余 淵，程 杰

（1.鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院內分泌科，湖北 黃石 435000；2. 黃石市愛康醫(yī)院骨科，湖北 黃石 435000）

玉米須總皂苷對非酒精性脂肪肝病大鼠肝臟PPARγ表達的影響

余 淵1，程 杰2*

（1.鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院內分泌科，湖北 黃石 435000；2. 黃石市愛康醫(yī)院骨科，湖北 黃石 435000）

目的 探討玉米須總皂苷 （ZMLS）對非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）大鼠的治療作用及其作用機理。方法 同一批次SD大鼠（60只）在適應性喂養(yǎng)10 d后隨機分為正常組，模型組以及玉米須總皂苷治療組（n=20），造模成功后，正常組和模型組給予1 g/（kg.d）生理鹽水灌胃，玉米須總皂苷治療組給予4 mg/（kg.d）灌胃治療，分別于治療4、8周后處死大鼠各半，檢測相關生化治療和肝臟中過氧化物酶體增殖物激活受體γ （PPARγ）表達。結果 與正常組相比，模型組AST、ALT、IL-1、IL-6、FBG、TG、FFA明顯升高（P＜0.05)，F(xiàn)INS明顯降低（P＜0.05），治療4周后AST、ALT、IL-1、IL-6、FBG、TG、FFA明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)INS明顯升高（P＜0.05）；治療8周后 AST、ALT、IL-1、IL-6、FBG、TG、FFA進一步降低（P＜0.05），F(xiàn)INS進一步升高（P＜0.05）；免疫組化、RT-PCR以及Western Blot可見模型組PPARγ表達明顯降低（P＜0.05），治療4周后有明顯升高（P＜0.05），治療8周進一步升高。結論 玉米須總皂苷對非酒精性脂肪肝病肝功能有明顯的調節(jié)作用，可能與其調節(jié)PPARγ表達，進而改善炎癥反應，降低血脂有關。

玉米須總皂苷；肝功能；游離脂肪酸；過氧化物酶增殖物活化受體γ；非酒精性脂肪肝病

非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）是一種以肝臟脂肪顆粒聚集為主要癥狀的一種代謝性疾病[1-2]。玉米須（Cornsilk）為玉蜀黍須、玉麥須，是玉米的花柱和花頭部分，性平、味甘，利尿消腫、抗炎消毒[3]。玉米須總皂苷是從玉米須提取的一類皂苷類化合物，對糖尿病具有很好的調節(jié)作用[4]。本研究采用高脂高糖飲食建立NAFLD大鼠模型，觀察玉米須總皂苷對NAFLD大鼠的治療作用，旨為NAFLD的治療提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD雄性大鼠60只，體質量180～220 g，所有大鼠均購于華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心，大鼠合格證號為：SCXK(鄂) 2010-0004。

1.1.2 高脂飼料組成 造模所用基礎飼料和高脂飼料、飼養(yǎng)用墊料均購于華中科技大學動物實驗中心?；A飼料配方成分為碳水化合物60%，蛋白質22%，粗纖維5. 6%，脂肪2.4%，其他10.0%；高糖，高脂飼料為基礎飼料66.5%，蔗糖10%，豬油20%，膽固醇3.4%，膽酸鈉0.1%。

1.1.3 試劑與藥品 玉米須總皂苷（ZMLS）由華中科技大學同濟醫(yī)學院提供(純度98%)；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、胰島素（Insulin）試劑盒、三酰甘油（TG）試劑盒、葡萄糖（Glucose）試劑盒以及游離脂肪酸(FFA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所，白介素-1（IL-1）以及白介素- 6（IL-6）試劑盒購于武漢波士頓生物有限公司；戊巴比妥鈉和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）多克隆抗體以及b-actin單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司、抗體稀釋液、二抗、DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，多聚甲醛購于上?；瘜W試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 大鼠適應性喂養(yǎng)10 d后，給予高脂高糖飲食8周，飲食配方為1.1.2中高脂飼料的構成，高糖則給予紅糖水自由飲用，紅糖水濃度為50 g/L，8周后每組各處死2只大鼠，檢測是否造模成功，判斷標準為肝功能明顯異常，同時肝臟HE染色有明顯的脂肪空泡。

1.2.2 分組及干預 所有大鼠隨機分為正常組、模型組、玉米須總皂苷治療組，每組20只，模型建立成功后玉米須總皂苷治療組給予玉米須總皂苷4 mg/（kg. d）灌胃治療，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃。

1.2.3 肝臟組織分離以及血液的收集 分別于治療4、8周后處死大鼠，收集血液檢測上述相關指標的變化，評價其治療效果。處死大鼠時為減少大鼠痛苦，采用戊巴比妥鈉30 mg/（kg. d）腹腔注射麻醉，麻醉后將其固定于解剖臺，沿腹中線切開腹腔，取出肝臟，將肝臟肝左葉取出置于4%的中性福爾馬林溶液中固定，其余置于超低溫冰箱中保存。

血液收集由我院專業(yè)醫(yī)生操作完成，用10 mL注射器沿大鼠心尖處取血，血液取出后立即分裝于1.5 mL的離心管中，之后4 000 r/min，離心15 min，取上清液根據試劑盒說明書測定上述相關生化指標的變化。

1.2.4 免疫組化 大鼠PPARγ的免疫組化檢測方法采用通用免疫組化方法，具體為將固定好的肝臟組織取出后，用冰凍切片機切取后在室溫中平衡10 min，之后丙酮固定10 min、 PBS緩沖液沖洗3次、0.3%的H2O2室溫浸泡10 min、沖洗3次，上述前期處理完成后即給予一抗孵育16 h，16 h后洗滌3次，滴加二抗，1 h后，PBS再洗滌3次，最后DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察即可。

1.2.5 RT-PCR法和Western blotting法檢測PPARγ基因和蛋白表達 RT-PCR法和Western blotting法具體操作參照文獻[5]進行，RT-PCR方法為半定量法，具體為，用總RNA提取試劑盒提取總RNA后，取2 μg進行逆轉錄，逆轉率完成后立即進行擴增，擴增條件為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；完成引物序列。擴增完成后，每組各取5 μL 進行瓊脂糖電泳，最后凝膠成像儀成相，Image J計算熒光強度值即可。每組實驗重復3次。

蛋白表達檢測采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，具體為提取總蛋白后定量，定量后電泳即可，電泳完成后采用班干轉一發(fā)轉移到PVDF膜，之后脫脂牛奶封閉、一抗孵育、二抗孵育、化學發(fā)光、曝光壓片即完成。最后采用Image J計算每組的熒光強度值，每組實驗重復3次。

1. 3 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計學采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肝功能的變化 見表1。

表1 各組大鼠AST及ALT表達變化（x±s，n=20） U/L

2.2 血糖和胰島素的變化 見表2。2.3 血脂水平的變化 見表3。

表2 各組大鼠FBG和FINS表達變化（x±s，n=20）

表3 治療后各組大鼠TG及FFA變化（x±s，n=20） mmol/L

2.4 大鼠炎性因子的變化 見表4。

2.5 免疫組化變化 免疫組化可見，正常組大鼠肝臟組織中PPARγ呈高表達狀態(tài)，同時可見細胞大小均一，結構光滑整潔；模型組相較于正常組PPARγ表達明顯減少，有明顯的脂肪空泡；玉米須總皂苷治療4周后其PPARγ表達有明顯升高，相較于模型組，脂肪空泡也明顯減少，治療8周后PPARγ表達進一步升高。

表4 各組大鼠TG及FFA變化（x±s，n=20） ng/L

2. 6 PPARγ蛋白表達比較 見表5。

表5 大鼠PPARγ蛋白相對表達量(x±s，n=10)

2. 7 PPARγ mRNA表達比較 見表6。

表6 大鼠PPARγ mRNA相對表達量(x±s，n=10)

3 小結

近年來，隨著分子生物學和細胞生物學的發(fā)展，進一步證實了玉米須不僅對降糖，同時對降脂特別是降低體內膽固醇具有很好的療效[6-15]。藥學研究[16]還發(fā)現(xiàn)，對于降脂，玉米須總皂苷和玉米須多糖都有一定的作用，而其中發(fā)揮主要作用的為玉米須總皂苷。本次研究采用玉米須總皂苷治療非酒精性脂肪肝病，治療4、8周后處死大鼠，結果顯示，玉米須總皂苷可明顯改善非酒精性脂肪肝病大鼠肝功能，降低大鼠血脂水平，此外，對改善大鼠炎癥反應也具有極佳的療效。

結果提示：玉米須總皂苷對非酒精性脂肪肝病肝功能有明顯的調節(jié)作用，這可能與其可調節(jié)PPARγ表達，進而調節(jié)炎癥反應，改善血脂有關。

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Effect of Saponin extracted from Zea Mays L (ZMLS) to PPARγ of liver in non alcohol fatty liver disease rats

YU Yuan1, CHENG Jie2*
( 1. Endocrinology Department, Huangshi Central Hospital, Huangshi 435000, Hubei Province, China; 2. Orthopaedics Department, Huangshi Aikang Hospital, Huangshi 435000, Hubei Province, China)

Objective To investigate whether Zea Mays L (ZMLS) has therapeutic effect and its mechanism of liver in non alcohol fatty liver disease (NAFLD) rats. Methods After feeding adaptation 10 d, the same batch SD rats (60) were randomly divided into normal group, model group and ZMLS treatment group (n=20), after successful built non-alcoholic fatty liver disease model, the normal group and model group were given 1 g/kg/d normal saline, ZMLS group was

4 mg/（kg.d）orally, after treatment 4 and 8 weeks, the rats were sacrifced and detected biochemical and liver PPARγ expression. Results Compared with normal group, the model group in AST, ALT, IL-1, IL-6, FBG, TG and FFA were increased significantly (P＜0.05), FINS was decreased significantly (P＜0.05), after 4 weeks of treatment, AST, ALT , IL-1, IL-6, FBG, TG and FFA were decreased (P＜0.05), FINS was increased signifcantly (P＜0.05); After 8 weeks of treatment, AST, ALT, IL-1, IL-6, FBG, TG and FFA were further reduced(P＜0.05), FINS was further increased (P＜0.05); immunohistochemistry, RT-PCR and Western Blot can seen the expression of PPARγ in model group was decreased significantly (P＜0.05), after 4 and 8 weeks of treatment was signifcantly higher the model group (P＜0.05), 8 weeks of treatment further increased. Conclusion To non-alcoholic fatty liver disease, ZMLS can signifcantly improve its liver function, which may be related to this drug can regulated the expression of PPARγ, thereby regulate the infammation, improve blood lipid related.

ZMLS; liver function; free fatty acids; PPARγ; non alcohol fatty liver disease

R285.5

A

2095-6258(2017)04-0530-04

2016-10-04）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.04.005

湖北省科技廳立項 黃石市愛康醫(yī)院自籌項目“玉米須總皂苷對非酒精性脂肪肝病的治療作用”（2015HS036）。

余 淵(1981-)，女，碩士研究生，主要從事中西醫(yī)結合治療內分泌疾病研究。

*通信作者：程 杰，男，博士，副主任醫(yī)師，電話-13477733066，電子信箱-hstttruike@126.com