5］,建立良好的動物模型來篩選和優(yōu)化治療方案就顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 普通級別成年新西蘭大白兔30只, 性別不限, 體重2.0～2.5kg, 中位體重2.35kg, 由濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心單位提供, 實驗動物許可證號：SCXK(魯)20150001。 30只兔按隨機數(shù)表法分為對照組與實驗組, 每組15只。各組14 d后處死5只, 28 d后處死全部。

1.2 實驗藥物、試劑及儀器 本次實驗中用到的實驗藥物、試劑及儀器具體見表1。

表1 實驗藥物、試劑及儀器的生產廠家信息

1.3 造模方法 適應性飼養(yǎng)1周的新西蘭大白兔, 稱重后以水合氯醛(300mg/k g)腹腔麻醉, 待麻醉成功后, 固定于兔手術臺上。實驗組：于右側脛骨上端內側剪毛備皮, 碘伏溶液消毒, 行右脛骨髕下內側縱行切口, 長約1 c m, 分離軟組織后顯露脛骨干骺端, 用1mm克氏鉆頭鉆入髓腔, 從鉆孔處抽出0.5ml骨髓, 后注入5%魚肝油酸鈉0.3ml, 靜置5min后,注入制備好的金黃色葡萄球菌菌液0.1ml, 骨蠟封閉鉆孔, 以防止菌液溢出, 沖洗后逐層縫合。對照組：注入0.9%氯化鈉溶液0.1ml, 余操作步驟同實驗組。術后動物隔離分籠飼養(yǎng),患肢不制動, 標準進食, 不應用任何抗生素及其他藥物, 術后7 d內隔日用碘伏溶液消毒傷口。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據。計量資料以均數(shù)±標準差()表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

30只兔中1只麻醉過量死亡, 補齊后共30只兔完成實驗。14 d時實驗組共有14只兔制作骨髓炎模型成功, 成功率為93%。

2.1 大體觀察 術后3 d兩組兔均萎靡不振, 食欲減退, 跛行。14 d后實驗組14只兔出現(xiàn)右小腿部紅腫, 皮膚隆起；均可擠出黃白色膿液(圖1), 細菌培養(yǎng)后均為金黃色葡萄球菌；28 d時實驗組10只兔全部出現(xiàn)竇道并可擠出黃白色膿液(圖2)。對照組未發(fā)現(xiàn)明顯發(fā)熱、皮膚紅腫、膿液溢出等癥狀。兩組造模前體溫比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；兩組均在術后1 d體溫升高, 但組間對比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05), 考慮術后發(fā)熱；實驗組所有兔手術7 d時均不同程度發(fā)熱, 與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 術后14 d時實驗組兔體溫較術后7 d時降低, 但仍高于對照組, 組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；術后28 d實驗組兔體溫與術后14 d持平, 對比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05), 術后28 d實驗組兔體溫與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。兩組造模前體重比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；實驗組術后14 d體重明顯減輕, 術后28 d較術后14 d無明顯改變, 對照組體重無明顯改變；實驗組術后14、28 d體重均低于對照組, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3。

2.2 影像學觀察 術后14 d, X線提示實驗組14只兔均出現(xiàn)不同程度的骨密度降低, 皮質變薄, 溶解, 個別見死骨(圖3)。術后28 d, 10只實驗兔均可見死骨、骨缺損及新骨形成, 程度較術后14 d時明顯加深。術后14、28 d時, 實驗組N o r d e n骨髓炎評分均高于對照組, 差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；相較于術后14 d時, 實驗組術后28 d時骨髓炎程度加重, 死骨及骨質缺損明顯增加, N o r d e n骨髓炎評分明顯升高, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗中對照組持續(xù)表現(xiàn)為骨連續(xù)性好, 皮質光滑完整, 無死骨及骨缺損, 術后28 d與術后14 d N o r d e n骨髓炎評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表4。

2.3 血細胞觀察 兩組造模前白細胞計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；術后1、7 d, 實驗組15只兔較對照組均出現(xiàn)不同程度的白細胞計數(shù)升高, 組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；術后14 d實驗組較對照組白細胞計數(shù)升高, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 但相對于術后7 d降低, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。術后28 d, 實驗組白細胞計數(shù)較對照組升高, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 但與術后14 d時比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。對照組實驗周期內白細胞計數(shù)無明顯變動, 比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表5。

2.4 細菌學觀察 術后14 d時取實驗組竇道分泌物及髓腔內組織, 經細菌培養(yǎng)后14只兔為金黃色葡萄球菌, 術后28 d時培養(yǎng)均為金黃色葡萄球菌(圖4)。對照組未培養(yǎng)出細菌。

2.5 組織學觀察 光鏡病理切片顯示, 實驗組14 d時送檢標本自骨組織至骨髓內, 可見不同程度中性嗜酸性粒細胞呈彌散性浸潤, 髓腔內部分髓細胞廣泛性壞死, 分區(qū)域膿腫形成伴部分機化。病理診斷為創(chuàng)傷后骨髓炎活動性改變。28 d時送檢標本可見廣泛中性嗜酸性粒細胞呈彌散性浸潤, 髓腔內大部分髓細胞廣泛性壞死, 分區(qū)域膿腫形成伴機化。病理診斷同14 d時。對照組未見中性嗜酸性粒細胞浸潤, 髓腔內細胞正常, 未發(fā)現(xiàn)膿腫細胞。

表2 兩組體溫變化對比(, ℃)

表2 兩組體溫變化對比(, ℃)

注：與對照組對比,aP＜0.05

組別只數(shù)造模前術后1 d術后7 d術后14 d術后28 d實驗組1538.60±0.5939.02±1.3439.56±1.24a39.32±0.64a39.35±1.04a對照組1538.50±0.5638.91±1.3438.28±1.2238.46±0.4238.35±0.51 t 0.4760.2252.8504.3513.344 P >0.05>0.05<0.05<0.05<0.05

表3 兩組體重對比(, g)

表3 兩組體重對比(, g)

注：與對照組對比,aP＜0.05

組別只數(shù)造模前術后14 d術后28 d實驗組152300.000±303.7182007.000±198.944a1980.000±133.250a對照組152386.000±272.4992262.000±190.7762151.000±139.956 t 0.8163.5833.427 P >0.05<0.05<0.05

表4 兩組N o r d e n骨髓炎評分對比(, 分)

表4 兩組N o r d e n骨髓炎評分對比(, 分)

注：與本組術后14 d對比,aP＜0.05；與對照組對比,bP＜0.05

組別只數(shù)術后14 d術后28 dtP實驗組155.1500± 0.4743b6.4500±0.5503ab6.930<0.05對照組150.5000± 0.52700.5000± 0.45700.000>0.05 t 25.40132.215 P <0.05<0.05

表5 兩組白細胞計數(shù)對比(, ×109/L)

表5 兩組白細胞計數(shù)對比(, ×109/L)

注：與本組術后7 d對比,aP＜0.05；與對照組對比,bP＜0.05

組別只數(shù)造模前術后1 d術后7 d術后14 d術后28 d對照組152.80±0.732.92±0.782.82±0.652.89±0.493.04±0.77實驗組152.94±0.5314.24±0.74b12.04±0.73b8.53±0.73ab8.76±0.58bt 0.60140.77736.53324.84522.981 P >0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

圖1 14d后實驗組黃白色膿液照片

圖2 28d時實驗組大白兔黃白色膿液照片

圖3 術后14 d時實驗組X線片

圖4 術后28 d時實驗組細菌培養(yǎng)

3 討論

骨髓炎一直是醫(yī)療領域中一個亟待解決的問題, 其多為慢性骨髓炎, 特點是低度感染, 病菌長期存在, 死骨形成, 竇道存在, 病程往往遷延幾個月甚至幾年［6-9］。而對于創(chuàng)傷性骨髓炎的明確分類與治療始終困擾著臨床醫(yī)生［10,11］。因此,尋找到一個有效的方法徹底根治骨髓炎迫在眉睫, 而合適的骨髓炎動物模型的建立, 為進一步探索骨髓炎的治療方法,奠定良好的基礎［12］。

總之, 在骨髓炎實驗模型的建立中, 通過合適的方法及適當?shù)木N植入, 可以有效的建立動物模型。在術后14 d時實驗動物可基本達到骨髓炎的診斷標準。28 d時骨髓炎的癥狀表現(xiàn)會更加明顯, 實驗動物的狀態(tài)也基本穩(wěn)定。這為以后開展相關實驗研究提供了更為寬泛的選擇, 也為以后創(chuàng)傷性骨髓炎的分類診療提供參考。

［1］ 龍光橋.慢性骨髓炎診斷與治療.中國繼續(xù)醫(yī)學教育, 2016, 8(18):128-130.

［2］ 彭冰, 宋才淵, 金紅婷, 等.慢性骨髓炎的臨床診斷與治療.中國骨傷, 2015, 28(9):870-873.

［3］ 馮晨晨.慢性骨髓炎的診斷及治療方法進展.河北醫(yī)科大學, 2016.

［4］ 史永安, 杜全紅, 馬秉珺, 等.創(chuàng)傷性骨髓炎的分型及治療經驗.中國矯形外科雜志, 2016, 24(11):1048-1050.

［5］ 陳金水, 廖肇山, 林松慶, 等.兔股骨慢性骨髓炎模型的制作.中國組織工程研究, 2015, 19(49):7885-7889.

［6］ 褚立濤, 郭國棟, 劉剛, 等.兔脛骨創(chuàng)傷后骨髓炎動物模型的建立.醫(yī)學研究生學報, 2012, 25(11):1160-1162.

［7］ 呂豪, 劉書明, 楊華山, 等.慢性骨髓炎患者感染病原菌分布及藥物敏感性研究.中華醫(yī)院感染學雜志, 2016, 26(22):5179-5181.

［8］ 劉伯讓, 畢曉潔, 王勤, 等.慢性化膿性骨髓炎傷口分泌物細菌學特征與耐藥性分析.中華醫(yī)院感染學雜志, 2016, 26(2): 382-384.

［9］ 盧旻鵬.載銀納米抗菌復合骨填充材料治療兔脛骨慢性骨髓炎的實驗研究.重慶醫(yī)科大學, 2010.

［10］ 李亮亮.兔慢性骨髓炎模型的建立及效果評價.安徽醫(yī)藥, 2015, 19(12):2299-2301.

［11］ 楊國躍.載溶葡萄球菌酶羥基磷灰石/殼聚糖復合緩釋材料治療兔脛骨骨髓炎的實驗研究.天津醫(yī)科大學, 2012.

［12］ 袁承杰, 翁蔚宗, 周啟榮, 等.骨髓炎骨缺損動物模型構建研究進展.中華骨與關節(jié)外科雜志, 2016, 9(1):87-90.

Establishment and evaluation of rabbit tibial osteomyelitis model

TENG Jia-wen, LIANG Xue-zhen, LI Liang.Department of Micro Orthopedics, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, China

Objective To investigate the establishment and evaluation of tibial osteomyelitis animal model.Methods A total of 30 regular adult New Zealand white rabbits were divided by random number table method into control group and experimental group, with 15 rabbits in each group.In the experimental group, a longitudinal incision was performed on inside of the right tibial patella after successful anesthesia.After the tibial metaphysis was revealed, 5% sodium morrhuate 0.3 ml were injected, and 0.1 ml staphylococcus aureus liquid was injected after 5 min standing.In the control group, 0.9% physiological saline 0.1 ml was injected, and the other operating steps were was the same with the experimental group.Observation were made on general situation, imaging, white blood cells, bacterial culture and histology and other animal model preparations at 14 and 28 d in two groups.Results A total of 30 rabbits completed the experiment, and there were 14 rabbits in the experimental group with successfully established osteomyelitis model, with success rate as 93%.In postoperative3 d, malaise, loss of appetite and limping occurred in two groups.At 14 d, there were 14 rabbits in the experimental group with right lower leg redness and skin uplift.Yellow white pus could be extruded, and staphylococcus aureus was cultured after bacterial culture.At 28 d, sinus showed in 10 rabbits of the experimental group, and yellow white pus could be extruded.The control group showed no obvious fever, skin swelling and pus overflow symptoms.The experimental group had higher temperature in postoperative 7, 14 and 28 d than the control group, and the difference had statistical significance (P＜0.05).The experimental group had lower weight in postoperative 14 and 28 d than the control group, and the difference had statistical significance (P＜0.05).In postoperative 14 d, X-ray showed that there were 14 rabbits in experimental group with varying degrees of bone mineral density decline, cortical thinning, dissolution, and dead bones can be seen in some rabbit.In postoperative 28 d, the dead bone, bone defect and new bone were observed in 10 rabbits of the experimental group, and the degreeof bone formation was obviously worse than postoperative 14 d.In postoperative 14 and 28 d, the experimental group had higher Norden osteomyelitis score than the control group, and the difference had statistical significance (P＜0.05).In postoperative 1, 7, 14 and 28 d, the experimental group had higher white blood cell count than the control group, and the difference had statistical significance (P＜0.05).In postoperative 14 d, sinus secretions and medullary cavity tissue were collected for bacterial culture.There were 14 rabbits of the experimental group with staphylococcus aureus, and all rabbits with staphylococcus aureus in postoperative 28 d.No bacteria showed in the control group after culture.The pathological results of the experimental group were active changes in osteomyelitis.Conclusion The method of staphylococcus aureus injection into the bone marrow cavity is easy for stable preparation of animal osteomyelitis model.It is basically in line with the diagnostic criteria for osteomyelitis at 14 d, and the state is stable for further study at 28 d.

Animal osteomyelitis model; Staphylococcus aureus; Norden osteomyelitis score

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.16.114

2017-07-04］

250014 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院顯微骨科(滕加文)；山東中醫(yī)藥大學(梁學振 李梁)