王娜 鄒利 袁江 章紅妍 唐莉 王云甫 盧祖能

重癥肌無力外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞線粒體自噬異常的研究

王娜 鄒利 袁江 章紅妍 唐莉 王云甫 盧祖能

目的 探討線粒體自噬對重癥肌無力(myasthenia Gravis，MG)患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+regulatory T cell，Treg)功能的影響及關(guān)系。方法 選擇首次確診、尚未接受治療的15例MG患者，以15名健康人作為對照，分別采集外周血，以磁珠分選法獲得Treg細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定純度后，分別通過透射電鏡檢測Treg細(xì)胞線粒體自噬情況、Western Blot法檢測微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ)的表達(dá)水平、JC-10熒光探針檢測線粒體膜電位(以紅色熒光細(xì)胞數(shù)/綠色熒光細(xì)胞數(shù)比值表示)變化、羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE，CFSE)檢測Treg對正常CD4+T細(xì)胞增殖抑制能力(熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，增殖抑制能力越強(qiáng))。結(jié)果 與對照組比較， MG組電鏡下線粒體自噬明顯減少 〔(25.60±7.81)個(gè)、(19.20±5.49)個(gè)，t=-2.596,P<0.05〕，且變形線粒體較多；MG組LC3-Ⅱ表達(dá)明顯減少(0.450±0.137、0.334±0.124，t=-2.413,P<0.05)；MG組Treg細(xì)胞線粒體膜電位下降 (2.153±0.537，1.726±0.494，t=2.126,P<0.05)；MG組CFSE檢測平均熒光強(qiáng)度減弱(34.82±10.64、26.49±5.94，t=2.646,P<0.05)。結(jié)論 MG患者有Treg細(xì)胞的線粒體自噬功能降低，這可能與其增殖抑制功能降低相關(guān)。

重癥肌無力；線粒體自噬；Treg細(xì)胞

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是主要由乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體參與、主要累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜乙酰膽堿受體的獲得性自身免疫性疾病，常表現(xiàn)為部分或全身骨骼肌的病態(tài)疲勞。多項(xiàng)研究證實(shí)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)參與了MG的發(fā)病過程。Balandina等[1]的研究中發(fā)現(xiàn)雖然MG外周血中CD4+CD25+Treg的數(shù)量較健康人沒有明顯變化，但是其叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3) mRNA的表達(dá)及細(xì)胞抑制功能是下降的；另有研究表明MG患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T比值下降[2]，CD4+CD25+Foxp3+Treg的數(shù)量及Foxp3的蛋白表達(dá)也均有下降[3]；Xu等[4]的研究證實(shí)MG患者CD4+CD25+Treg的數(shù)量下降與功能低下是一致的。由于 CD4+CD25+Treg功能的缺陷，Treg抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞活化的功能減弱，結(jié)果導(dǎo)致自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞的異常激活，從而引發(fā)疾病的發(fā)生發(fā)展。

線粒體自噬(mitophagy)與免疫系統(tǒng)功能密不可分，其作用包括病原菌的識別和降解、抗原提呈、淋巴細(xì)胞的發(fā)育及效應(yīng)功能、炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)等[5]。在自噬相關(guān)蛋白7(Atg7)敲除的小鼠中，T淋巴細(xì)胞的線粒體清除發(fā)生障礙，從而使得細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生增加, 并且導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的功能障礙以及凋亡[6]。本研究擬通過觀察Treg細(xì)胞線粒體膜電位、線粒體自噬情況及對Treg細(xì)胞功能的影響等方面，來闡述線粒體自噬異常與MG患者Treg細(xì)胞功能損傷有關(guān)，探討線粒體自噬異常參與MG發(fā)生的機(jī)制。

1 對象和方法

1.1 觀察對象 選擇2015-01—2016-06在十堰市太和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的MG患者15例，男5例、女10例，年齡24.7～47.1歲，平均年齡為(35.9±11.2)歲，排除急性或慢性肝腎疾病、冠狀動脈綜合征、各種感染性疾病、心臟瓣膜病、惡性腫瘤、外周血管病、糖尿病、重大手術(shù)或嚴(yán)重外傷、嚴(yán)重感染的患者，患者均在入住就診前2周內(nèi)，未服用抗膽堿及糖皮質(zhì)激素類藥前進(jìn)行抽血。按Osserman分型其中Ⅰ型6例，ⅡA型4例，ⅡB型3例，Ⅲ型2例。同時(shí)選取性別和年齡匹配的健康志愿者15名(男6名、女9名)為對照組，年齡26.6～45.6歲，平均年齡(36.1±9.5)歲，近半年內(nèi)在本院進(jìn)行過健康體檢，常規(guī)體檢各項(xiàng)指標(biāo)均正常，未發(fā)現(xiàn)特殊疾病及相關(guān)病史、家族史者。本方案已通過醫(yī)院倫理委員會審查，并經(jīng)患者簽字知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 淋巴細(xì)胞分離液購于天津?yàn)笕A科生物科技有限公司；CD4+CD25+Treg細(xì)胞磁珠分選試劑盒、LD柱、MS柱購于德國Miltenyi Biotec公司，標(biāo)記抗體FITC-CD4、PE-CD25購于美國eBio-science公司，RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、青霉素及鏈霉素購于Gibco公司，JC-10探針購于武漢普蘭德生物技術(shù)有限公司(40707ES03)，CFDA-SE購于碧云天公司，CD3、CD28、白細(xì)胞介素2(IL-2)等購于R&D systems公司，兔抗人微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)、GAPDH購于CST公司。

1.3 方法

1.3.1 PBMC及CD4+CD25+Treg細(xì)胞分離：(1)PBMC：用20 mL無菌注射器吸入肝素鈣潤滑管壁后，采取20 mL外周血，在生物安全柜內(nèi)稀釋3倍，在2支無菌50 mL離心管中分別加入15 mL淋巴細(xì)胞分離液后，沿管壁緩慢加入30 mL被稀釋的外周血，2000 r/min離心20 min，取白膜層細(xì)胞，用PBS洗滌2次獲得PBMC。

(2)CD4+CD25+Treg(磁珠分選)及鑒定：將獲得的PBMC計(jì)數(shù)〔細(xì)胞量在(3～4)×107個(gè)/mL〕，以300 g×10 min離心去上清，用Buffer重懸后加入適量CD4+T細(xì)胞生物標(biāo)記的雞尾酒抗體，混勻后4℃避光孵育5 min，加入抗生物素標(biāo)記磁珠(包括生物素標(biāo)記的抗小鼠CD8、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCR以及血型糖蛋白A)，混勻4℃避光孵育10 min，LD柱分離出標(biāo)記CD4+T細(xì)胞群。懸浮所得細(xì)胞，加入抗CD25磁珠抗體，混勻，4℃避光孵育15 min后洗滌細(xì)胞，MS柱分離出CD4+CD25-T細(xì)胞〔細(xì)胞量在(5～7)×106個(gè)/mL〕和CD4+CD25+T〔細(xì)胞(2～5)×105個(gè)/mL〕細(xì)胞，收集部分獲得的細(xì)胞，分別孵育CD4-FITC、CD25-PE、CD4-FITC和CD25-PE抗體后通過流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25-T和CD4+CD25+T細(xì)胞的純度，CD4+T細(xì)胞純度為95%以上，CD4+CD25+T細(xì)胞純度為(90.2±2.6)%，與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致，可用于后續(xù)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.2 自噬的檢測：(1)透射電鏡檢測CD4+CD25+Treg細(xì)胞線粒體自噬：分別將MG和對照組所獲得CD4+CD25+Treg細(xì)胞用2.5%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛(用PH值7.4的0.1 mmol/L磷酸緩沖液稀釋)4℃固定2～4 h，以0.1 mmol/L磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min；1%的鋨酸(用pH值為7.4的0.1 mmol/L磷酸緩沖液稀釋)室溫(20℃)固定2 h；以0.1 mmol/L磷酸緩沖液(PH7.4)漂洗3次，每次15 min；50%-70%-80%-90%-95%-100%-100%酒精上行梯度脫水，每個(gè)濃度各15 min；812包埋劑滲透過夜；60℃聚合48 h；60～80 nm超薄切片；鈾鉛雙染色〔2% (體積分?jǐn)?shù))醋酸鈾飽和水溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min〕，切片室溫干燥過夜，電鏡下觀察，每組各5張切片，每張切片中隨機(jī)取5個(gè)細(xì)胞計(jì)算自噬體總數(shù)，后取每張切片自噬體總數(shù)的平均值。線粒體自噬早期形成的線粒體自噬體可以通過線粒體特有的雙層膜、嵴等特征辨別，而其與溶酶體融合后可通過單層膜或消化后的殘留物來大致識別[8]。(2)Western blot 檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)：分別將MG組及對照組Treg細(xì)胞收集后，裂解提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳約1.5 h；半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜約50 min，5%(質(zhì)量濃度)BSA常溫?fù)u床封閉0.5 h，與LC3抗體4℃孵育過夜；TBST洗膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫孵育1 h；ECL化學(xué)發(fā)光檢測蛋白信號，置凝膠成像儀中曝光。LC3-Ⅱ疏水極性較強(qiáng)，故電泳圖中上方條帶為LC3-Ⅰ、下方條帶為LC3-Ⅱ，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算LC3-Ⅱ/GAPDH的比值，作為LC3-Ⅱ相對表達(dá)量。

1.3.3 熒光顯微鏡檢測CD4+CD25+Treg細(xì)胞線粒體膜電位：分別將MG和對照組所獲得Treg細(xì)胞收集后以1000 r/min×8 min離心，去上清，0.5 mL RPMI1640培養(yǎng)液(不含血清)重懸，加入濃度為10 μg/mL JC-10線粒體膜電位熒光探針，37℃避光孵育20 min后離心，去上清，PBS洗滌2次后用培養(yǎng)液重懸后立刻進(jìn)行熒光顯微鏡檢測。JC-10主要以聚合體形式聚集在線粒體基質(zhì)中為主，膜電位下降時(shí)以單體形式存在比例升高，在熒光顯微鏡雙通道分別開啟時(shí)，鏡下分別顯示為紅光(聚合體)、綠光(單體)。故本實(shí)驗(yàn)中分別計(jì)數(shù)紅、綠熒光數(shù)，以紅光熒光數(shù)/綠光熒光數(shù)比值來評價(jià)膜電位變化情況， 即線粒體膜電位與紅細(xì)胞熒光/綠色熒光呈正相關(guān)。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+T細(xì)胞對CD4+CD25-T細(xì)胞增殖抑制能力：將分離得到對照組的CD4+CD25-T用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液1 mL重懸后，加入濃度5 uL/mL的CFSE溶液，37℃避光孵育10 min后加入1 mL FBS中止反應(yīng)10 min，PBS洗滌2次后用完全培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)液+10%FBS+青霉素、鏈霉素)重懸，同時(shí)加入CD3、CD28、IL-2等細(xì)胞因子刺激增殖，按細(xì)胞量CD4+CD25+T細(xì)胞∶CD4+CD25-T細(xì)胞=1∶1比例加入CD4+CD25+T細(xì)胞，共同培養(yǎng)4 d后，取出分別用PBS洗滌2遍后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測后，用FLOWJO軟件進(jìn)行再分析并測定對照組、MG組CFSE平均熒光強(qiáng)度。CD4+CD25+T細(xì)胞具有抑制CD4+CD25-T細(xì)胞增殖的功能，CFSE作為一種綠色熒光素，隨著細(xì)胞分裂增殖熒光強(qiáng)度平均分配至相應(yīng)的子代細(xì)胞，故細(xì)胞增殖越強(qiáng)熒光強(qiáng)度越弱，亦即熒光強(qiáng)度越弱CD4+CD25+T細(xì)胞抑制增殖能力越弱。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡下線粒體自噬情況 MG組線粒體自噬體較對照組減少(P<0.05，表1、圖1A)，鏡下可見MG組線粒體形態(tài)異常，相對不均一，線粒體嵴減少或消失，提示可能存在線粒體損傷(圖1B)。

表1 兩組各項(xiàng)觀察指標(biāo)比較(±s)

圖1 透射電鏡下兩組Treg細(xì)胞中自噬體情況比較：3000鏡下可見MG組中線粒體自噬體(箭頭所示)較正常對照組減少，胞質(zhì)內(nèi)含線粒體殘片的雙層膜結(jié)構(gòu)或已被溶酶體消化后有殘留碎片的單層膜結(jié)構(gòu)；8000倍鏡下，MG組可見異常線粒體(黑色箭頭所示，形態(tài)異常多變，線粒體嵴減少或消失)和正常線粒體(白色箭頭所示，形態(tài)均勻，可見線粒體嵴)，而對照組僅見正常線粒體

2.2 兩組LC3-Ⅱ表達(dá)水平比較 MG組LC3-Ⅱ/GAPDH的相對表達(dá)(0.334±0.124)較對照組(0.450±0.137)明顯減少(t=-2.413，P<0.05；表1、圖2)。

圖2 MG組和對照組LC3-Ⅱ表達(dá)比較(Western blot)

2.3 兩組線粒體相對膜電位比較 對照組線粒體膜電位正常，表現(xiàn)為以紅色熒光為主，少量的綠色熒光聚集在線粒體基質(zhì)中；MG組綠色熒光較對照組增加，相對紅色熒光減少(圖3)。MG組細(xì)胞線粒體相對膜電位(1.726±0.494)明顯低于對照組(2.153±0.537，t=2.126，P<0.05)。

圖3 兩組Treg細(xì)胞線粒體膜電位比較(JC-10法×200倍)：MG組膜電位低于對照組

2.4 兩組CD4+CD25+T細(xì)胞對CD4+CD25-T細(xì)胞增殖抑制能力比較 CFSE共培養(yǎng)后流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，MG患者平均熒光強(qiáng)度(26.49±5.94，圖4A)較對照組(34.82±10.64，圖4B)明顯下降(t=2.646，P<0.05)，即MG組CD4+CD25+T細(xì)胞(Treg)增殖抑制能力較對照組減弱。

圖4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測兩組CD4+CD25+T細(xì)胞 對CD4+CD25-T細(xì)胞增殖抑制能力比較

4 討論

線粒體自噬作為一種選擇性自噬方式，主要為了清除老化、過?；蚴軗p的線粒體，從而構(gòu)成一個(gè)“質(zhì)量檢查站”來阻止年齡相關(guān)的紊亂和衰老[9]，適時(shí)清除受損線粒體，以保持其數(shù)量和質(zhì)量的穩(wěn)定，對于細(xì)胞正常生長和代謝具有非常重要的意義[10-11]。越來越多證據(jù)證明線粒體損傷產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)是各類疾病發(fā)生的重要機(jī)制，當(dāng)線粒體自噬不能清除異常線粒體時(shí)，將引起ROS的堆積和線粒體毒性物質(zhì)等釋放從而引發(fā)細(xì)胞死亡。線粒體自噬同樣也參與T細(xì)胞發(fā)育、分化等各個(gè)階段[12]。Stephenson等[13]的研究中發(fā)現(xiàn)，在缺乏自噬相關(guān)蛋白5(Atg5)的外周血T細(xì)胞中線粒體量異常增加，提示自噬在線粒體的維持和T細(xì)胞存活中起了關(guān)鍵作用。保持正常的線粒體自噬功能，適時(shí)清除多余或受損的線粒體，維持正常的能量代謝，是維持T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和正常免疫功能的基礎(chǔ)。

線粒體自噬過程分4 個(gè)時(shí)期[14]:(1)前期線粒體受損后發(fā)生通透性轉(zhuǎn)變，線粒體去極化，誘導(dǎo)線粒體自噬相關(guān)蛋白活化；(2)早期自噬體包裹受損線粒體，形成線粒體自噬體(mitophagosomes)；(3)中期線粒體自噬體與溶酶體融合后形成成熟的線粒體自噬溶酶體(mitolysosomes)；(4)末期線粒體被溶酶體降解。而在哺乳動物細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí)，有兩條泛素樣蛋白系統(tǒng)參與自噬體的形成[15]，其中之一為LC3參與的修飾過程，是自噬體最終形成必不可少的因素[16]，主要有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，LC3-Ⅰ為自噬發(fā)生前LC3的形式，而LC3-Ⅱ是在自噬泡的環(huán)狀雙層膜結(jié)構(gòu)閉合后，被修飾加工完成并定位在自噬體膜上的，因此，LC3-Ⅱ含量與自噬發(fā)生的程度是成正比關(guān)系的。

線粒體因其DNA缺乏組蛋白的保護(hù)，且修復(fù)機(jī)制不健全而易受外源或自身代謝產(chǎn)生ROS的攻擊或因其他因素而發(fā)生損傷[17]，線粒體受損后發(fā)生膜通透性轉(zhuǎn)變(mitochondrial permeability transition，MPT)，氧化磷酸化解耦聯(lián)，ATP過度消耗引發(fā)細(xì)胞壞死，或者線粒體腫脹后細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)觸發(fā)凋亡[18]。而線粒體膜電位正是反應(yīng)線粒體內(nèi)膜完整性及通透性的指標(biāo)之一[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)，MG患者Treg細(xì)胞在電鏡下可見較多線粒體發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，但線粒體自噬的發(fā)生卻明顯減少，通過電鏡結(jié)果定性鑒定顯示，MG患者Treg細(xì)胞線粒體自噬發(fā)生了異常，不能及時(shí)將異常形態(tài)的線粒體清除，從而影響細(xì)胞功能；另一方面又通過Western Blot定量的方法進(jìn)一步驗(yàn)證MG患者Treg細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)降低，自噬水平明顯下降。而且，MG組Treg細(xì)胞線粒體膜電位較正常對照組明顯下降。上述結(jié)果均提示MG患者Treg細(xì)胞確實(shí)存在線粒體功能異常。

細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)功能發(fā)生異常，又不能通過線粒體自噬的方式將其清除掉，從而產(chǎn)生大量的ROS及線粒體毒性物質(zhì)，引發(fā)細(xì)胞功能障礙或死亡。既往研究表明MG患者存在Treg細(xì)胞增殖抑制功能下降[19-21]，但導(dǎo)致該細(xì)胞此功能異常的原因并不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過CFSE熒光染料的方法，發(fā)現(xiàn)MG患者Treg細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞的增殖抑制能力與對照組相比明顯下降，從而說明MG患者Treg細(xì)胞功能受損，增殖抑制能力下降，而Treg細(xì)胞功能的損傷極可能與線粒體自噬降低，不能將異常的線粒體及時(shí)清除，從而產(chǎn)生大量ROS及其他細(xì)胞毒性物質(zhì)，導(dǎo)致Treg細(xì)胞損傷有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步提示了Treg細(xì)胞功能障礙可能與線粒體自噬降低密切相關(guān)。

綜上，本研究對MG患者Treg細(xì)胞存在線粒體自噬降低的情況做了初步的鑒定。對Treg細(xì)胞內(nèi)代謝情況、線粒體自噬發(fā)生降低的分子機(jī)制、線粒體自噬降低是如何影響其功能等均有待進(jìn)一步的研究。

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(本文編輯：鄒晨雙)

The abnormal mitophagy of regulatory T cells in peripheral blood of patients with myasthenia gravis

WANGNa，ZOULi，YUANJiang，ZHANGHongyan，TANGLi，WANGYunfu*，LUZuneng#.

*Neurology,TaiheHospitalofHubeiUniversityofMedicine，ShiyanHubei442000，China；#Neurology,RenminHospitalofWuhanUniversity，WuhanHubei430000，China

WANG Yunfu, Emial:wyfymc@163.com；LU Zuneng, Email: 13995672166@126.com

Objective To explore the impact of mitophagy on the function of regulatory T cells (CD4+CD25+regulatory T cell, Treg) in peripheral blood of patients with myasthenia gravis (MG) and the relationship between them. Methods Treg cells were isolated from 15 patients with MG who had not been treated and 15 healthy persons as the normal control, Treg cells were isolated from human PBMCs by using the magnetic separation and were identified by flow cytometry. Mitophagy was detected by transmission electron microscope and the expression of microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)was measured by Western Blot, JC-10 fluorescent probe was used to detect the change of mitochondria transmembrane potential, the inhibition of Treg on the proliferation of normal CD4+T cells was detected by using flow cytometry and carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE, CFSE). Results Compared with the control group,less mitophagy occured in the MG group detected by transmission electron microscope(25.60±7.81,19.20±5.49，t=-2.596,P<0.05).The expression of LC3-Ⅱ was reduced (0.450±0.137,0.334±0.124，t=-2.413,P<0.05) in the MG group. The mitochondria transmembrane potential of Treg cells(the ration of red fluorescent cells to green fluorescent)was lower(2.153±0.537,1.726±0.494，t=2.126,P<0.05)in the MG group compared with the control group.The average fluorescence intensity of CFSE was lower in MG group(34.82±10.64,26.49±5.94，t=2.646,P<0.05) .Conclusions The mitophagy of Treg cells is reduced in MG patients. This may be related with the decreased proliferation inhibiting function of Treg.

myasthenia gravis;mitophagy;Treg cells

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.04.008

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81671238)

442000湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(王娜、鄒利、袁江、章紅妍、唐莉、王云甫)；430000 武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(盧祖能)

王云甫，Emial:wyfymc@163.com；盧祖能，Email: 13995672166@126.com

R746.1

A

1006-2963(2017)04-0270-06

2016-12-12)