張?chǎng)?郭志華 李京沛 黃偉哲

PD-1和PD-L1在原發(fā)性肺淋巴上皮瘤樣癌的表達(dá)情況和其臨床意義

張?chǎng)?郭志華 李京沛 黃偉哲

目的 檢測(cè)分析PC組織中PD-1和PD-L1的表達(dá)情況及其與原發(fā)性肺淋巴上皮瘤樣癌(LELC)患者臨床病理生理特征的相關(guān)性。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)21例原發(fā)性肺LELC石蠟包埋組織標(biāo)本中PD-1和PD-L1的蛋白表達(dá)情況, 對(duì)腫瘤組織腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞中PD-L1和PD-1的表達(dá)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。結(jié)果 21例患者中, 原發(fā)性肺LELC腫瘤細(xì)胞的PD-1、PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率分別為14%(3/21)和57%(12/21), 原發(fā)性肺LELC的腫瘤細(xì)胞PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于PD-1的陽(yáng)性表達(dá)率(P＜0.05)。原發(fā)性肺LELC腫瘤細(xì)胞周圍免疫細(xì)胞的PD-1、PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率分別為47.6%(10/21)和42.9%(9/21), 免疫細(xì)胞的PD-1、PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率均較高, 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。原發(fā)性肺LELC腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞周圍T細(xì)胞的PD-1、PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)在患者的不同性別、年齡、時(shí)期、TNM分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論 PD-L1在原發(fā)性肺LELC的腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞中有40%以上的陽(yáng)性表達(dá)率, PD-1在原發(fā)性肺LELC腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率較低, 但在免疫細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率＞40%。表明PD-1和PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)可能與原發(fā)性肺LELC的發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關(guān)性。

原發(fā)性肺淋巴上皮瘤樣癌； PD-1； PD-L1

原發(fā)性肺淋巴上皮瘤樣癌(lymphoepithelioma-like carcinoma, LELC)是臨床上較為少見的腫瘤, Begin等［1］首次報(bào)道該疾病, 有研究認(rèn)為原發(fā)性肺LELC好發(fā)于不吸煙的青年, 較其他組織學(xué)類型肺癌平均年齡小、預(yù)后好［2］, 但仍具有侵襲和轉(zhuǎn)移能力。它與EB病毒感染有一定關(guān)系, 具有人種和地理分布特點(diǎn), 該病在亞洲人群多見, 轉(zhuǎn)移率較低, 患者預(yù)后較好, 但該病較少見, 易漏診和誤診, 部分晚期患者, 臨床治療仍較困難。腫瘤的免疫治療是目前研究的主要熱點(diǎn)之一, T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)腫瘤免疫應(yīng)答的重要效應(yīng)細(xì)胞, 免疫檢查位點(diǎn)PD-1(programmed Death 1)與其配體PD-L1(programmed death ligand-1)可以負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷反應(yīng),介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸, 促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［3］。PD-1與PD-L1抗體可阻斷這一逃逸信號(hào), 調(diào)動(dòng)T細(xì)胞攻擊癌細(xì)胞。此外, 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的主要組成部分, 有研究表明［4］癌旁的單核巨噬細(xì)胞通過(guò)PD-L1 分子表達(dá)逃逸T細(xì)胞免疫, 目前, 針對(duì)PD-1與PD-L1的靶點(diǎn)抗體藥物, 已在多種惡性腫瘤的免疫治療中取得了良好的效果［5,6］, 是否在原發(fā)性肺LELC治療中獲益, 仍有待研究。本研究回顧性分析本院胸外科2016年6月～2017年6月施行1456例肺部手術(shù), 經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的21例原發(fā)性肺LELC, 占同期肺癌手術(shù)的1.4%(21/1456), 研究原發(fā)性肺LELC腫瘤組織中PD-1與PD-L1的表達(dá)情況和與患者的臨床病理生理特征的關(guān)系,為進(jìn)一步針對(duì)PD-1和PD-L1在原發(fā)性肺LELC的免疫治療提供理論依據(jù), 總結(jié)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年6月～2017年6月在廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科接受肺手術(shù)的患者1456例, 術(shù)后病理確診原發(fā)性肺LELC共21例, 患者術(shù)前均未接受化療。其中男9例, 女12例；年齡38～64歲, 平均年齡(51.30± 4.23)歲；2例有吸煙史, 19例無(wú)吸煙史；21例患者均接受了手術(shù)治療, 具有明確的病理診斷, 所有病例的標(biāo)本均做EB病毒(EBV)原位雜交檢測(cè), 結(jié)果均為EBER(+)；其中, 伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者肺門及縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例。按照WHO肺癌分型標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)(2009年)新國(guó)際肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型、分期；Ⅰ 期7例, Ⅱ期7例, Ⅲ期7 例。每例患者的病理檢測(cè)均經(jīng)本院2名病理科醫(yī)師會(huì)診確診, 組織標(biāo)本的應(yīng)用均通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者同意。

1.2 免疫組化 所有標(biāo)本采用10%的中性福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋, 4 μm厚連續(xù)切片。應(yīng)用原裝脫蠟液中經(jīng)過(guò)40 min脫洗進(jìn)行脫蠟處理, 經(jīng)無(wú)水酒精、95%酒精、85%酒精及70%酒精各10 min進(jìn)行水化, 在微波爐中使用相應(yīng)的抗原修復(fù)液進(jìn)行腫瘤組織的抗原修復(fù)30 min, 滴加抗體, 孵育, 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色, 蘇木精復(fù)染, 梯度酒精脫水干燥, 二甲苯透明, 中性樹膠封片。PD-1抗體是來(lái)自SIGMA公司的兔抗人單克隆抗體, 經(jīng)1∶50稀釋后使用。PD-L1檢測(cè)采用羅氏 VENTANA PD-L1 (SP142)分析試劑盒。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)PD-1和PD-L1以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒為陽(yáng)性顯色。PDL1表達(dá)采用半定量積分法,結(jié)合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比來(lái)評(píng)定陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.1 PD-1 陽(yáng)性結(jié)果判斷［7,8］以細(xì)胞計(jì)數(shù)法評(píng)估：低倍鏡下觀察整張切片, 尋找淋巴細(xì)胞密度較高處, 在其中隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(×400), 每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中PD-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù), 求其平均值作為PD-1 陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)。以所有病例PD-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的均數(shù)為閾值, 大于該閾值即為PD-1 陽(yáng)性表達(dá), 低于該閾值即為PD-1陰性表達(dá)。

1.3.2 PD-L1陽(yáng)性結(jié)果判斷 使用Roche(SIX：RO, ROG;OTCQX：RHHBY)診斷VENTAN APD-L1 (S P 142)分析試劑盒,按說(shuō)明書測(cè)定腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平。PD-L1狀態(tài)的確定具有指示特異性, 基于任何強(qiáng)度的P D-L1表達(dá)腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞占據(jù)的腫瘤面積的比例(%I C)或表達(dá)PD-L1的腫瘤細(xì)胞的百分比(%T C)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)或Fish精確檢驗(yàn)法, 分別計(jì)算PD-1和PD-L1陽(yáng)性患者的臨床特征及病理類型的關(guān)系。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1、PD-L1在腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞周圍T細(xì)胞的表達(dá) 21例患者中, 原發(fā)性肺LELC腫瘤細(xì)胞的PD-1、PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率分別為14%(3/21)和57%(12/21), 原發(fā)性肺LELC的腫瘤細(xì)胞PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于PD-1的陽(yáng)性表達(dá)率(P=0.001＜0.05)。原發(fā)性肺LELC腫瘤細(xì)胞周圍免疫細(xì)胞的PD-1、PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率分別為48%(10/21)和43%(9/21),免疫細(xì)胞的PD-1、PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率均較高, 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 原發(fā)性肺LELC腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞周圍T細(xì)胞的PD-1、PD-L1的陽(yáng)性表達(dá) 原發(fā)性肺LELC腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞周圍T細(xì)胞的PD-1、PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)在患者的不同性別、年齡、時(shí)期、TNM分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由于本組病例數(shù)不多, 不能分析出此類患者的PD-1和PD-L1的兩者陽(yáng)性表達(dá)與吸煙是否存在相關(guān)性。雖然肺LELC具有一定的侵襲和轉(zhuǎn)移能力, 但總體的惡性程度低, 本組病例入組時(shí)間較短, 不足以分析PD-1、PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)與患者預(yù)后是否有關(guān)。見表1。

表1 21例肺類癌患者臨床特征和PD-1、PD-L1在腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)情況［n(%)］

2.3 P63、CK5/6(+)、EBER檢測(cè) P63陽(yáng)性率為91%(19/21), CK5/6陽(yáng)性率為86%(18/21), EBER陽(yáng)性率為100%(21/21)。

3 討論

原發(fā)性肺LELC是發(fā)病率較低的惡性腫瘤, 文獻(xiàn)報(bào)道的病例較少, 約占全部肺癌的0.92%, 大多數(shù)來(lái)自廣東、香港和臺(tái)灣地區(qū), 本組病例占同期肺手術(shù)的1.4%(21/1456), 與文獻(xiàn)報(bào)道相似［9］, 與其他類型肺惡性腫瘤相比, 原發(fā)性肺LELC缺乏特異性的臨床表現(xiàn), 確診以病理診斷為主。有研究［10］認(rèn)為原發(fā)性肺LELC與EBV的感染有密切相關(guān)性, 其組織學(xué)特點(diǎn)與鼻咽癌的相似性, 其報(bào)道14例病例均來(lái)自廣東地區(qū), EBER檢測(cè)的陽(yáng)性率達(dá)93%, 本組21例患者的手術(shù)樣本均做EBER檢測(cè), 陽(yáng)性率100%, 與上述文獻(xiàn)相似。原發(fā)性肺LELC無(wú)性別偏好, 發(fā)病年齡輕, 中位年齡41～56歲［11］。本組患者男9例, 女12例, 中位年齡55歲, 其中年齡最小患者僅38歲,相關(guān)研究報(bào)道顯示被確診的肺LELC 患者中非吸煙患者達(dá)64%～80%, 本組患者中非吸煙19例, 吸煙2例［12］。病理組織學(xué)檢查、免疫組化染色以及EBER檢測(cè)是診斷原發(fā)性肺LELC的主要方法。高表達(dá)的CK5/6、P63等高表達(dá)提示肺LELC來(lái)源于上皮組織, 歸屬于鱗狀細(xì)胞癌范疇［13］。EBER高表提示了原發(fā)性肺LELC的發(fā)生可能與EB病毒感染有關(guān)［1］。本組病例均做P63、CK5/6(+)、EBER免疫組化檢測(cè), P63陽(yáng)性率為91%(19/21),CK5/6陽(yáng)性率為86%(18/21), EBER陽(yáng)性率為100%(21/21)。與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

由于原發(fā)性肺LELC 發(fā)病率較低, 對(duì)該病的治療方法多限于回顧性報(bào)道, 與其他非小細(xì)胞肺癌一樣, 手術(shù)仍是治療原發(fā)性肺LELC的主要方式, 對(duì)局部晚期的患者輔以化療和放療, 化療方案以GP方案運(yùn)用最多, 近年來(lái)也有學(xué)者［14］在探索靶向治療和免疫治療, 均需要進(jìn)一步的研究。目前, 腫瘤的免疫治療是研究的主要熱點(diǎn), PD-1/PD-L1單抗已在多種腫瘤包括黑色素瘤、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、霍奇金淋巴瘤等中顯示顯著的臨床療效［15］, PD-1或(和)PD-L1的表達(dá)能否作為使用PD-1或PD-L1的阻斷劑治療有效與否的主要標(biāo)記物, 但在許多的研究中PD-L1的表達(dá)仍被建議作為一個(gè)使用抗PD-1/PD-L1療法的標(biāo)記。由于PD-1抗體生產(chǎn)產(chǎn)家的不同, 免疫組化染色的半定量統(tǒng)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一和PD-陽(yáng)性臨界值公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的缺乏, 本研究采用大多數(shù)文獻(xiàn)所采用的方法進(jìn)行檢查, PD-L1表達(dá)的檢測(cè)方法則采用羅氏公司的VENTANA PD-L1 (SP142)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。最近的研究［16］發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中最多的免疫細(xì)胞。腫瘤發(fā)生初期這類細(xì)胞負(fù)責(zé)識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞, 但隨著腫瘤的發(fā)展, 這類免疫細(xì)胞又會(huì)助力癌變細(xì)胞的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移, 這一新發(fā)現(xiàn)將改進(jìn)并擴(kuò)大這一免疫療法的應(yīng)用, 因此對(duì)腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞的PD-1/PD-L1檢測(cè), 可為免疫治療選擇藥物提供參考。

目前, 原發(fā)性肺LELC腫瘤組織與腫瘤腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的PD-1/PD-L1表達(dá)及抗PD-1/PD-L1治療的研究報(bào)道甚少。在本組原發(fā)性肺LELC患者中, 原發(fā)性肺LELC腫瘤細(xì)胞的PD-1和PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為為14%(3/21)和57%(12/21)；腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞的PD-1和PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率分別為48%(10/21)和43%(9/21), 這提示原發(fā)性肺LELC腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞具有較高的PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率,均＞40%, 但腫瘤細(xì)胞的PD-1陽(yáng)性表達(dá)率較低, ＜20%；腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞的PD1陽(yáng)性表達(dá)率則＞40%, Tecentriq是第三個(gè)在PD-1/PD-L1這個(gè)節(jié)點(diǎn)阻斷這個(gè)免疫抑制信號(hào)通路的藥物, 是首個(gè)PD-L1抗體藥［17］, 這些患者能否在針對(duì)PD-1和PD-L1抗體的治療中獲益目前仍缺乏相應(yīng)的臨床研究, 仍需進(jìn)一步研究, 為PD-1/PD-L抗體藥物在原發(fā)性肺LELC的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

綜上所述, 原發(fā)性肺LELC 是少見肺部惡性腫瘤, 臨床表現(xiàn)無(wú)特異性, EBER 檢測(cè)結(jié)果對(duì)診斷可能有提示作用, 治療上仍以經(jīng)驗(yàn)為主, 原發(fā)性肺LELC腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞具有較高的PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率, 應(yīng)用PD-1/PD-L抗體的免疫治療也許可以使原發(fā)性肺LELC患者在治療中獲益, 但需進(jìn)一步的研究探討。

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2017-06-22］

510120 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科(張?chǎng)喂救A 李京沛)；汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院胸外科(黃偉哲)