何海洋 齊陸玉 侯伊玲

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）、結(jié)直腸癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌中經(jīng)常過(guò)表達(dá)或者突變，因而是阻斷此類癌細(xì)胞增殖生存的有效靶點(diǎn)。藥物通過(guò)與EGFR特異結(jié)合，減少腫瘤的血管生成與癌癥的發(fā)展，阻斷細(xì)胞周期以誘導(dǎo)凋亡[1]。在臨床中，EGFR活性通過(guò)酪氨酸激酶抑制劑（吉非替尼、埃羅替尼、拉帕替尼）或是特異抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗）阻斷。然而EGFR阻斷劑治療常伴隨劑量限制的持續(xù)性副反應(yīng)——皮膚炎癥（丘狀膿包性皮疹和瘙癢）及腸道炎癥[2]，引起這一副反應(yīng)的原因之一為EGFR不僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，也在正常上皮組織表達(dá)。最近有遺傳實(shí)驗(yàn)結(jié)果[3,4]表明，角質(zhì)細(xì)胞衍生的趨化因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致皮膚皮疹，因而提出一種可能性，即在藥物干預(yù)的情況下，功能性EGFR缺失，可以改變腫瘤免疫微環(huán)境。近段時(shí)間以來(lái)，免疫檢點(diǎn)（CTLA-4、PD-1/PD-L1）抑制劑用于癌癥治療試驗(yàn)證實(shí)特定的免疫環(huán)境是腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)或被消滅的決定因素之一[5]。為了模擬EGFR消失對(duì)鱗狀細(xì)胞肺癌腫瘤微環(huán)境的影響，我們使用基因及藥物手段在FVB/N免疫小鼠身上進(jìn)行了一系列試驗(yàn)。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HRAS（sc-520）購(gòu)于Santa Cruz；EGFR（06-847）購(gòu)于Millipore；ACK 緩沖液購(gòu)于Thermo Fisher；綠色或藍(lán)色活體染色劑購(gòu)于Life Technologies；Foxp3 Fix/Perm購(gòu)于ebiosciences；TRIzol試劑購(gòu)于Life Technologies；SuperScript? III反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于Life Technologies；流式抗體FoxP3-AF488、PD1-PE、CD25-AF700、CD45-PECF594、CD3-APC、CD4-PCPCy5.5、CD8-APCCy7購(gòu)于BD；抗蛋白酶購(gòu)于Roche；定制的磁珠組合購(gòu)于R&D luminex；iQ SYBR Green Supermix購(gòu)于Biorad；管過(guò)濾（352235）購(gòu)于BD；實(shí)驗(yàn)引物來(lái)自Quantitech Qiagen，流式細(xì)胞儀使用BD LSRII；實(shí)時(shí)定量PCR使用Bio-Rad iCycler iQ。

1.2 細(xì)胞修飾 通過(guò)腫瘤細(xì)胞自主（遺傳）和系統(tǒng)性（藥物干預(yù)）模型，給新生的小鼠移植以下修飾的角質(zhì)細(xì)胞以成瘤：通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒連續(xù)5 d轉(zhuǎn)染HRAS至EGFRwt/wt與EGFRflx/flx角質(zhì)細(xì)胞以形成具有持續(xù)HRAS活性的改造細(xì)胞[6,7]。HRAS感染的第3天，使用包含Cre重組酶的腺病毒二次感染角質(zhì)細(xì)胞，EGFRflx/flx角質(zhì)細(xì)胞的EGFR被切除而EGFRwt/wt型不受影響。

1.3 小鼠腫瘤模型建立 3.5×106轉(zhuǎn)化角質(zhì)細(xì)胞與5×106原代成纖維細(xì)胞（支持細(xì)胞）移植到同源小鼠背部。觀察腫瘤生長(zhǎng)1個(gè)月，每星期用卡尺測(cè)量腫瘤體積。對(duì)于藥理模型，在移植EGFRwt/wt轉(zhuǎn)化角質(zhì)細(xì)胞21 d后，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為兩組。一組接受溶解有吉非替尼的10%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）填胃法治療，吉非替尼給藥量為100 mg/kg；另一組每日10%的DMSO灌胃；連續(xù)處理1周。遺傳模型實(shí)驗(yàn)包含EGFRwt/wt（n=23）和EGFRflx/flx移植小鼠（n=19），進(jìn)行3組隨機(jī)平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。藥理模型重復(fù)兩次，實(shí)驗(yàn)小鼠總數(shù)為10% DMSO組（n=10），吉非替尼組（n=11）根據(jù)腫瘤的大小，至少收集300 mg樣本（部分腫瘤較小樣本合并2個(gè)/3個(gè)相同的遺傳組腫瘤，以獲得足夠的流式細(xì)胞儀分析的樣本）消化，部分進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析、部分用于總mRNA和蛋白萃取。有些實(shí)驗(yàn)組樣本不夠進(jìn)行上述所有分析，所以不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果中小鼠的樣本數(shù)存在差異。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 新鮮收集的腫瘤分割（或是根據(jù)腫瘤體積進(jìn)行合并）300 mg，切碎，于玻璃燒杯中使用膠原蛋白酶I消化（5 mL/腫瘤溶于2,000 U無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基）45 min，37oC，持續(xù)攪拌。樣本轉(zhuǎn)移至冰上，移液器自上而下添加10 mL含10%血清DMEM培養(yǎng)基。100目細(xì)胞濾器過(guò)濾，4oC 1,200 rmp離心5 min。3 mL ACK緩沖液重懸并置于冰上孵育5 min，20 mL完全DMEM培養(yǎng)基終止ACK裂解，70 μm過(guò)濾器過(guò)濾，4oC 1,200 rmp離心5 min。重懸并計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞濃度至1×106/mL。取1 mL樣本，2 mL低溫PBS清洗，離心，50 μL PBS重懸并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，加入1 mL綠色或藍(lán)色活體染色劑（事先1:100稀釋）染色，室溫孵育15 min；同型對(duì)照組同樣室溫孵育15 min。2 mL低溫PBS清洗，離心，50 mL PBS重懸，加入混合抗體（FoxP3-AF488, PD1-PE, CD25-AF700, CD45-PECF594, CD3-APC, CD4-PCPCy5.5, CD8-APCCy7），4oC孵育30 min。2 mL低溫PBS洗滌，離心，固定（2% PFA在冰上孵育20 min）。1 mL Foxp3 Fix/Perm室溫孵育15 min，然后用2 mL FoxP3 Perm沖洗，于含細(xì)胞核抗體FoxP3 Perm 50 μL緩沖液室溫孵育30 min。2 mL FoxP3 Perm沖洗，離心并重懸于PBS溶液，于BD管過(guò)濾過(guò)濾。

對(duì)于FoxP3，遺傳模型及藥理模型均只有一組流式實(shí)驗(yàn)讀數(shù)可信（細(xì)胞的最佳滲透），而PD-1染色數(shù)據(jù)各有3組有效。樣本于BD LSRII檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析均于FlowJo 9.8軟件進(jìn)行。

1.5 RNA提取與實(shí)時(shí)定量RT-PCR 總RNA提?。罕鶅瞿[瘤切塊于低溫Mikro-Dismembrator S中2,000 rmp 2 min，溶解于TRIzol試劑，具體操作詳見說(shuō)明書。cDNA合成：1 μg總RNA使用SuperScript? III反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄，PCR為20 μL體系iQ SYBR Green Supermix，cDNA 1:100稀釋。結(jié)果以平均相對(duì)量±SD表示。

1.6 腫瘤細(xì)胞裂解物分析 總細(xì)胞裂解物：提取RNA剩余腫瘤粉末于含抗蛋白酶、1 mmol/L正釩酸鈉、1 mmol/L氟化鈉的低溫RIPA緩沖液中裂解。腫瘤裂解物置于冰上旋渦孵育20 min，然后14,000 rpm離心15 min，上清液Bradford法測(cè)定總蛋白含量定量，10 μg蛋白裂解液使用定制的磁珠組合分析19種細(xì)胞因子和趨化因子（HGF,TNFA, IL-1B, IL-1A, IFNG, GCSF, MCSF, EPO, LIX, MDC,KC, MCP-1, RANTES, IL6, Lipocalin2, MIP1A, MIP1B, IGF1,Eotaxin），定量IL-1RA使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）測(cè)試。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Mann Whitney U檢驗(yàn)比較組數(shù)據(jù)之間的差異。P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 HARS轉(zhuǎn)染角質(zhì)細(xì)胞移植至免疫同源FVB/N小鼠背部成瘤情況 經(jīng)過(guò)處理的角質(zhì)細(xì)胞移植到同源小鼠背部以成瘤，觀察腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)，基因模型組（圖1A）腫瘤生長(zhǎng)持續(xù)受到抑制；藥理模型（圖1B）小鼠使用小分子靶向藥物吉非替尼經(jīng)過(guò)1周的治療，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于只喂食10%DMSO對(duì)照組腫瘤細(xì)胞體積較小（平均體積 726 mm3vs 1,340 mm3），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 基因組小鼠腫瘤酶消化懸液細(xì)胞分析 通過(guò)流式細(xì)胞儀分析酶消化基因組小鼠腫瘤獲得的細(xì)胞懸液，EGFRflx/flx相對(duì)于EGFRwt/wt組，CD4+細(xì)胞表達(dá)PD-1下降（圖2A），F(xiàn)oxP3陽(yáng)性CD4+細(xì)胞比例明顯降低（圖2B）。同源小鼠EGFRwt/wt型CD4+T表達(dá)PD-1高（圖2C），EGFRflx/flx型CD4+T表達(dá)PD-1較低（圖2D）。

2.3 藥理組小鼠腫瘤酶消化懸液細(xì)胞分析 通過(guò)流式細(xì)胞儀分析酶消化藥理模型組小鼠腫瘤獲得的細(xì)胞懸液，Gefitinib相對(duì)于DMSO組，F(xiàn)oxP3陽(yáng)性CD4+/CD25+細(xì)胞減少趨勢(shì)，CD4+細(xì)胞PD-1的表達(dá)未減少，同源小鼠Gefitinib組與DMSO組PD-1 陽(yáng)性CD4+T細(xì)胞比例相近（圖3）。

2.4 各組mRNA和炎性介質(zhì)蛋白表達(dá)情況 基因模型組實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4A-圖4D）和藥理模型組實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4E-圖4H），顯示基因模型組FoxP3 mRNA的表達(dá)量減少（圖4A）。在吉非替尼治療組，IL-1A蛋白水平和IL-1A相對(duì)IL-1RA比率明顯升高（圖4G，圖4H）。

3 討論

圖1 HARS轉(zhuǎn)染角質(zhì)細(xì)胞移植至免疫同源FVB/N小鼠背部成瘤。A：基因組EGFRflx/flx腫瘤生長(zhǎng)較野生基因型組EGFRwt/wt遲緩；B：藥理組連續(xù)1周系統(tǒng)性喂食吉非替尼小鼠體積較對(duì)照組較小。*P＜0.05。Fig1 Tumors originated from HRAS transformed FVB/N primary keratinocytes grafted on the back of immunocompetent syngeneic mice. A: EGFRflx/flx keratinocytes that formed the malignant squamous tumors are smaller formed from than the EGFRwt/wt; B: Pharmacological blockade of EGFR by systemic administration of gefitinib or 10% DMSO for 1 week, the former tumors are smaller. *P＜0.05.

圖2 基因組小鼠腫瘤酶消化懸液細(xì)胞分析。EGFRflx/flx相對(duì)于EGFRwt/wt組，PD-1陽(yáng)性CD4+ T細(xì)胞比例降低（A），F(xiàn)oxP3陽(yáng)性CD4+ T細(xì)胞比例也明顯下降（B）。EGFRwt/wt組樣本PD-1陽(yáng)性CD4+T為77.34%（C），同源EGFRflx/flx樣本PD-1陽(yáng)性CD4+ T為55.33%（D）。*P＜0.05。Fig 2 FACS analysis the tumor cell suspensions in the genetic model.EGFRflx/flx keratinocytes formed tumors vs the EGFRwt/wt, the proportion of PD-1 positive CD4+ T cells decreased (A), FoxP3 positive CD4+T cell ratio was also significantly decreased (B). A sample from EGFRwt/wt group, the PD-1 positive CD4+ T ratio was 77.34% (C),the ratio of EGFRflx/flx sample PD-1 positive CD4+ T was 55.33% (D).*P＜0.05.

圖3 藥理組小鼠腫瘤酶消化懸液細(xì)胞分析。Gefitinib相對(duì)于DMSO組，PD-1陽(yáng)性CD4+ T細(xì)胞比例差異不明顯（A），F(xiàn)oxP3陽(yáng)性CD4+/CD25+T細(xì)胞比例差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（B）。Gefitinib組樣本PD-1陽(yáng)性CD4+ T為73.44%（C），同源DMSO組樣本PD-1陽(yáng)性CD4+ T為73.76%（D）。*P＜0.05。Fig 3 FACS analysis the tumor cell suspensions about pharmacological blockade of EGFR. Systemic administration by gefitinib or 10%DMSO for 1 week, the proportion of PD-1 positive CD4+ T cells had no difference (A), so as the FoxP3 positive CD4+CD25+ T cell ratio (B).A sample from gefitinib group,the PD-1 positive CD4+ T ratio was 73.44% (C), the ratio of DMSO sample was 55.33% (D). *P＜0.05.

圖4 mRNA和炎性介質(zhì)蛋白表達(dá)情況。A、B：基因組mRNA表達(dá)；E、F：藥理組mRNA表達(dá)；C、D：基因組模型炎性介質(zhì)蛋白表達(dá)；G、H：藥理組模型炎性介質(zhì)蛋白表達(dá)。其中基因或藥理阻斷EGFR用數(shù)據(jù)用紅色表示，具有活性的EGFR組數(shù)據(jù)用藍(lán)色表示。*P＜0.05。Fig 4 Analysis about mRNA and inflammatory mediators expression. A and B for the genetic model while E and F for the pharmacologic model of mRNA analysis. C and D in the genetic model while G and H in the pharmacologic model of inflammatory mediators analysis. Genetic and pharmacological blockade of EGFR is indicated in red while active EGFR is indicated in blue. *P＜0.05.

為了探究肺鱗癌的自主免疫變化，我們將角質(zhì)細(xì)胞經(jīng)改造后移植到同源小鼠背部以形成腫瘤。在基因模型中，腫瘤生長(zhǎng)持續(xù)受到抑制，這是由于致癌基因RAS信號(hào)通路需要腫瘤上皮細(xì)胞表面EGFR的參與[8]。對(duì)于藥理模型，使用小分子靶向藥物吉非替尼，主要檢測(cè)系統(tǒng)性阻斷EGFR引發(fā)的直接后果對(duì)免疫微環(huán)境前期變化的影響。為了排除腫瘤細(xì)胞死亡或是壞死帶來(lái)的影響，我們只對(duì)系統(tǒng)性阻斷EGFR前期的相關(guān)變化進(jìn)行研究。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析酶消化腫瘤獲得的細(xì)胞懸液，發(fā)現(xiàn)基因模型組小鼠FoxP3陽(yáng)性CD4細(xì)胞比例明顯降低，F(xiàn)oxP3 mRNA含量減少，證實(shí)EGFR對(duì)于肺鱗癌免疫微環(huán)境具有調(diào)節(jié)作用。由于腫瘤的異質(zhì)性及吉非替尼治療時(shí)間短，藥理組模型很少觀察到顯著差異。經(jīng)過(guò)1周吉非替尼治療，F(xiàn)oxP3陽(yáng)性CD4+/CD25+細(xì)胞減少，F(xiàn)oxP3 mRNA的表達(dá)趨于減少，但PD-1的表達(dá)未減少。吉非替尼治療不僅影響表達(dá)EGFR的轉(zhuǎn)化角質(zhì)細(xì)胞，也將影響表達(dá)EGFR的基質(zhì)細(xì)胞。而EGFR配體雙調(diào)蛋白，增強(qiáng)Treg的抑制作用[9]。這表明通過(guò)腫瘤細(xì)胞自主性和系統(tǒng)性的途徑阻斷EGFR都將改變腫瘤微環(huán)境中Treg的活性，可能有助于免疫抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。在這兩個(gè)模型中，TGFB1 mRNA 、CTLA4 mRNA表達(dá)降低趨勢(shì)。吉非替尼組的IL-1A蛋白水平和IL-1A相對(duì)IL-1RA比率明顯升高。有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)[10]，IL-1A、IL-1R自分泌環(huán)是EGFR依賴的致癌基因RAS信號(hào)通路的關(guān)鍵之一。相反，免疫功能正常小鼠通過(guò)藥理阻斷EGFR活性，惡性腫瘤引起IL-1A蛋白水平的顯著提升。腫瘤細(xì)胞EGFR基因缺失未引起IL-1A的顯著提升表明IL-1A表達(dá)的升高是吉非替尼影響腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞產(chǎn)生的。我們期望Foxp3Treg降低以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但并不希望IL-1A升高，中和IL-1A成為治療慢性炎癥疾病和肺鱗癌的另一方向[11]。IL-1A的表達(dá)影響EGFR抑制劑發(fā)揮作用并與肺鱗癌患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)提示我們可以將抗EGFR與抗IL-1A治療聯(lián)合使用。我們的研究表明，系統(tǒng)性阻斷EGFR，使得Treg快速減少，而IL-1A/IL-1RA比例迅速上升，以快速改變腫瘤微環(huán)境。腫瘤細(xì)胞EGFR阻斷還有利于Treg的差異性浸潤(rùn)。

以上研究為進(jìn)一步探究EGFR阻斷劑所產(chǎn)生的免疫影響，特別是改變Treg數(shù)量與IL-1A水平，以改變腫瘤微環(huán)境提供依據(jù)。